丙泊酚調(diào)控PI3K/AKT信號(hào)通路對(duì)肺癌細(xì)胞增殖、遷移和凋亡的影響

謝圓媛，胡海峰，趙 莉，薛 鵬

近年來，肺癌的發(fā)病率逐年上升，已經(jīng)成為最常見的惡性腫瘤[1]。我國肺癌的發(fā)病率及病死率均位居惡性腫瘤之首[2]。雖然針對(duì)肺癌的診斷和治療方法不斷改進(jìn)，但其存活率并無明顯提高，且臨床預(yù)后效果差。PI3K/AKT信號(hào)通路在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用[3]，能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖和腫瘤轉(zhuǎn)移，并抑制細(xì)胞凋亡，也與腫瘤的治療及預(yù)后密切相關(guān)[4]。約90%的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株存在PI3K/AKT信號(hào)通路的過度激活，以PI3K/AKT信號(hào)通路為靶標(biāo)的新藥研發(fā)越來越受到重視[5]。丙泊酚是臨床上常用的麻醉藥物，近年來有研究發(fā)現(xiàn)其具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用[6]。本課題將探究丙泊酚能否通過PI3K/AKT信號(hào)通路對(duì)肺癌細(xì)胞的增殖、遷移與凋亡產(chǎn)生影響，并進(jìn)一步探討其作用機(jī)制，為臨床上治療肺癌提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 人肺癌A549細(xì)胞株(CQH005)購自上海科學(xué)院細(xì)胞研究所。24只4～6周齡的雄性A/J小鼠(N000018)由延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物研究中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(陜)2019-003。丙泊酚購自上海源葉生物科技有限公司，RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清和Trizol試劑均購自美國Abcam公司，PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis試劑盒和TB GreenTMPremix Ex Taq Ⅱ試劑盒購自日本TaKaRa公司，Annexin V/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司，HE染色試劑盒和RIPA裂解液均購自北京索萊寶科技有限公司，PTEN、PI3K、p-AKT、AKT、mTOR、GAPDH多克隆抗體和山羊抗兔(鼠)IgG二抗均購自美國Cell Signaling Technology公司，PVDF膜購自美國Millipore公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)：A549細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，傳代時(shí)用0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化，每2天更換1次培養(yǎng)基，以保證細(xì)胞生長所需的營養(yǎng)成分。

1.2.2細(xì)胞分組：根據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)基中添加丙泊酚濃度的不同[7]，將細(xì)胞分為control組(未添加丙泊酚)、pL組(添加丙泊酚1.5 μg/ml)和pH組(添加丙泊酚2.2 μg/ml)。A549細(xì)胞以每孔1×105個(gè)接種于24孔板，待細(xì)胞融合度達(dá)60%時(shí)，按照上述分組分別加入不同濃度的丙泊酚，24 h后結(jié)束培養(yǎng)，收集各組細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3克隆形成實(shí)驗(yàn)：培養(yǎng)24 h后的各組細(xì)胞按每孔1×103個(gè)接種于60 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中。培養(yǎng)14 d后用結(jié)晶紫溶液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，計(jì)數(shù)含有≥50個(gè)細(xì)胞的集落，并用顯微鏡拍攝代表性細(xì)胞集落并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.2.4細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)：培養(yǎng)24 h的各組細(xì)胞以2×104/ml接種于12孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞融合度達(dá)90%時(shí)，用10 μl無菌槍頭沿培養(yǎng)皿底直線劃痕，形成間隙。應(yīng)用PBS重復(fù)洗滌3次，再加入不含血清的培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。24 h后在顯微鏡下觀察細(xì)胞愈合程度并拍照，測量細(xì)胞間的劃痕距離。

1.2.5流式細(xì)胞術(shù)：培養(yǎng)24 h后的各組細(xì)胞用冷PBS清洗2次，用緩沖液重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105/ml。具體操作按照Annexin V/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作，使用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.2.6qRT-PCR檢測：Trizol試劑提取各組細(xì)胞的總RNA。使用紫外分光光度計(jì)檢測總RNA的純度和含量，并將每個(gè)配對(duì)的樣品調(diào)節(jié)至相同濃度。使用PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis試劑盒將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA；使用TB GreenTMPremix Ex Taq Ⅱ試劑盒進(jìn)行qRT-PCR檢測。使用StepOnePlus實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)完成實(shí)驗(yàn)后，采用2-ΔΔCt法分析數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)相關(guān)引物序列見表1。

表1 PTEN、PI3K、AKT、mTOR和GAPDH的引物序列

1.2.7Western blot檢測：RIPA裂解液提取各組細(xì)胞的總蛋白，并通過BCA方法進(jìn)行定量，樣品經(jīng)變性后進(jìn)行上樣。按照實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行電泳-轉(zhuǎn)膜-封閉(5%脫脂奶粉)-加一抗孵育[PTEN抗體(1∶1000)、PI3K抗體(1∶1000)、p-AKT抗體(1∶1000)、AKT抗體(1∶1000)、mTOR抗體(1∶1000)和GAPDH抗體(1∶2000)，4℃過夜]-加二抗孵育[山羊抗兔IgG抗體(1∶4000)或山羊抗鼠IgG抗體(1∶4000)，室溫1 h]-顯影曝光。應(yīng)用Image-Pro Plus圖像分析系統(tǒng)對(duì)蛋白條帶灰度值進(jìn)行分析。

1.2.8小鼠移植成瘤實(shí)驗(yàn)：采用苯并芘誘導(dǎo)小鼠肺癌模型[8]，選取雄性A/J小鼠，經(jīng)右側(cè)胸壁穿刺肺內(nèi)注射50 μl苯并芘-玉米油溶液(苯并芘濃度為20 mg/ml)，每周1次，共注射4次。4周后，HE染色驗(yàn)證造模是否成功。造模成功的24只小鼠被隨機(jī)分為c組、p1組(腹腔注射丙泊酚20 mg/kg)和p2組(腹腔注射丙泊酚50 mg/kg)[9]，每組8只。c組腹腔注射0.9%氯化鈉注射液，p1組和p2組腹腔注射相應(yīng)劑量的丙泊酚，每天給藥1次、連續(xù)給藥28周。末次給藥2 h后處死小鼠，取全肺組織，體視顯微鏡測量各組肺部腫瘤的數(shù)量及大小并拍照。

2 結(jié)果

2.1丙泊酚對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響 克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與control組比較，pL組和pH組均能抑制A549細(xì)胞增殖能力，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；且呈劑量依賴性。見圖1。

圖1 丙泊酚對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響(結(jié)晶紫染色×40)

2.2丙泊酚對(duì)A549細(xì)胞遷移的影響 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與control組比較，pL組和pH組均能抑制A549細(xì)胞遷移能力，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；且呈劑量依賴性。見圖2。

圖2 丙泊酚對(duì)A549細(xì)胞遷移的影響

2.3丙泊酚對(duì)A549細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果表明，與control組比較，pL組和pH組能促進(jìn)A549細(xì)胞的凋亡，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；且呈劑量依賴性。見圖3。

圖3 丙泊酚對(duì)A549細(xì)胞凋亡的影響

2.4丙泊酚對(duì)A549細(xì)胞PTEN、PI3K、AKT及mTOR mRNA和蛋白表達(dá)的影響 qRT-PCR和Western blot檢測結(jié)果顯示，與control組比較，pL組和pH組能夠抑制A549細(xì)胞中PI3K、AKT、mTOR mRNA和蛋白的表達(dá)以及AKT的磷酸化程度，提高PTEN mRNA和蛋白的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；且呈劑量依賴性。見圖4。

圖4 丙泊酚對(duì)A549細(xì)胞PTEN、PI3K、AKT及mTOR mRNA和蛋白的表達(dá)情況

2.5丙泊酚對(duì)小鼠肺部腫瘤生長的影響 用苯并芘誘導(dǎo)A/J小鼠復(fù)制肺癌模型，HE染色確定模型制備成功，并給予丙泊酚腹腔注射處理、連續(xù)給藥28周，通過對(duì)小鼠肺部腫瘤數(shù)量及大小測量發(fā)現(xiàn)，與c組比較，p1組和p2組腫瘤數(shù)量顯著減少、腫瘤體積顯著減小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。見圖5。

圖5 丙泊酚對(duì)A/J小鼠肺部腫瘤生長的影響

3 討論

肺癌是一種臨床常見的惡性腫瘤，發(fā)病率和病死率較高。男性肺癌患者的發(fā)病率和病死率在各種惡性腫瘤中居首位，且臨床預(yù)后效果差[10]。據(jù)相關(guān)數(shù)據(jù)顯示，每年新增肺癌患者約182.5萬，因肺癌而死亡的患者約159萬[11]。臨床上80%～85%的肺癌患者為非小細(xì)胞肺癌，而且有80%的患者在確診時(shí)就已經(jīng)屬于中晚期，只能進(jìn)行化放療、靶向治療或者中醫(yī)藥治療[12-14]。因此，尋找新的肺癌治療藥物至關(guān)重要。

PI3K/AKT信號(hào)通路與腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移有著高度的相關(guān)性，腫瘤細(xì)胞會(huì)使該通路異常激活，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[15]。AKT在PI3K/AKT信號(hào)通路中占重要地位，其可以通過磷酸化作用直接或間接影響下游靶蛋白[16-17]。而且PI3K/AKT信號(hào)通路在多種腫瘤組織中呈現(xiàn)高表達(dá)，如肺癌、乳腺癌、卵巢癌、鼻咽癌等[18]。

丙泊酚作為臨床上應(yīng)用最為廣泛的全身麻醉藥物，可通過激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)多種癌細(xì)胞的凋亡[19]。相關(guān)研究表明，丙泊酚還具有抗炎、抗氧化等作用[20]，而且大量研究證實(shí)丙泊酚還具有抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的作用，但其具體機(jī)制尚不完全清楚[21-22]。本實(shí)驗(yàn)探討了丙泊酚對(duì)肺癌細(xì)胞增殖、遷移和凋亡的影響，結(jié)果表明，與control組比較，pL組和pH組均能抑制A549細(xì)胞的增殖能力和遷移能力，且能促進(jìn)A549細(xì)胞的凋亡；以上實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明丙泊酚能夠抑制肺癌細(xì)胞的增殖、遷移，促進(jìn)肺癌細(xì)胞的凋亡。

本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討了PI3K/AKT信號(hào)通路在肺癌中的作用，以及丙泊酚對(duì)PI3K/AKT信號(hào)通路的影響，結(jié)果顯示，與control組比較，pL組和pH組均能抑制A549細(xì)胞中PI3K、AKT和mTOR mRNA和蛋白的表達(dá)，提高PTEN mRNA和蛋白的表達(dá)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明丙泊酚能夠抑制PI3K/AKT信號(hào)通路的激活。最后，本研究進(jìn)行了小鼠移植成瘤實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，丙泊酚抑制了腫瘤的生長，小鼠肺部腫瘤的數(shù)量顯著減少、腫瘤體積也顯著減小，說明丙泊酚能夠抑制小鼠肺部腫瘤的生長。因此，丙泊酚可能通過抑制PI3K/AKT信號(hào)通路來抑制肺癌細(xì)胞的增殖、遷移，并促進(jìn)肺癌細(xì)胞的凋亡。

綜上所述，丙泊酚能夠抑制肺癌細(xì)胞的增殖、遷移，促進(jìn)其凋亡，還能抑制小鼠肺部腫瘤的生長，其機(jī)制可能是通過增加PTEN的表達(dá)，抑制PI3K/AKT信號(hào)通路激活實(shí)現(xiàn)的。但丙泊酚的作用機(jī)制是否還有其他途徑尚需要進(jìn)一步研究證實(shí)。