‘綠寶石’梨果實發育期酚類物質的動態變化及其抗氧化活性

王鑫，姜喜，于軍,2，蒲云峰，林彩霞，吳翠云,2*

(1塔里木大學植物科學學院/南疆特色果樹高效優質栽培與深加工技術國家地方聯合工程實驗室，新疆 阿拉爾 843300)

(2塔里木盆地生物資源保護利用兵團重點實驗室，新疆 阿拉爾 843300)

(3塔里木大學生命科學學院，新疆 阿拉爾 843300)

(4新疆生產建設兵團第二師農業科學研究所，新疆 鐵門關 841005)

酚類物質是植物的主要次生代謝產物之一，參與植物的生長繁殖過程，協助植物抗逆，抵抗天敵侵害[1]。酚類物質對人體也有著一定的營養價值[2]，在防病保健方面，具有抗腫瘤、抗氧化、防治心腦血管疾病以及抗菌等作用[3]。

近年來，對水果內酚類物質的研究已成為熱點。對梨果實內酚類物質的研究已有相關的報道，研究表明，梨果實中主要包括羥基肉桂酸、羥基醌、黃烷醇、黃酮醇等酚類物質；其中綠原酸、熊果苷、兒茶素、表兒茶素、蘆丁是梨中主要的酚類單體化合物[4]。LONG Z等[5]在梨皮中鑒定出36種黃酮和19種羥基肉桂酸酯，主要酚類物質是熊果苷和綠原酸，其余酚類物質品種間差別很大。不同品種梨果實中酚類物質含量也有差別。曾少敏等[6]研究發現不同梨系統間總酚、總黃酮含量存在顯著差異，表現為秋子梨最高，西洋梨略低，新疆梨、白梨次之，砂梨最低。梨果實中酚類物質及含量的分布也有一定的規律。李靜等[7]、張小雙等[8]研究表明：梨果實中果皮部位酚類物質含量最高，果心次之，果肉中最低。李凡等[9]對梨中主要的酚類物質熊果苷在果實中的含量與分布進行研究，結果表明5個品種中的含量均為果皮＞果心＞果肉；其中果肉中的熊果苷分布也表現出靠近果皮和果心的含量大于中部的含量。安景舒等[10]、郭杰[11]、曾少敏等[6]的研究中均表明梨果實中酚類物質均具有一定的抗氧化活性，且不同品種間的抗氧化活性有所不同。‘綠寶石’梨又名‘中梨一號’為優良早熟新品種，口感細膩脆爽，豐產，連續結實能力強，具有較好的經濟價值[12]。本試驗以‘綠寶石’梨果實為試材，采用超聲波輔助甲醇提取法及自由基清除法對果實發育期內總酚、總黃酮、酚類組分含量和抗氧化能力的動態變化進行檢測，旨在揭示‘綠寶石’梨果實發育過程中酚類物質及抗氧化能力變化規律，為梨的功能性物質研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

‘綠寶石’梨果實樣品采自輪臺梨種質資源圃，于2019年5月25日（花后50 d）開始采樣，每隔14 d采樣一次，采摘時隨機選取樹冠外圍、中部不同方向，無病蟲害，大小一致的果實，每棵樹10個，三次重復。采后立即放入4℃采樣箱中運回，帶皮切片去核后保存于-70℃超低溫冰箱中待測。

TU-1800型紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；1510酶標儀、374酶標儀，美國Thermo Fisher ROTINA 380R；LC-20A液相色譜，日本島津。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品處理

梨果實樣品從超低溫冰箱取出后，立即放入溫度為-50℃的真空冷凍干燥機中冷凍干燥72 h，得到的凍干樣品用組織破碎機粉碎，于-20℃貯藏待測。

1.2.2 酚類物質的提取

精確稱取1.000 0 g果實樣品凍干粉，用80%的甲醇溶解定容到25 mL容量瓶中，超聲波提取30 min后4 500 r/min離心15 min，將離心后的上清液貯藏在-20℃的條件下備用。

1.2.3 主要活性物質的測定

總酚的測定參考Folin-Ciocalteu法[13]，以每g干樣所含沒食子酸的量表示，單位為mg GAE/g DW?？傸S酮的測定采用硝酸鋁比色法，以每g干樣所含蘆丁的量表示，單位為mg RE/g DW。

1.2.4 酚類組分測定

采用高效液相色譜法（HPLC）[13]，色譜條件：C18（250 mm×4.6 mm，5μm）柱，柱溫30℃，進樣量10 μL，流速1 mL/min，流動相A為0.5%甲醇水溶液，流動相B為乙腈。樣品中的酚類物質含量以μg/g DW表示。

1.2.5 抗氧化能力的測定

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,2'-聯氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)自由基清除能力參考PU Y等[13]的方法。用6-羥基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸（Trolox）作為標準物質，結果以μmol TE/g DW表示。

1.3 數據處理

運用Origin 8.5軟件進行數據作圖，運用DPS 7.5軟件進行 Duncan’s多重比較（P＜0.05）和Pearson相關系數分析。

2 結果與分析

2.1 ‘綠寶石’梨果實發育期總多酚、總黃酮含量的變化

‘綠寶石’梨果實發育期總酚、總黃酮含量變化（如圖1、圖2所示），在‘綠寶石’梨生長發育期，總酚、總黃酮含量均呈現下降趨勢，在花后50～65 d降低的最顯著。在花后50 d時，總酚、總黃酮含量最高，分別達18.95 mg GAE/g DW、34.48 mg RE/g DW。隨果實的生長總酚、總黃酮含量急劇下降，至花后65 d，果實中的總酚含量下降了70.66%?；ê?5～140 d果實中總酚含量變化差異不明顯，均在3.28～2.11 mg GAE/g DW范圍內變化。至果實成熟時，果實內總酚含量最低，為2.11 mg GAE/g DW，僅有花后50 d時的11.13%；果實內總黃酮的含量變化趨勢與總酚含量一致，花后50 d時總黃酮含量是成熟時的12.54倍，花后80 d便下降到一個較低的水平，其含量在2.75～5.77 mg RE/g DW之間。

圖1 ‘綠寶石’梨果實發育期內總酚含量的變化

圖2 ‘綠寶石’梨果實發育期內總黃酮含量變化

2.2 ‘綠寶石’梨果實發育期內酚類物質組分分析

用HPLC法共鑒定出14種酚類物質，分別為熊果苷、兒茶素、表兒茶素、綠原酸、山萘酚-己糖-雙脫氧己糖苷、蘆丁、山萘酚-3-O-蕓香糖苷、槲皮葡萄糖苷、槲皮素鼠李糖苷、異鼠李素-3-O-蕓香糖苷、山萘酚-3-O-葡萄糖苷、異鼠李素-3-O-葡萄糖苷、山萘酚-3-乙?；咸烟擒?、異鼠李素-3-乙?；禾擒铡谋?可以看出，整個生育期中熊果苷的平均含量最高，達4 214.82 μg/g DW，占總組分的55.72%；綠原酸次之，平均含量為1 656.58 μg/g DW，占總組分的28.10%；兒茶素、表兒茶素的平均含量分別為213.62 μg/g DW、188.04 μg/g DW，占總組分的 3.07%、2.95%；其余酚類物質含量較少，含量在5.34～99.41 μg/g DW間，各占比在1%左右。異鼠李素-3-乙?；禾擒蘸瑑H存在于果實發育初期，在花后95 d之后該物質檢測不到。因此熊果苷、綠原酸是‘綠寶石’梨酚類物質的主要組成成分。

表1 ‘綠寶石’梨果實發育期內各酚類組分含量變化 單位：μg/gDW

在‘綠寶石’梨整個生育周期中，酚類物質各組分含量呈現不同的變化趨勢，大體可分兩種，一種持續下降，直至果實成熟降至最低。此類物質分別為熊果苷、兒茶素、綠原酸和異鼠李素-3-乙酰基己糖苷，其含量均在花后50 d最高，成熟后含量最低。另一種中期降至最低，此類酚類組分均表現出在花后95 d含量最低，此時的含量與成熟時相近甚至低于成熟期。

2.3 ‘綠寶石’梨果實發育過程中體外抗氧化活性的動態變化

‘綠寶石’梨果實在發育過程中抗氧化活性的變化影響如圖3所示。在果實發育的過程中，對DPPH、ABTS自由基的清除能力均呈現降低的趨勢。在花后50 d‘綠寶石’梨對自由基的清除能力最強；隨著果實發育對自由基的清除能力迅速下降。在成熟后對自由基的清除力降至最低。

圖3 ‘綠寶石’梨果實發育過程中抗氧化活性的變化

‘綠寶石’梨果實在發育過程中對不同的自由基的清除能力也不同，對DPPH自由基的清除能力低于ABTS。在花后50 d對ABTS的清除能力是DPPH的5.99倍，對ABTS的清除能力可達446.14 μmol TE/g，但對DPPH的清除能力僅有74.47 μmol TE/g。在花后50～65 d是‘綠寶石’梨果實抗氧化性最高的時期。

2.4 ‘綠寶石’梨果實發育期內酚類物質與抗氧化活性相關分析

‘綠寶石’梨果實發育過程中，酚類物質含量與抗氧化性之間的相關性如表2所示。總酚、總黃酮、熊果苷、綠原酸、表兒茶素、山萘酚-己糖-雙脫氧己糖苷、槲皮葡萄糖苷、山萘酚-3-O-葡萄糖苷、異鼠李素-3-乙酰基己糖苷含量對ABTS、DPPH的清除能力均呈現極顯著正相關（P＜0.01），異鼠李素-3-O-葡萄糖苷的含量對DPPH的清除能力呈顯著正相關(P＜0.05)，兒茶素、槲皮素鼠李糖苷的含量對ABTS的清除能力呈顯著正相關(P＜0.05)。蘆丁、山萘酚3-乙?；咸烟擒盏暮颗cDPPH、ABTS清除能力無相關性。從相關性分析可以看出總酚和黃酮是‘綠寶石’梨抗氧化活性的物質基礎，其中綠原酸在對DPPH自由基的清除中起著較為重要的作用。表兒茶素、槲皮葡萄糖苷是對ABTS自由基的清除中的主要貢獻者。

表2 ‘綠寶石’梨果實發育期酚類物質與抗氧化性之間的相關性

3 討論

酚類物質可以參與植物生殖，協助其抗逆[1]，各類植物在不同的時期表現出不同的積累含量。植物在果實發育前期積累大量的酚類物質有利于幼果抵抗高溫、蟲害、干旱等脅迫壓力，使果實得以成熟，順利完成繁殖過程[14]?！G寶石’梨果實發育過程中主要的酚類物質是熊果苷和綠原酸，這與CUI T等[15]對鴨梨的研究相吻合。酚類物質的含量隨著果實的成熟而降低，這與趙金偉等[16]對蘋果梨生育期酚類物質變化的研究結果相一致。對于果實中酚類物質含量隨著成熟而降低，王思新等[17]認為果重的增加是導致酚類物質下降的主要原因之一；果實內酚類物質的下降也是抗氧化性降低的主要原因。‘綠寶石’梨在果實發育期的抗氧化性同獼猴桃[18]、棗[19]等研究相一致，均表現為在幼果期抗氧化性較高，隨著果實成熟而逐漸降低。

黃酮類化合物又稱類黃酮、黃酮體等，廣泛存在于植物的各個器官中，是其產生的一類次生代謝物[20]。‘綠寶石’梨果實發育的過程中黃酮類物質含量的變化與陳洪強等[21]對葡萄生長發育中類黃酮含量的變化一致；研究表明幼果期和果實成熟后期是黃酮類化合物的主要積累期，果實發育初期果實生長較快，黃酮類化合物伴隨著果實細胞大量分裂和強烈的新陳代謝迅速積累；成熟期黃酮類化合物含量低于幼果期，分析原因是細胞內含水量比較高；對于在‘綠寶石’梨果實發育期兒茶素的含量變化與趙金偉等[16]對蘋果梨的研究結果有所不同：蘋果梨在果實發育期兒茶素的含量呈現出了低-高-低的趨勢，即幼果期和成熟期含量較低，發育中期含量增高，而‘綠寶石’梨則表現出持續降低的趨勢。目前清除自由基是評價抗氧化能力的基礎方法[22]，趙金偉等[23]用熊果苷和綠原酸純品進行抗氧化能力對照實驗，結果表明熊果苷的清除能力低于綠原酸，這與本研究中熊果苷抗氧化性能力相關性低于綠原酸結論吻合。GALVIS A C等[24]的研究結果認為抗氧化性不是由單一的酚類組分決定的，對自由基的清除可能是酚類物質間協同作用的結果。本研究中在抗氧化活性物質也僅考慮了酚類和黃酮類物質對抗氧化活性的影響，對于‘綠寶石’梨的抗氧化作用，還需要進一步進行探究。

4 結論

‘綠寶石’梨在果實發育期內總酚、總黃酮的含量呈下降的趨勢，以花后50 d的含量最高，在成熟的過程中前期下降迅速，后期下降緩慢，逐漸趨于平穩。熊果苷、綠原酸是‘綠寶石’梨果實中的主要酚類物質；對于DPPH、ABTS自由基的清除能力也隨著果實的成熟呈現下降趨勢，在幼果期顯著高于成熟期。綠原酸、表兒茶素、槲皮葡萄糖苷是在抗氧化過程中比較重要的酚類組分，‘綠寶石’梨具有很好的抗氧化性。