基于線粒體功能特性研究健脾益氣攝血方調控ITP乏力機制

南凌杉 張雅月 王佳 丁曉慶 郭明 諶海燕 劉軍霞 李玲 陳信義 郎海燕

摘要 目的：驗證健脾益氣攝血方緩解ITP乏力癥狀與改善線粒體功能的相關性。方法：通過被動免疫造模法建立ITP小鼠模型，分為正常組、模型組、強的松組、健脾益氣攝血（JPYQSX）中、高劑量組。通過光譜法檢測小鼠脾臟組織活性氧含量;通過實時熒光定量PCR（qPCR）檢測線粒體DNA相對拷貝數;通過免疫熒光法檢測結腸ATP含量。結果：與正常組比較，模型組（P<0.01）、強的松組（P<0.05）、健脾益氣攝血各劑量組（P<0.01）小鼠脾臟組織ROS含量增多，脾臟組織線粒體DNA相對拷貝數明顯下調（P<0.01），結腸組織ATP含量明顯下調（P<0.01）;與模型組比較，強的松組、健脾益氣攝血各劑量組小鼠脾臟組織ROS含量減少，脾臟組織線粒體DNA相對拷貝數比較無統計學意義（P>0.05），結腸組織ATP含量均顯著升高（P<0.01）。結論：健脾益氣攝血方可通過改善線粒體功能來有效緩解ITP乏力癥狀。

關鍵詞 免疫性血小板減少癥;乏力;健脾益氣攝血;線粒體;線粒體功能;活性氧含量;線粒體DNA;ATP含量

Study on the Mechanism of Jianpi Yiqi Shexue Prescription on Regulating ITP Related Fatigue Based on Mitochondrial Functional Characteristics

NAN Lingshan1，ZHANG Yayue2，Wang Jia3，DING Xiaoqing1，GUO Ming1，CHEN Haiyan1，LIU Junxia1，LI Ling1，CHEN Xinyi2，LANG Haiyan1

（1 Dongfang Hospital，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100078，China; 2 Dongzhimen Hospital，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100700，China; 3 Henan University of Traditional Chinese Medicine，Zhengzhou 450003，China）

Abstract Objective：To verify the correlation of the Jianpi Yiqi Shexue Formula in relieving ITP related fatigue and improving mitochondrial function.Methods：ITP mice model was established by the passive immunization mode method and divided into a normal group，a model group，a prednisone group，a Jianpi Yiqi Shexue Formula of medium and high dose group.The reactive oxygen content in mouse spleen tissue was detected by spectroscopy; the relative copy number of mitochondrial DNA was detected by real-time fluorescent quantitative PCR （qPCR）; the ATP content in colon was detected by immunofluorescence.Results：Compared with the normal group，the content of ROS in spleen tissue of mice increased，the relative copy number of mitochondrial DNA in spleen tissue was significantly down-regulated （P<0.01），and the content of ATP in colon tissue was significantly down-regulated （P<0.01） in the model group （P<0.01），in the prednisone group （P<0.05），the Jianpi Yiqi Shexue Formula of each dose group （P<0.01）; compared with the model group，the content of ROS in spleen tissue of mice in the prednisone group （P<0.05），and the Jianpi Yiqi Shexue Formula of each dose group decreased，and the relative copy number of mitochondrial DNA in spleen tissue showed no statistical difference.Conclusion：Jianpi Yiqi Shexue Formula can effectively relieve ITP related fatigue by improving mitochondrial function.

Keywords Immune thrombocytopenia; Fatigue; Jianpi Yiqi Shexue; Mitochondrial; Mitochondrial function; ROS content; Mitochondrial DNA; ATP content

中圖分類號：R285.5;R558+.2文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.03.002

免疫性血小板減少癥（Immune Thrombocytopenia，ITP）患者乏力癥狀是該病治療中亟待解決的關鍵問題，且長期持續的乏力會嚴重影響ITP患者生命質量，甚至導致患者情緒低落而發生焦慮事件。但迄今為止，對于導致ITP患者乏力原因尚無明確認識和有效治療措施。

線粒體作為人體細胞的“能量制造廠”，為細胞進行各種生命活動提供能量支持[1-2]。線粒體作為調控細胞能量代謝、生物合成及細胞衰亡的重要細胞器，其功能異常在許多疾病和病理狀態的發生和發展過程中起著重要作用[3]。本研究通過被動免疫造模法建立ITP小鼠模型，以模型小鼠脾臟組織活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）含量、線粒體DNA（Mitochondrial DNA，mtDNA）相對拷貝數，以及結腸組織（重要免疫器官）ATP含量為觀察指標，試圖驗證健脾益氣攝血方提升緩解ITP小鼠乏力癥狀與改善線粒體功能的相關性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 SPF級BALB/c小鼠120只（編號：D12，體質量18～22 g，8周齡，雌雄各半），購于第四軍醫大學實驗動物中心，許可證號：SCXK（陜）2014-002，SPF級實驗室IVC鼠籠中飼養。豚鼠24只，體質量250 g，雌雄各半，購于興平市天瑞實驗動物養殖廠，許可證號：SCXK（陜）2012-001，普通環境飼養。動物實驗操作按中國動物保護協會指導方針進行，符合有關動物倫理學要求（倫理審批號：XYLS2019069）。

1.1.2 藥物 健脾益氣攝血方（黃芪、黨參、茯苓、白術、阿膠、茜草、炙甘草）由西安星華藥物研究所按照中藥新藥制備工藝標準制備并提供，中劑量濃度1 mL藥液含生藥1.17 g，高劑量濃度為中劑量濃度2倍;強的松（上海晶純生化科技股份有限公司，貨號：C16286550）。

1.1.3 試劑與儀器 冰凍切片活性氧（ROS）檢測試劑盒（北京百奧萊博科技有限公司，型號：HR7814）;ATP含量檢測試劑盒（碧云天生物技術研究所，型號：S0026）;BCA蛋白濃度測定試劑盒（碧云天生物技術研究所，型號：P0012）;蔗糖（Sigma公司，美國，批號：V900116）;O.C.T Tissue-Tek（SAKURA公司，美國，批號：4583）;酚，氯仿（Sigma公司，美國，批號：C2432）;異丙醇（國藥集團化學試劑有限公司，批號：I811925）;乙酸鈉（Sigma公司，美國，批號：S2889）;無水乙醇（天津市富宇精細化工有限公司，批號：0012036210）。全自動波長酶標儀（Bio-Tek公司，美國，型號：ELX800）;臺式高速勻漿機（POLYTRON公司，美國，型號：PT1600E）;賽默飛冰凍切片機（Thermo Fisher Scientific公司，美國，型號：NX50）;mini離心機（Eppendorf公司，美國，型號：5420）、小型高速冷凍離心機（Eppendorf公司，美國，型號：5910R），微量高速離心機（長沙湘儀公司，型號：H1650-W）;超純水系統（Millipore Synergy UV公司，德國，型號：IQ7003）;精密pH計（上海儀電科學儀器股份有限公司，型號：PHSJ-4A）;電熱恒溫水槽（上海一恒科技有限公司，型號：DK-8D）;4 ℃冰箱（海爾公司，型號：HYCD-205）;-80 ℃冰箱（Thermo Fisher Scientific，美國，型號：TLE40086）;制冰機（GRANT公司，美國，型號：XB70）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 取90只雌雄各半小鼠，尾靜脈斷尾取血，全自動動物血液分析儀檢測PLT計數后隨機分為5組，每組18只，分別為正常組、模型組、強的松組、健脾益氣攝血（JPYQSX）中、高劑量組。按照經典被動免疫造模法制備抗小鼠血小板血清。制備步驟如下：BALB/c小鼠麻醉取抗凝全血，梯度離心（1 100 r/min，10 min;3 000 r/min，10 min，離心半徑：6 cm）后得到血小板。血小板用PBS洗滌2次，重懸，調整濃度至2.5×106/mL，與等量完全福氏佐劑和不完全福氏佐劑混勻作抗原。其中，以含完全福氏佐劑抗原于0周注射于豚鼠足掌、背及皮下，共5點，合計1 mL;以含不完全福氏佐劑抗原分別于1、2、4周按上述相同部位與點數注射。第5周從豚鼠心臟取不抗凝全血，離心分離血清，即得豚鼠抗小鼠血小板血清（GP-APS）。56 ℃滅活補體，紅細胞吸附，最后用生理鹽水稀釋成1∶4濃度APS備用。然后進行模型制備，除正常組按100 μL/20 g每天注射生理鹽水外，其余各組均按100 μL/20 g劑量腹腔注射APS，1次/d，重復至實驗結束。

1.2.2 給藥方法 從注射APS（造模）第8天開始，給藥各組均按照0.1 mL/10 g體積藥物灌胃，正常組、模型組給予0.1 mL/10 g生理鹽水，1次/d。給藥8 d后處死小鼠，立即取同一部位大小約1 cm×1 cm×1 cm的臟器組織，將取出的臟器組織分為3份，一部分加入線粒體保護液后凍存于-80 ℃;一部分加入4%多聚甲醛固定液固定;另一部分直接-80 ℃凍存，待測。取脾臟和結腸組織用于此實驗。

1.2.3 檢測指標與方法 ROS含量檢測：用ddH2O將O13活性氧熒光探針100～200倍稀釋，配成染色工作液，將10×清洗液10倍稀釋配成1×清洗液工作液。組織取材后迅速放入4%PFA（多聚甲醛）固定液中混勻，放置4 ℃冰箱固定24～48 h，PBS洗滌后加入30%蔗糖溶液中放置4 ℃冰箱，待組織沉入管底則說明脫水完成。OCT冰凍包埋劑包埋，賽默飛冰凍切片機切片10 μm。使用新鮮組織制成冰凍切片，室溫中滴加200 μL清洗工作液，靜置3～5 min。吸除清洗液后滴加100 μL的染色工作液，置于濕盒中37 ℃培養箱避光孵育20～60 min。移除染色工作液，PBS洗滌后加蓋玻片后，立即熒光顯微鏡進行熒光定性分析（激發波長為535 nm，發射波長為610 nm）、拍照。使用ImageJ軟件進行定量分析。

線粒體DNA（mtDNA）相對拷貝數檢測：將剪碎的組織，按100∶1加入裂解液與ProteinK，56 ℃水浴8 h。加入等體積的酚：氯仿：異戊醇，劇烈震蕩后室溫靜置3 min。13 000 r/min 4 ℃離心10 min，離心半徑：6 cm，離心后上層含DNA水相。將上層水相轉移至1.5 mL EP管中，加入1/10體積乙酸鈉和預冷等體積無水乙醇，顛倒混勻，-20 ℃放置30 min。再次以上法離心后取得核酸沉淀。棄上清，將EP管倒置，加高壓水配置70%乙醇600 μL，13 000 r/min離心10 min，離心半徑：6 cm。棄去殘余乙醇，65 ℃干燥20～25 min。根據DNA的量不同加入不同體積的預熱高壓水溶解DNA，測DNA濃度。DNA樣品濃度調成50 ng/μL。將SYBR Green從-20 ℃取出，置于冰上避光溶解，目的基因和內參基因的正反引物均用ddH2O溶解為100 μmol/L，并稀釋成10 μmol/L的工作液。qPCR反應體系與反應引物詳見表1、表2。在qPCR專用96孔板中加入目的基因和內參基因體系，每孔18 μL，每孔加入樣品DNA2 μL。qPCR專用膜將96孔板密封，1 000 r/min 4 min水平離心機離心，離心半徑：6 cm。上機，設置qPCR程序：線粒體DNA拷貝數，第一步：95 ℃，10 s;第二步：95 ℃，5 s;58 ℃，30 s，循環40次。結果導出，通過2-△△Ct法計算線粒體DNA拷貝數，以ND1代表線粒體編碼的基因，GAPDH則代表核基因作為內參對照。

ATP含量檢測：按照每20 mg組織加入約100～200 μL裂解液的比例加入裂解液，后以高速勻漿機勻漿。將裂解后的樣品于4 ℃，12 000×g離心5 min。用ATP檢測裂解液稀釋ATP標準溶液，設置濃度梯度為0.01、0.03、0.1、0.3、1、3和10 μmol/L。以ATP檢測試劑：ATP檢測試劑稀釋液=1∶9稀釋制成ATP檢測工作液，每個樣品對應100 μL的ATP檢測工作液（100 μL）加入檢測孔，室溫下放置3～5 min消耗本底。檢測孔中加入20 μL樣品，迅速混勻，間隔3 s，使用化學發光儀測定樣品的RLU值（Relative Light Unit，RLU），依據設置的標準曲線計算樣品的ATP濃度。

1.3 統計學方法

采用SPSS 23.0統計軟件進行數據分析，其中計數資料以（%）表示，采用χ2檢驗，計量資料以（±s）表示，采用t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

脾臟組織活性氧（ROS）含量變化：O13是一種具有細胞膜通透性的熒光探針，可以被小鼠脾臟組織中的ROS特異性地氧化生成紅色熒光物質。紅色熒光的強度與ROS水平成正比，通過使用熒光顯微鏡測試紅色熒光可以判斷脾臟組織內ROS表達水平。小鼠脾臟組織ROS含量變化見圖1。

如圖1F所示，正常組小鼠脾臟組織中熒光染色陽性率為2.33%，模型組為19.62%，強的松組為4.71%，健脾益氣攝血中劑量組為12.7%、高劑量組為8.92%。與正常組比較，模型組（P<0.01）、強的松組（P<0.05），健脾益氣攝血各劑量組（P<0.01）小鼠脾臟組織熒光染色陽性率均明顯上調，差異有統計學意義。與模型組比較，強的松組、健脾益氣攝血各劑量組小鼠脾臟組織ROS表達量明顯下調，差異有統計學意義。其中，強的松組ROS含量低于健脾益氣攝血高劑量組（P<0.05），高劑量組ROS含量低于健脾益氣攝血中劑量組（P<0.05），差異有統計學意義。

脾臟組織線粒體DNA（mtDNA）相對拷貝數變化：線粒體DNA與核DNA拷貝數的比值，即mtDNA相對拷貝數，可以反映線粒體DNA的含量與細胞中線粒體的數量。線粒體DNA基因結構模擬見圖2，ITP小鼠脾臟組織mtDNA相對拷貝數見圖3。

圖3可以看出：與正常組比較，模型組、強的松組、健脾益氣攝血各劑量組小鼠脾臟組織線粒體DNA相對拷貝數均明顯下調，差異有統計學意義（P<0.01）。與模型對照組比較，用藥各組小鼠脾臟組織線粒體DNA相對拷貝數比較無統計學意義（P>0.05）。

小鼠結腸組織ATP含量：由于肝脾等其他臟器裂解之后含有大量血細胞，上清顏色偏紅，會引起發光法測量誤差過大，故最終選用結腸組織檢測。首先以ATP標準溶液檢測0.01、0.03、0.1、0.3、1、3、和10 μmol/L這幾個濃度，制作標準曲線，測量得到樣品相對發光值。樣本檢測值見表3，ITP模型小鼠結腸組織ATP檢測標準曲線見圖4，各組小鼠結腸ATP含量比較見圖5。

從圖5結果可以看出，與正常組比較，模型組、強的松組和健脾益氣攝血中劑量組小鼠結腸組織ATP含量明顯下調，差異有統計學意義（P<0.01）;健脾益氣攝血高劑量組小鼠結腸組織ATP含量明顯上調，差異有統計學意義（P<0.01）。與模型組比較，用藥各組小鼠結腸組織ATP含量均顯著升高，差異有統計學意義（P<0.01）。其中，健脾益氣攝血高劑量組小鼠結腸組織ATP含量明顯高于強的松組和健脾益氣攝血中劑量組（P<0.01），強的松組與健脾益氣攝血中劑量組組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。

3 討論

健脾益氣攝血方對脾臟組織ROS水平影響：活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）是線粒體呼吸鏈（Respiratory Chain，RC）氧化磷酸化過程中電子泄露的副產物，在病理條件下，許多因素均會引起ROS生成增多，導致脂質過氧化作用而破壞線粒體膜結構，從而導致ATP生成減少和氧化磷酸化功能受損，氧化磷酸化功能受損又會進一步促進ROS生成，從而形成了自體循環鏈式線粒體功能障礙[4-6]。多種疾病所伴隨的乏力癥狀主要表現為運動耐力下降的疲勞感。有研究表明，這種疲勞感與肌肉組織中線粒體氧化磷酸化功能減弱有關[7-9]。還有研究報道，在慢性乏力癥狀患者體內檢測到ROS水平升高以及線粒體功能異常表現[10-13]。

本次研究發現，ITP小鼠模型組脾臟組織ROS熒光染色陽性率明顯高于正常組，結合既往對于ITP模型小鼠、斑馬魚出血模型乏力替代指標的前期研究結果[14-17]，表明ITP模型小鼠不僅表現有類似人類ITP乏力癥狀，其脾臟組織ROS含量也明顯上調，這一結果提示ITP模型小鼠的線粒體功能受到破壞。經強的松、健脾益氣攝血方中、高劑量治療后，小鼠脾臟組織ROS熒光染色陽性率與模型組比較明顯下調（P<0.01）。其中，強的松下調作用最為明顯，健脾益氣攝血高劑量組優于中劑量組。提示強的松，健脾益氣攝血方中、高劑量均能下調ITP小鼠脾臟組織中ROS含量，有助于線粒體功能的恢復。參考既往健脾益氣攝血方治療ITP臨床試驗結果（緩解乏力癥狀）以及對乏力替代指標的改善作用[18-20]，說明ITP乏力與線粒體產生過多ROS或者清除障礙有一定相關性，健脾益氣攝血方能夠改善ITP乏力癥狀與減少脾臟組織線粒體ROS含量有關。

健脾益氣攝血方對脾臟組織mtDNA相對拷貝數影響：線粒體DNA是裸露的環狀或線性分子，不與組蛋白結合，具有突變率高（比細胞核DNA高10倍以上）和“母性遺傳”特點。由于線粒體DNA編碼部分細胞色素氧化酶亞基，故mtDNA異常可能會對線粒體氧化磷酸化過程造成影響，使ATP合成不足而導致疾病發生與進展[21]。既往研究發現，線粒體DNA功能異常與慢性病乏力癥狀發生過程有關，mtDNA異常可能會影響患者對肌痛性腦脊髓炎（慢性疲勞綜合征）等疾病的易感性[22-25]。

線粒體DNA與核DNA拷貝數的比值，即mtDNA相對拷貝數，可以反映線粒體DNA的含量與細胞中線粒體的數量，是反映線粒體生物合成及功能狀態的重要指標。線粒體ND1基因（MT-ND1）位于mtDNA小環，編碼位于線粒體內膜的NADH脫氫酶亞單位1[26-28]。本研究以ND1基因代表mtDNA，以GAPDH代表核基因作為內參，采用qPCR技術檢測ND1相對拷貝數，觀察ITP模型小鼠mtDNA的拷貝情況，是目前國內外較為常用的一種檢測線粒體DNA含量的實驗方法。在本研究的前期實驗中已證實，在被動免疫造模法建立ITP模型后，模型組小鼠出現了反應遲鈍，活動能力下降，進食量減少，豎毛，便溏，或血便等類似“脾氣虛弱”引起的乏力癥狀。與此同時，模型組小鼠脾臟mtDNA相對拷貝數明顯減少，說明被動免疫法復制的ITP造模對小鼠脾臟線粒體功能有不同程度的損害。經強的松、健脾益氣攝血方治療后，小鼠脾臟mtDNA相對拷貝數并沒有上調的原因，考慮系治療時間較短，小鼠脾臟線粒體功能尚不能得到完全修復;也可能是因為健脾益氣攝血方并不是通過提高臟器線粒體DNA相對拷貝數（mtDNA含量）來改善小鼠臟器線粒體功能的。

健脾益氣攝血方對結腸組織ATP含量影響：腺嘌呤核苷三磷酸（Adenosine Triphosphate，ATP）是生物體內最直接的能量來源，80%的ATP產生來自氧化磷酸化。早在20世紀90年代就已經發現，大鼠骨骼肌中ATP水平下降與疲乏程度之間具有明顯線性關系[29-30]。由于肝脾等其他臟器裂解之后血細胞成分含量較大，勻漿的上清顏色偏紅，會引起發光法測量誤差過大，故在本實驗中最終選用結腸組織檢測。研究結果發現，與正常組比較，模型組、強的松組和健脾益氣攝血中劑量組小鼠結腸組織中ATP含量明顯下降（P<0.01），說明ITP造模成功后，ITP模型小鼠結腸組織的ATP水平也隨之顯著下降。與模型組比較，給藥各組小鼠ATP含量明顯上調（P<0.01）。其中，健脾益氣攝血高劑量組小鼠結腸組織ATP含量明顯高于強的松組和健脾益氣攝血中劑量組，差異有統計學意義（P<0.01），即以健脾益氣攝血高劑量組上調ATP含量的作用最優。實驗結果證明，健脾益氣攝血方可以改善ITP小鼠結腸組織線粒體功能，提高小鼠結腸組織中ATP水平，并能夠有效緩解ITP小鼠的乏力癥狀。

綜合上述研究結果，可以得出如下結論：經被動免疫造模法建立的ITP小鼠模型具有類似“脾氣虛弱”的乏力癥狀，同時線粒體功能也明顯受損。健脾益氣攝血方可以通過改善ITP小鼠線粒體功能使乏力癥狀得到緩解。

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（2021-01-05收稿 責任編輯：徐穎）