帕金森病病人血清miR-543-3p、miR-124表達與IGF-1、BDNF、NGF水平的相關性

趙 利，李海燕，王書霞

帕金森病(Parkinson′s disease，PD)是臨床常見的一種神經系統退變性疾病，調查顯示PD病人伴有輕度認知功能障礙，神經元損傷可造成認知功能損害，隨著疾病進展可發展為帕金森病癡呆[1-3]。因此，探尋PD發生及發展相關的基因或蛋白有助于減緩疾病進展。有研究表明，微小RNA-543-3p(microRNA-543-3p，miR-543-3p)在PD小鼠模型中表達上調，但關于其作用機制尚未闡明[4]。相關報道指出，微小RNA-124(microRNA-124，miR-124)在PD病人中呈低表達，并可能作為PD治療的潛在生物標志物[5]。有研究表明，胰島素樣生長因子1(insulin like growth factor-1，IGF-1)、腦源性神經營養因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF)、神經生長因子(nerve growth factor，NGF)水平降低與認知功能障礙密切相關[6]。本研究以PD病人為觀察對象，檢測血清miR-543-3p、miR-124的表達水平，探究其與PD發生、發展及IGF-1、BDNF、NGF水平的相關性，為揭示PD發生發展的分子機制奠定理論基礎。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2017年5月—2018年5月本院收治的PD病人80例為PD組，所有病人均符合PD診斷標準[7]。其中，男46例，女34例，年齡(63.54±9.58)歲。收集同期本院體檢中心的健康志愿者50名為對照組，其中男27名，女23名，年齡(64.32±8.95)歲。兩組一般資料比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。納入標準：臨床資料完整；未合并高血壓、糖尿病等疾病者。排除標準：心、肺、腎等臟器嚴重損傷；合并全身感染性疾病；阿爾茨海默?。谎苄园V呆；心、肺等導致的認知功能障礙；焦慮、抑郁等心理疾病；意識障礙。根據Hoehn-Yahr分級標準[8]對PD病人進行評分，將病人分為1期16例，2期24例，3期13例，4期15例，5期12例。帕金森評定量表(UPDRS)評分標準：0～<50分為輕度；50～<100分為中度；100～199分為重度[9]，根據UPDRS評分標準將PD病人分為輕度27例、中度31例、重度22例。根據蒙特利爾認知評估量表(Montreal Cognitive Assessment，MoCA)將PD病人分為輕度認知功能障礙(PD-MCI)33例，無認知功能障礙(PD-NCI)47例。MoCA評分≥26分為認知功能正常，MoCA評分<26分為認知功能障礙[10]。本研究經本院倫理委員會批準，所有研究對象簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 采集血液樣本 所有研究對象均采集清晨空腹靜脈血5 mL，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，吸取血清放入EP管內，置于-80 ℃超低溫冰箱內保存。

1.2.2 實時熒光定量聚合酶鏈反應(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)檢測miR-543-3p、miR-124的表達水平 根據Trizol試劑盒(美國Invitrogen公司)說明書提取血清中的總RNA，應用Nanodrop2000c超微量分光光度計檢測RNA濃度與純度，RNA OD260/OD280為1.8～2.0。參照反轉錄試劑盒說明書(北京天根生化科技有限公司生產)將總RNA合成cDNA，miR-543-3p正向引物5′-ATTCGCGGTGCACTTCTTTT-3′，反向引物5′-GCATCGACT AGCTGGCATC-3′；miR-124正向引物5′-CCTGGTATCCACTGTAGGCC-3′，反向引物5′-TCAGCTCAGCATCGACTAGG-3′；U6正向引物5′-GCTTCGGCAGCA CATATACT-3′，反向引物5′-GTGCAGGGTCCGAGGTATTC-3′，引物由上海生工生物工程股份有限公司設計合成。以cDNA進行qRT-PCR反應(北京天根生化科技有限公司)，擴增反應體系：SYBR Green Master Mix 10 μL，正反向引物0.8 μL，cDNA 2 μL，雙蒸水(ddH2O)補足體系至20 μL；反應條件：95 ℃、2 min，95 ℃、15 s，60 ℃、30 s，72 ℃、30 s，共40次循環。miR-543-3p、miR-124以U6為內參，采用2-ΔΔCt法計算miR-543-3p、miR-124相對表達量。

1.2.3 酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測血清IGF-1、BDNF、NGF水平 采用ELISA法檢測血清IGF-1、BDNF、NGF水平，檢測試劑盒購自南京建成生物研究所，嚴格按照試劑盒說明書進行檢測。

2 結 果

2.1 PD組與對照組血清miR-543-3p、miR-124表達水平比較 與對照組比較，PD組血清miR-543-3p表達水平明顯升高(P<0.05)，miR-124表達水平明顯降低(P<0.05)。詳見表1。

表1 PD組與對照組血清miR-543-3p、miR-124表達水平比較(±s)

2.2 不同Hoehn-Yahr分期PD病人血清miR-543-3p、miR-124表達水平比較 與1期、2期比較，3期、4期、5期PD病人血清miR-543-3p的表達水平明顯升高(P<0.05)，miR-124的表達水平明顯降低(P<0.05)；與3期比較，4期、5期PD病人血清miR-543-3p的表達水平明顯升高(P<0.05)，miR-124的表達水平明顯降低(P<0.05)；與4期比較，5期PD病人血清miR-543-3p的表達水平明顯升高(P<0.05)，miR-124的表達水平明顯降低(P<0.05)。詳見表2。

表2 不同Hoehn-Yahr分期PD病人血清miR-543-3p、miR-124表達水平比較(±s)

2.3 不同UPDRS評分組PD病人血清miR-543-3p、miR-124表達水平比較 與輕度組比較，中度組、重度組血清miR-543-3p的表達水平明顯升高(P<0.05)，miR-124的表達水平明顯降低(P<0.05)；與中度組比較，重度組血清miR-543-3p的表達水平明顯升高(P<0.05)，miR-124的表達水平明顯降低(P<0.05)。詳見表3。

表3 不同UPDRS評分組PD病人血清miR-543-3p、miR-124表達水平比較(±s)

2.4 PD組與對照組血清IGF-1、BDNF、NGF水平比較 與對照組比較，PD組血清IGF-1、BDNF、NGF水平明顯降低(P<0.05)。詳見表4。

表4 PD組與對照組血清IGF-1、BDNF、NGF水平比較(±s) 單位：ng/mL

2.5 PD病人血清miR-543-3p、miR-124與IGF-1、BDNF、NGF水平的相關性分析 采用Pearson法分析PD病人血清miR-543-3p、miR-124與IGF-1、BDNF、NGF水平的相關性，結果顯示，miR-543-3p與IGF-1、BDNF、NGF呈負相關(P<0.05)，miR-124與IGF-1、BDNF、NGF呈正相關(P<0.05)。詳見表5。

表5 PD病人血清miR-543-3p、miR-124與IGF-1、BDNF、NGF水平的相關性

2.6 PD-MCI組與PD-NCI組血清miR-543-3p、miR-124表達水平比較 與PD-NCI組比較，PD-MCI組血清miR-543-3p的表達水平明顯升高(P<0.05)，miR-124的表達水平明顯降低(P<0.05)。詳見表6。

表6 PD-MCI組與PD-NCI組血清miR-543-3p、miR-124表達水平比較(±s)

3 討 論

miRNA可通過調控下游靶基因表達從而參與神經系統性疾病等多種疾病發生及發展過程，研究表明miR-543-3p表達上調可促進炎癥性疾病及膀胱癌等多種疾病發生及發展[11-13]。本研究結果顯示，PD病人血清miR-543-3p的表達水平明顯升高，隨著Hoehn-Yahr分級、UPDRS評分的增高，血清miR-543-3p的表達水平明顯升高，提示miR-543-3p表達上調可能促進PD發生及發展，并可能在PD發生發展過程中發揮重要調控作用。miR-124表達上調可促進PD小鼠神經元細胞增殖[14]。miR-124在PD小鼠模型中表達下調，并可在炎癥反應中發揮重要調控作用[15-16]。本研究結果顯示，PD病人血清miR-124的表達水平明顯降低，隨著Hoehn-Yahr分級、UPDRS評分的增高，血清miR-124的表達水平明顯降低，提示miR-124表達量降低與PD疾病進展密切相關，并可在PD發生及發展過程中發揮重要調控作用。血清學生物標記物廣泛應用于認知水平評估，IGF-1屬于多功能細胞增殖調控因子，并可促進細胞增殖、分化等，中樞神經系統的膠質細胞與神經元可分泌IGF-1，若病人腦組織損傷發生時IGF-1水平降低。BDNF屬于神經營養因子家族成員并可保護神經元存活及生長，腦組織中BDNF表達水平升高可反映神經細胞修復能力增強。NGF屬于神經營養因子并可促進神經元生長發育，其表達量減少預示腦神經系統的損傷[17-18]。本研究結果顯示，PD病人血清IGF-1、BDNF、NGF水平明顯降低，與上述研究結果相似，提示PD病人伴有認知功能損傷。本研究采用Pearson法檢測PD病人血清miR-543-3p、miR-124表達與IGF-1、BDNF、NGF的相關性，結果顯示，miR-543-3p與IGF-1、BDNF、NGF呈負相關，miR-124與IGF-1、BDNF、NGF呈正相關，說明隨著miR-543-3p表達量升高與miR-124表達量降低PD病人認知水平明顯降低，提示miR-543-3p、miR-124表達異常可能與PD病人認知功能密切相關。研究表明，PD病人認知損害發生率較高且已威脅人類生命安全[19]。本研究結果顯示，PD-MCI組血清miR-543-3p的表達水平明顯高于PD-NCI組，血清miR-124的表達水平明顯低于PD-NCI組，說明PD認知功能障礙病人miR-543-3p表達上調、miR-124表達下調。提示miR-543-3p、miR-124可能成為診斷PD病人認知功能障礙的重要指標。

綜上所述，PD病人血清miR-543-3p的表達水平明顯升高，miR-124的表達水平明顯降低，并可參與PD發生及發展過程，其表達量與IGF-1、BDNF、NGF水平密切相關，可作為判斷PD疾病進展及評估病人認知水平的重要輔助指標。