綿羊ICSI胚胎培養液中發情綿羊血清濃度優化研究

黃飛，趙建清，陶維昆，劉波，朱文靚，方翟，高慶華,3*

（1塔里木大學動物科學學院，新疆 阿拉爾 843300）

（2塔里木大學生命科學學院，新疆 阿拉爾 843300）

（3塔里木畜牧科技兵團重點實驗室，新疆 阿拉爾 843300）

胞漿內單精子注射技術（ICSI）是一項較為尖端的人工輔助生殖技術，該技術能夠不經過正常的受精生理過程，而是借助顯微操作儀器，直接將處理過的單個精子利用顯微注射針注入到成熟的卵母細胞內，使精卵結合并完成受精過程[1]。ICSI技術對研究動物受精機理、保護瀕危物種、輔助畜牧生產和治療人類生殖疾病等方面有著重要作用，同時還能提高轉基因動物的生產效率，使該技術無論是對科學研究還是生產實踐都具有十分重要的意義[2]。目前，在體外生產ICSI胚胎的過程中，ICSI胚胎培養液替代了綿羊的體內環境，且ICSI胚胎培養液的優劣能夠直接影響到培養效果及后期胚胎的發育潛能，因此ICSI胚胎培養液對體外生產胚胎起著決定性因素。因為培養液中含有血清、激素、細胞因子與能量物質等[3]，能為胚胎發育提供所需要的營養成分，這些重要的營養成分，對早期胚胎的存活和發育起著重要作用[4]。在培養液的配制中，血清是常見的重要組成成分，血清中含有激素、微量元素、生長因子和重金屬離子等[5]，不僅能提供營養物質，還能維持細胞的穩定性和完整性[6]。常用的血清有胎牛血清（fetal bo‐vine serum，FBS）、發情綿羊血清（ESS）和發情牛血清（estrus bovine serum，EBS）[7]。在綿羊胚胎體外培養液中，添加發情綿羊血清（ESS）要優于添加牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA）、FBS及發情山羊血清（estrous goat serum，EGS）的培養效果[3,8-9]，也有研究發現添加發情3 d羊血清對綿羊卵裂率和囊胚率有明顯提高[10]。綿羊血清所含的激素、微量元素、生長因子和重金屬離子等更有利于綿羊ICSI胚胎的后期發育[11]。有研究者認為在綿羊卵母細胞成熟培養中，ESS的添加量在5%～20%，并且較低濃度的ESS能有效提高桑椹胚率、囊胚率[12]。而目前在ICSI胚胎培養液中添加不同濃度ESS的研究較少，且ESS的最適添加濃度還沒有在綿羊胚胎體外培養體系中得到統一。本試驗通過研究在ICSI胚胎培養液中添加不同濃度的ESS對綿羊ICSI胚胎發育的影響，以確定最適ICSI胚胎后期發育的ESS濃度，對體外生產優質綿羊ICSI胚胎體系的建立有著重要意義，并為后期的深入研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑

發情綿羊血清（ESS）和精液均采自塔里木大學動物實驗站飼養的多浪羊，昆侖一號精液稀釋液購自塔克藍公司，肝素鈉購自索萊寶公司，雙抗（penicillin-sreptomycin,PS）、TCM-199培養液購自Giboc公司，其余藥品均購自Sigma公司。

1.1.2 試劑配制

采卵液：TCM-199培養液+5 mmol/L NaHCO3+20 mmol/L HEPES+10 μg/mL肝素鈉+2% PS。

顯微操作基礎液（MM）：TCM-199培養液+6 mmol/L NaHCO3+5 mmol/L HEPES。

胚胎基礎培養液（IVC）：SOF液+1% NEAA+2% EAA+0.1%肌醇+0.1 μg/mL檸檬酸

鈉+0.1%谷氨酰胺+6 μg/mL BSA+0.25 mmol/L葡萄糖+1% PS。

胚胎基礎培養液中分別添加A組0%、B組5%、C組10%、D組15%、E組20% ESS配制成含有不同濃度ESS的胚胎發育液。

1.1.3 主要儀器

顯微操作儀（型號：NT88-V3）、拉針儀（型號：PN-30）、顯微煅燒器，（型號：MF-900）、顯微研磨器（型號：EG-400），日本Narishige公司；超凈工作臺（SWCJ-2FD），博訊公司；CO2培養箱（型號：MC0-15A），日本三洋公司。

1.2 方法

1.2.1 發情綿羊血清的制備

發情綿羊頸靜脈采血，將血樣置于4℃2 h后，以2 500 r/min轉速離心20 min后取出發情綿羊血清。將分離好的發情綿羊血清在56℃滅活30 min后過濾分裝。

1.2.2 綿羊精液采集

綿羊精液采集是利用假陰道法采集，將新鮮精液按照1∶4的比例與昆侖一號精液稀釋液混合。取50 μl檢測精子活力，然后置于冰箱冷藏，在2 h內使溫度降到0～4℃，待用。

1.2.3 顯微操作針的制作

胞漿內單精子注射所用到的顯微操作針分為固定針與注射針。本試驗胞漿內單精子注射所用到的顯微注射針與固定針是由硅酸鹽玻璃管在拉針儀、顯微煅燒器、顯微研磨器下按所需規格自制完成的。顯微注射針的制作如圖1A、圖1B所示，顯微固定針的制作如圖1C所示。

圖1 顯微操作針的制作

1.2.4 綿羊卵巢采集

綿羊卵巢采自阿克蘇市屠宰場，屠宰后立即取下卵巢，放入37℃加PS的生理鹽水中，4 h內運回實驗室。

1.2.5 卵丘-卵母細胞復合體的采集與篩選

帶回實驗室的綿羊卵巢，先用75%乙醇沖洗3遍，再用生理鹽水充分清洗3遍，用切割法收集卵母細胞，整個過程始終使卵巢溫度保持在37℃。沉淀數分鐘后，在體式顯微鏡下撿出A、B級卵丘-卵母細胞復合體（cumulus-oocyte complex，COCs），進行培養。

1.2.6 COCs的培養

在CO2培養箱中用微滴法培養篩選出的COCs，培養24 h后轉移到0.1%透明質酸酶中，用移液槍反復吹打至脫去顆粒細胞，在體視鏡下觀察卵母細胞第一極體排出情況并記錄。根據公式：卵母細胞成熟率=（成熟COCs總數/COCs總數）×100%，計算卵母細胞成熟率。

1.2.7 胞漿內單精子注射并激活處理

在培養皿中做兩個微滴，A滴（添加PVP的MM液）在培養皿中軸上方，A滴中放置精子，B滴（含細胞松弛素B的MM液）在培養皿中軸下方，B滴中放置成熟的卵母細胞。ICSI操作時，在A滴中選擇直線運動的精子，用注射針在精子尾部中段猛然劃過，使其喪失游動能力，隨后將該精子從尾部吸入并移到B滴中。固定針固定卵母細胞時使第一極體位于“12”的方位，注射針由“3”點的位置刺破卵母細胞質膜，再將單個精子注入卵胞漿內，慢慢撤出注射針。注射結束后，將卵子在IVC液中洗2遍，放入CO2培養箱中培養30 min，然后用7%乙醇激活5 min，最后取出放入IVC液中培養。

1.2.8 胚胎體外培養

激活后的卵母細胞分組放入預先平衡的70 μL胚胎發育液微滴中，胚胎發育液分為A、B、C、D、E，5組胚胎發育液分別在CO2恒溫培養箱中進行胚胎培養。24 h后記錄卵裂卵母細胞數，培養144 h后，統計桑椹胚的數量，根據公式：桑椹胚率=（桑椹胚總數/成熟COCs）×100%，計算桑椹胚率。

1.2.9 統計分析

試驗組重復三次，數據采用SPSS 17.0統計軟件的單因素方差分析進行顯著性檢驗，LSD多重比較差異，結果用“平均值±標準差”表示。P＜0.05表示差異顯著，P＞0.05表示差異不顯著。

2 結果與分析

本試驗通過培養綿羊卵母細胞發育到桑椹胚，統計桑椹胚發育情況，結果見圖2，C組（10% ESS添加組）桑椹胚率顯著高于A、B、D、E組（P＜0.05），B、D組顯著高于A、E組（P＜0.05），但A組與E組、B組與D組間均無顯著差異（P＞0.05）。擴散疏松的COCs如圖3D所示，胞漿內單精子注射如圖3E所示，桑椹胚如圖3F所示。

圖2 不同濃度發情綿羊血清對桑椹胚率的影響

圖3 綿羊ICSI試驗圖

3 討論

本試驗是利用胞漿內單精子注射技術得到的ICSI胚胎，然后在ICSI胚胎培養液中添加不同濃度的ESS，進行ICSI胚胎體外培養。從本試驗結果可以看出，在綿羊ICSI胚胎的體外培養液中添加10%的ESS，胚胎的桑椹胚率為23.78%，顯著高于ESS添加量為0%、5%、15%、20%的分組，表明在胚胎培養液中添加10%的ESS對綿羊胚胎的體外培養有促進作用。

目前血清添加在胚胎培養液中有相關研究，但尚未見過在ICSI胚胎培養液中添加的報道。劉鳳軍等[13]認為在胚胎培養液中添加血清能影響早期胚胎的發育。劉賽等[14]在研究培養液中血清對牛胚胎體外發育的影響時發現，添加血清組的牛胚胎囊胚發育率顯著高于無血清組的，說明血清對胚胎的發育具有促進作用。本試驗在ICSI胚胎培養液中添加ESS，桑椹胚率有所提高，說明血清確實能夠影響胚胎的發育。GUTIERREZ A等[15]認為在胚胎培養液中加入血清，能夠改善胚胎后期的發育情況，引導囊胚的形成，而 PINYOPUMMINTR T等[16]認為在胚胎培養液中加入血清，抑制了胚胎分裂，本試驗結果表明添加10%血清能夠有效改善胚胎后期發育情況，而高濃度或低濃度的添加量都沒有明顯的促進作用，反而高濃度會產生一定的抑制作用，與GUTIERREZ A等[15]結果相同。產生這一結果的原因可能是血清含有胚胎生長所需的多種氨基酸、維生素、激素、生長因子和抗氧化物質等[17]，這些物質的對促進胚胎生長或抑制生長活性是達到生理平衡的。劉鳳軍等[18]在不同培養液中添加不同濃度山羊血清的研究中發現，在不同的三種培養液中添加10%的山羊血清，囊胚的發育率都是最優的。劉鳳軍等人的研究結果與本試驗結果相同，在胚胎培養液中添加10%的ESS，能有效提高胚胎的桑椹胚率。所以血清添加劑量很重要，添加較少，促進作用不明顯，反之，又會抑制后期胚胎分裂效果。

胞漿內單精子注射后的綿羊胚胎在體外培養時，ICSI胚胎一直處在培養液中，所以ICSI胚胎培養液的成分尤為重要。而張宏等[19]在不同培養液及血清濃度對綿羊胚胎體外發育的研究中得出，在培養液中添加10%的FBS可達到良好的培養效果，卵裂率為29.6%，囊胚率為11.3%。雖然本試驗是采用單精子注射技術得到的ICSI胚胎，但所得結果與張宏等[19]試驗結果基本一致，都能使胚胎達到良好的培養效果，產生這一結果可能是10%的ESS中起到促進胚胎生長的物質與抑制的物質達到一個平衡，使促進作用達到最大化。說明在ICSI胚胎培養液中添加10%的ESS有利于綿羊胚胎的后期發育。而在10%左右是否還有更適的濃度，需要后期進一步試驗進行證明。本試驗結果對體外生產優質綿羊ICSI胚胎體系的建立有著重要意義，并為后期的注射失活精子使其發育及轉基因研究奠定一定基礎。

4 結論

利用胞漿內單精子注射技術得到的ICSI胚胎在后續培養時，ICSI胚胎培養液中添加10%的ESS，培養至桑椹胚時的桑椹胚率為23.78%，顯著優于其他組。由本試驗可得出，在ICSI胚胎培養液中添加10%的ESS能夠有效提高綿羊ICSI胚胎的桑椹胚率。