ctDNA對肝細胞肝癌患者根治性肝切除術后短期復發(fā)的預測價值

陳延華，鄧凱文

肝細胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）大約占原發(fā)性肝癌的85%～90%，具有極高的復發(fā)率、轉(zhuǎn)移率，患者整體預后較差［1］。根治性肝切除術（pancreatico－duodenectomy，PD）是HCC治療的首選方法，但術后復發(fā)率高，尤其是2年內(nèi)的早期復發(fā)對治療效果造成嚴重影響，可直接縮短患者術后長期生存時間［2，3］。血漿循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）是一種攜帶腫瘤特異性基因組改變的腫瘤標志物，被廣泛應用于多種腫瘤診斷和預后生物標志物的研究［4］。該研究通過分析ctDNA對HCC患者根治性肝切除術后短期復發(fā)的預測價值，旨在為術后肝癌患者篩查、診斷、治療提供指導。

1 資料與方法

1.1 一般資料回顧性分析2017年1月—2019年1月行根治性肝切除術的208例HCC患者的臨床資料，納入標準：（1）接受根治性肝切除術治療；（2）術前未發(fā)現(xiàn)遠處轉(zhuǎn)移；（3）心、肺、腎功能良好，能夠耐受手術；（4）術后病理確診為HCC；（5）肉眼所見腫瘤被完整切除，且切緣無殘余癌。排除標準：（1）無法耐受手術；（2）手術前進行其他抗癌治療；（3）圍手術期死亡。208例HCC患者中，男162例，女46例；年齡20～78歲，平均（53.91±8.24）歲。選取正常人群85例作為對照，男59例，女26例；年齡22～79歲，平均（54.12±8.37）歲。2組性別、年齡等資料比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

1.2 方法術后抽取患者肘靜脈血10 ml用以檢測ctDNA表達，具體步驟如下：（1）離心分離血漿備用；（2）采用DNA抽提試劑盒提取ctDNA，操作嚴格按說明書進行；（3）使用試劑盒將打斷后的DNA進行文庫構(gòu)建，PCR擴增文庫；（4）測序獲取全基因組長度；（5）Blast比對，進行CNVs分析，計算ctDNA含量，以健康人群ctDNA百分含量做參照，設定以ctDNA含量＜0.1%為陰性，ctDNA含量≥0.1%為陽性。

1.3 隨訪患者手術出院后采用門診隨訪進行觀察，隨訪截止至2019年2月或患者死亡，檢查患者肝功能、CT明確患者腫瘤是否復發(fā)以及發(fā)生肝外轉(zhuǎn)移，具體方案為：術后3個月，每月來院復查1次，術后6個月，每3個月來院復查1次，術后1年，每6個月復查1次。

1.4 觀察指標（1）比較ctDNA在肝癌組和對照組中的表達差異，根據(jù)隨訪結(jié)果將肝癌組患者分為復發(fā)組（肝內(nèi)復發(fā)、肝外轉(zhuǎn)移）和非復發(fā)組，其中復發(fā)組患者復發(fā)時間≤6個月納入短期復發(fā)組，復發(fā)時間＞6個月納入非短期復發(fā)組；（2）比較不同組別肝癌組織中ctDNA陽性表達率的差異；（3）分析患者性別分布、年齡、肝功能Child分級、腫瘤直徑、腫瘤數(shù)目、血清肝炎病毒標志物、門靜脈癌栓、包膜完整、分化程度以及ctDNA表達與HCC患者根治性肝切除術后腫瘤短期復發(fā)的關系。

1.5 統(tǒng)計學分析應用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，計數(shù)資料以［n（%）］表示，行χ2檢驗；ctDNA表達及其與臨床病理特征關系比較采用χ2檢驗，將所有可能的危險因素進行多因素Logistic回歸分析；生存情況應用Kaplan－Meier生存分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 隨訪結(jié)果術后對208例HCC患者進行隨訪5～86個月，中位隨訪時間39個月，至隨訪終止，133例患者確診為HCC復發(fā)轉(zhuǎn)移（復發(fā)組），占63.94%，其中短期復發(fā)（短期復發(fā)組）占30.83%（41/133），非短期復發(fā)（非短期復發(fā)組）占69.17%（92/133），75例無復發(fā)（非復發(fā)組），占36.06%。短期復發(fā)組中肝外轉(zhuǎn)移占36.59%（15/41），高于非短期復發(fā)組的15.12%（14/92），差異有統(tǒng)計學意義（χ2=7.595，P=0.006）。隨訪終止時死亡102例，死因與HCC復發(fā)轉(zhuǎn)移相關占93.14%（95/102），與肝病相關占4.90%（5/102），其他因素占1.96%（2/102），短期復發(fā)組病死率為90.24%（37/41），高于非短期復發(fā)組的66.30%（61/92），差異有統(tǒng)計學意義（χ2=8.382，P=0.004）。

2.2 ctDNA在HCC中的表達情況肝癌組ctDNA陽性表達151例，占72.60%（151/208），對照組均不表達ctDNA，2組陽性表達率比較，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=127.325，P＜0.001）。復發(fā)組陽性表達99例，占74.44%（99/133），非復發(fā)組陽性表達52例，占69.33%（52/75），2組比較差異無統(tǒng)計學意義（χ2=0.628，P=0.428）。短期復發(fā)組陽性表達率為87.80%（36/41），高于非短期復發(fā)組的68.48%（63/92），差異有統(tǒng)計學意義（χ2=5.567，P=0.018）。

2.3 HCC患者術后腫瘤短期復發(fā)與臨床病理特征比較腫瘤直徑＞5 cm、腫瘤數(shù)目多個、門靜脈有癌栓、包膜不完整、低中分化以及ctDNA表達陽性患者術后腫瘤短期復發(fā)率明顯升高（P＜0.05）。見表1。

表1 HCC患者根治性肝切除術后腫瘤短期復發(fā)與臨床病理特征比較

續(xù)表1

2.4 影響HCC患者術后腫瘤短期復發(fā)的多因素Logistic回歸分析以根治性肝切除術后腫瘤短期復發(fā)為因變量（1=復發(fā)，0=無復發(fā)），將單因素分析中可能的危險因素（腫瘤直徑＞5 cm、腫瘤數(shù)目多個、門靜脈有癌栓、包膜不完整、低中分化以及ctDNA表達陽性）全部納入作為自變量，多因素Logistic回歸分析結(jié)果顯示，腫瘤直徑＞5 cm、門靜脈有癌栓、低中分化以及ctDNA表達陽性是影響根治性肝切除術后腫瘤短期復發(fā)的獨立危險因素（P＜0.05）。見表2。

表2 影響HCC患者根治性肝切除術后腫瘤短期復發(fā)的多因素Logistic回歸分析

2.5 ctDNA表達與術后短期復發(fā)HCC患者生存情況關系Kaplan－Meier生存分析結(jié)果顯示，ctDNA陽性表達組短期復發(fā)HCC患者生存時間為3.71個月（95%CI：3.30，4.12），ctDNA陰性表達組短期復發(fā)HCC患者生存時間為5.64個月（95%CI：5.44，5.85），ctDNA陽性表達組短期復發(fā)HCC患者生存時間與ctDNA陰性表達組短期復發(fā)HCC患者比較，差異有統(tǒng)計學意義（Log－rankχ2=7.622，P=0.006）。見圖1。

圖1見封三。

圖1 ctDNA表達與根治性肝切除術后短期復發(fā)HCC患者生存情況關系

3 討論

HCC是全球癌癥死亡的主要原因，多數(shù)患者確診時已處于晚期肝纖維化和肝硬化狀態(tài)，盡管根治性肝切除術可取得良好的治愈效果，但患者預后仍然較差，術后患者早期復發(fā)率較高，長期生存時間不盡滿意［5－8］。因此、早期診斷、治療、療效預測以及改善患者預后，對延長患者長期生存時間、提高整體生活質(zhì)量有重要意義。近年來研究發(fā)現(xiàn)，檢測血液中ctDNA在腫瘤診斷、治療以及預后評估等方面發(fā)揮重要作用［9］。利用ctDNA篩選基因突變具有較高的敏感性和特異性，ctDNA分析可準確判斷腫瘤進展、預后以及輔助靶向治療［10］。Olsson等［11］研究顯示，ctDNA是原發(fā)性乳腺癌預后不良的預測因素，對ctDNA進行監(jiān)測可以預測幾個月到幾年的臨床轉(zhuǎn)移，檢測ctDNA在原發(fā)性乳腺癌中具有較好的應用前景。Chaudhuri等［12］報道指出，ctDNA是早期發(fā)現(xiàn)局限性肺癌術后殘留病灶的生物標志物，能夠可靠地鑒別復發(fā)的高危患者，有利于指導臨床制定治療策略。Xu等［13］報道認為，HCC腫瘤DNA與匹配的血漿ctDNA甲基化標志物高度相關，可有效預測患者預后和生存率預后。

該研究結(jié)果顯示，短期復發(fā)患者占全部復發(fā)患者的30.83%，但90.24%患者在隨訪期內(nèi)死亡，表明6個月作為短期復發(fā)時間可較早反映患者預后情況。該研究結(jié)果還顯示，對照組患者均未檢測出ctDNA表達，短期復發(fā)組ctDNA陽性表達率87.80%明顯高于非短期復發(fā)組的68.48%，且HCC患者根治性肝切除術后腫瘤短期復發(fā)率與患者腫瘤直徑、腫瘤數(shù)目、門靜脈癌栓、包膜完整、分化程度以及ctDNA表達明顯相關，表明ctDNA預測疾病復發(fā)具有較高的特異性、敏感性，可能與HCC患者根治性肝切除術后腫瘤短期復發(fā)有關。進一步多因素Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)，患者腫瘤直徑＞5 cm、門靜脈有癌栓、低中分化以及ctDNA表達陽性是影響根治性肝切除術后腫瘤短期復發(fā)的獨立危險因素，表明ctDNA表達陽性患者具有更高的腫瘤復發(fā)率，可作為預測HCC患者根治性肝切除術后腫瘤短期復發(fā)的重要指標。通過Kaplan-Meier生存分析結(jié)果顯示，ctDNA陽性表達組短期復發(fā)HCC患者生存時間為3.71個月（95%CI：3.30，4.12），ctDNA陰性表達組短期復發(fā)HCC患者生存時間為5.64個月（95%CI：5.44，5.85），ctDNA陽性表達組短期復發(fā)HCC患者生存時間明顯短于ctDNA陰性表達組短期復發(fā)HCC患者，進一步表明ctDNA表達陽性短期復發(fā)HCC患者生存預后更差，檢測ctDNA表達可作為術后輔助治療的依據(jù)。檢測ctDNA表達可實時追蹤腫瘤進展，有效識別患者體內(nèi)微小殘留病灶以及疾病休眠，因此，ctDNA可作為HCC患者根治性肝切除術后腫瘤短期復發(fā)的重要預測指標［14，15］。總之，ctDNA在HCC中具有良好的應用前景，檢測術后患者ctDNA表達以及研究其與預后的關系，值得更多學者深入探究，ctDNA作為精準、無創(chuàng)的檢測手段，或可在HCC各個臨床階段發(fā)揮作用。

綜上所述，肝癌組織中ctDNA陽性表達率明顯升高，ctDNA是預測HCC患者根治性肝切除術后腫瘤短期復發(fā)的獨立危險因素，ctDNA陽性表達短期復發(fā)患者生存時間明顯短于ctDNA陰性表達患者，根治性肝切除術后對ctDNA進行監(jiān)測有助于早期鑒別高危患者，進而予以個性化治療以延長患者生存時間，改善患者生活質(zhì)量，提高治愈率。但該研究所收集樣本例數(shù)受限，所得到的結(jié)論有待進行深入研究佐證。