以亞硝酸鹽為電子受體的反硝化聚糖菌培養及特性分析

張勝男,郭海燕,楊雪瑞，龍春水,李金雨

(大連交通大學 環境與化學工程學院，遼寧 大連 116028)*

聚糖菌(Glycogen Accumulating Organisms，GAOs)最早在生物強化除磷(Enhanced Biological Phosphate Removal，EBPR)系統中被發現，這種微生物在厭氧條件下利用體內糖原降解提供的能量及還原力吸收有機物并不釋磷，并以聚β-羥基烷酸酯(poly-β-hydroxy alkanoate，PHA)或者聚β-羥基丁酸酯(poly-β-hydroxy butyrate，PHB)的形式儲存在胞內；好氧條件下，以分解PHA/PHB提供的能量重新合成糖原并不吸磷[1].研究發現，一些聚糖菌在硝酸鹽或亞硝酸鹽存在條件下能發生反硝化反應，這種具有反硝化能力的聚糖菌稱為反硝化聚糖菌(DGAOs)[2-3].DGAOs與反硝化聚磷菌(DPAOs)類似，均能利用內碳源進行反硝化，但兩者主要區別在于吸收有機物的能量來源不同及是否吸磷.雖然DGAOs對除磷沒有貢獻，但能把外碳源轉化為內碳源驅動反硝化脫氮，在處理低碳氮比廢水中利用該特性可以簡化脫氮工藝流程，節省曝氣量，解決污水處理過程中外部碳源缺乏的問題.短程反硝化具有節約碳源、反應速率快、剩余污泥量少等優點.但由于亞硝酸鹽具有穩定性差、生物毒性強等特點，亞硝酸鹽作為電子受體時反硝化除磷效果要差于硝酸鹽為電子受體時的反硝化除磷效果[4]，亞硝酸鹽濃度在一定范圍內時，能取得穩定反硝化除磷效果.張斌等人[5-6]通過厭氧/好氧運行方式在SBR反應器中成功富集了具有典型聚糖特征的顆粒污泥，硝酸鹽氮和亞硝酸鹽氮的反硝化去除率分別達到了65%和70%.賈淑媛等[7]以厭氧/好氧運行方式馴化GAOs，之后分別以 NO2--N 和 NO3--N為電子受體，經過 150 d 厭氧/缺氧運行方式培養后可穩定進行內源反硝化反應，馴化后的 GAOs在常溫下短程內源反硝化速率約為全程內源反硝化速率的 3 倍.

目前，國內外關于 GAOs 的富集培養及反硝化代謝機理的研究尚不完善，對于短程內碳源反硝化的研究相對更少[7-9].本文研究了亞硝酸鹽型反硝化聚糖菌的培養過程，考察了培養方式、馴化時間、亞硝酸鹽濃度對反硝化聚糖菌的影響，分析了內碳源轉化過程，以期為反硝化聚糖菌在污水處理中的應用提供理論依據.

1 實驗部分

1.1 原水水質及接種污泥

實驗采用人工配制模擬污水，以乙酸鈉為有機碳源，KH2PO4為磷源，NH4Cl為氮源，投加MgSO4·7H2O、ZnSO4·7H2O和KI等作為微量元素的來源[4].原水NH4+-N濃度為15 mg/L左右，COD濃度為300 mg/L左右，PO43--P濃度為2mg/L左右，pH范圍在7.0～8.0之間，水溫為25℃.實驗所用污泥為某市污水處理廠二沉池的濃縮污泥，具有一定的脫氮除磷能力，接種后污泥濃度為3 000 mg/L左右.

1.2 實驗裝置及運行方式

如圖1所示，采用序批式反應器(SBR)培養DGAOs，反應器有效容積5L，排水比約為2/5.實驗過程中未進行單獨排泥，根據排水階段出水中的污泥懸浮物濃度，可以計算出反應器污泥齡(SRT)約為34d.SBR反應器每天連續運行4個周期，每個周期為6h.反應器進水、攪拌、加藥、曝氣、沉淀、排水等工序均通過時間控制器進行自動控制.

亞硝酸鹽型DGAOs的培養分為五個階段.第一階段采用厭氧/好氧的運行方式以培養普通GAOs；第二階段采用厭氧/缺氧/好氧的運行方式，目的是初步馴化DGAOs；第三階段采用厭氧/缺氧運行方式，增強DGAOs的反硝化能力；由于第三階段微生物反硝化活性有所下降，第四階段重新恢復厭氧/缺氧/好氧運行方式；第五階段采用厭氧/缺氧兩周期、厭氧/好氧兩周期的運行方式，其目的是在保持系統中GAOs存在的前提下，考察其在缺氧條件下的反硝化效果.

1.3 分析方法

水質指標分析方法參照《水和廢水監測分析方法》[10]，采用納氏試劑分光光度法測定NH4+-N濃度，鉬銻抗分光光度法測定PO43--P濃度，酚二磺酸光度法測定NO3--N濃度，N-(1-萘基)-乙二胺光度法測定NO2--N濃度；COD測定采用微波消解滴定法，胞內聚-β-羥基丁酸(PHB)采用次氯酸鈉法測定，胞內糖原質采用苯酚-硫酸分光光度法測定[11].

2 結果與討論

2.1 亞硝酸鹽型DGAOs的培養過程

2.1.1 厭氧段有機物去除變化

厭氧/好氧(厭氧/缺氧)環境是聚糖菌(反硝化聚糖菌)在活性污泥微生物中成為優勢菌群的重要前提，厭氧階段有機物的去除能夠反映聚糖菌在系統內增殖情況.亞硝酸鹽型DGAOs培養過程進水、出水及厭氧段結束后COD濃度變化,如圖2所示.

在厭氧/好氧、厭氧/缺氧/好氧的前兩個階段，厭氧后混合液內COD持續下降，反映了污泥中聚糖菌活性的恢復和數量增加；第三階段運行方式改為厭氧/缺氧后，厭氧段有機物的去除量出現下降趨勢，出水COD濃度增至70 mg/L左右.其原因可能是好氧條件的缺失使得普通聚糖菌失去聚糖的能力，而適應厭氧/缺氧環境的反硝化聚糖菌數量不足或活性較差；第四階段重新恢復好氧段，厭氧后有機物的去除恢復至第二階段水平，出水 COD濃度穩定在8 mg/L左右；第五階段采用厭氧/缺氧兩周期、厭氧/好氧兩周期的運行方式，厭氧/好氧模式下保持普通聚糖菌的存活，厭氧/缺氧模式考察普通聚糖菌的反硝化性能.從圖2可以看出，第五階段系統穩定后，厭氧/缺氧模式下厭氧后COD濃度約在23 mg/L左右，標明系統內存在適應該環境的聚糖菌.

2.1.2 釋磷和吸磷變化

DGAOs和DPAOs主要區別在于吸收有機物的能量來源及是否釋磷吸磷.在厭氧段DGAOs吸收有機物合成PHB但不釋磷，在缺氧段降解PHB以硝酸鹽或亞硝酸鹽為電子受體進行反硝化脫氮但不吸磷.在對亞硝酸鹽型DGAOs的培養過程中，采用了低含磷污水以減少系統中聚磷菌或反硝化聚磷菌的數量，避免使其成為優勢菌群.培養過程進水、厭氧段后及出水中磷酸鹽濃度變化如圖3所示.在第一階段厭氧/好氧運行方式下，活性污泥表現出了明顯的吸磷釋磷現象，厭氧段結束后磷酸鹽濃度達到10 mg/L，說明接種的污泥中存在大量的聚磷菌；第二階段厭氧/缺氧/好氧運行方式下，隨著運行周期的增加，系統中釋磷量減少；第三階段取消了好氧段后，系統中無明顯的吸磷釋磷現象，磷酸鹽濃度下降至1.4mg/L，在第四、第五階段，釋磷量同樣沒有增加的現象，說明PAOs逐漸被淘汰出系統.

圖3 培養階段進、出水及厭氧后磷酸鹽變化

2.1.3 缺氧段亞硝酸鹽去除變化

培養階段缺氧段亞硝酸鹽去除變化，如圖4所示.在第二、三階段，投加亞硝酸鹽使缺氧段初期亞硝酸鹽濃度約為20 mg/L，可以看出，在系統穩定后缺氧后亞硝酸鹽濃度基本降低為0；在第四階段，缺氧段初期亞硝酸鹽濃度進一步提高至30mg/L，出水亞硝酸鹽濃度大幅度提高至15 mg/L.而后重新將亞硝酸鹽濃度降至25 mg/L，出水亞硝酸鹽的濃度降低至8.5 mg/L；第五階段，在保持進水濃度基本不變的條件下，出水亞硝酸鹽濃度降低至3 mg/L左右.結合前述有機物和磷酸鹽變化分析可以推斷，在第五階段，厭氧段有機物被大量去除，缺氧段硝酸鹽濃度下降且沒有出現吸磷現象，說明反應器里已成功富集了亞硝酸鹽型DGAOs.

圖4 培養階段缺氧段NO2--N變化

賈淑媛等人采用厭氧/好氧培養GAOs，采用厭氧/缺氧的培養方式成功馴化出以亞硝酸鹽為電子受體的DGAOs，電子受體亞硝酸鹽濃度為20mg/L[7].本系統中確定的亞硝酸鹽氮最大耐受濃度約為25 mg/L，亞硝酸鹽濃度提高至30 mg/L時出現微生物受抑制現象.但和文獻報道不同[5,7]，本研究中培養模式由厭氧/缺氧/好氧模式變為完全厭氧/缺氧模式后，系統反硝化效果惡化.推測培養的DGAOs是一類具有反硝化能力的GAOs，長期保持厭氧/缺氧模式會使其失去聚糖能力，從而無法利用內碳源進行脫氮，厭氧/好氧交替環境的存在是GAOs在好氧環境變為缺氧環境時具備反硝化能力的前提.有研究表明，并不是 GAOs 的所有分支都具有反硝化功能，Competibacter 包含的 7 個進化分支(GB1～GB7)中，GB1、GB4、GB5 具有以硝酸鹽氮作為電子受體的反硝化功能，而 GB6 的反硝化功能以硝酸鹽氮和亞硝酸鹽氮作為電子受體，GB3、GB7 則沒有反硝化功能[12-13].

2.2 亞硝酸鹽型反硝化聚糖菌的特性

2.2.1 典型周期各指標變化

在第五階段，跟蹤考察了厭氧/缺氧條件下亞硝酸鹽型DGAOs系統單個周期中各指標變化，如圖5所示.在厭氧段，亞硝酸鹽型DGAOs吸收有機物合成內碳源，混合液中COD濃度由151.3mg/L迅速下降至8 mg/L；由于微量聚磷菌的存在，磷酸鹽濃度略微上升；在缺氧階段，COD濃度基本保持不變，磷酸鹽濃度略有下降.缺氧階段初期亞硝酸鹽濃度25 mg/L，在反應30 min后迅速下降至6.5 mg/L，之后的180 min內緩慢降至1.7 mg/L，反硝化率達到93.3%，反應速率和反硝化去除率均高于文獻報道[5,7].作者在對硝酸鹽型反硝化聚糖菌的研究中發現，進水中有機物的濃度會影響內碳源的合成，進水C/N比為6.7時內碳源反硝化率最高，進水C/N比過大，厭氧階段有機物不能被完全吸收，缺氧階段就會出現常規外碳源反硝化的現象[14].另一方面，進水C/N比過小，則會導致厭氧階段微生物合成PHB所需的內碳源不足[15].本實驗中缺氧段C/N比約為6時未出現碳源過剩或不足情況，內碳源反硝化效果良好.

圖5 亞硝酸鹽型內碳源反硝化典型周期內各指標變化情況

2.2.2 典型周期內碳源轉化情況

圖6為典型周期內亞硝酸鹽型DGAOs內碳源轉化情況.在厭氧階段，微生物胞內PHB含量由28.1 mg/(g·MLSS)升高至53.9 mg/(g·MLSS)；在缺氧階段，糖原濃度由23.1 mg/L升高至43.2 mg/L.可以計算，亞硝酸鹽型DGAOs每消耗1 mg/L的COD合成PHB量為0.2 mg/(g·MLSS)，每消耗1 mg/(g·MLSS)的PHB合成糖原量為0.7 mg/(g·MLSS).結合典型周期中磷酸鹽、亞硝酸鹽的去除可知，在外碳源缺乏的條件下，亞硝酸鹽型DGAOs可利用儲存的PHB作為能源物質驅動反硝化反應.在厭氧階段亞硝酸鹽型DGAOs降解糖原所產生的能量主要用于吸收COD并儲存PHB，在缺氧階段降解PHB所產生的能量，一部分用于DGAOs以亞硝酸鹽為電子受體進行反硝化反應，一部分用于合成糖原.

圖6 亞硝酸鹽型內碳源反硝化典型周期內內碳源轉化情況

3 結論

(1)經過約90天360個周期的培養，馴化出以亞硝酸鹽為電子受體的亞硝酸鹽型DGAOs，耐受亞硝酸鹽氮濃度為25 mg/L.馴化的亞硝酸鹽型DGAOs是具有反硝化能力的一種GAOs，在長期厭氧/缺氧交替環境中會失去聚糖能力，無法利用內碳源進行脫氮；

(2)在進水C/N比為6的條件下，厭氧階段COD濃度由151.3 mg/L降至8.1 mg/L，COD的去除率達94.9%；在缺氧階段NO2--N濃度由25.3 mg/L降至1.7 mg/L，NO2--N的去除率達到93.3%；

(3)馴化后的亞硝酸鹽型DGAOs在厭氧階段快速吸收COD并儲存PHB，在缺氧階段降解PHB并合成糖原.每消耗1 mg/L的COD合成PHB量為0.2 mg/(g·MLSS)，每消耗1 mg/(g.MLSS)的PHB合成糖原量為0.7 mg/(g·MLSS).