秋茄葉片愈傷組織褐變研究

池上評

摘要?[目的]建立紅樹秋茄的愈傷組織體系，為實現(xiàn)秋茄種質資源離體保存及其多樣性研究提供科學依據(jù)。[方法]以紅樹林秋茄幼嫩葉片作為外植體，研究2，4-D和6-BA不同濃度配比下秋茄葉片愈傷組織的誘導率，以及不同激素水平對秋茄葉片和愈傷組織褐變情況的影響。[結果]2，4-D對秋茄葉片愈傷組織形成是必需的，添加一定量的6-BA有助于提高愈傷組織誘導率，最佳激素配比為MS+1.0 mg/L 2，4-D+1.0 mg/L 6-BA，誘導率最高，達35.0%;秋茄葉片和愈傷組織均有褐變現(xiàn)象發(fā)生，21 d內，褐變率達33.3%～45.0%。[結論]初步明確了秋茄葉片愈傷組織的誘導條件及褐變影響因素。

關鍵詞?秋茄;愈傷組織;繼代培養(yǎng);褐變

中圖分類號?S792.99?文獻標識碼?A?文章編號?0517-6611（2021）09-0130-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.09.033

Abstract?[Objective] To establish the callus system of Kandelia candel and provide scientific basis for in vitro conservation and diversity research of Kandelia candel germplasm resources. [Method] Taking young leaves of Kandelia candel as explants， the callus induction rate of Kandelia candel leaves under different concentrations of 2，4-D and 6-BA， and the effects of different hormone levels on the browning situation of Kandelia candel leaves and callus were studied. [Result] 2，4-D was necessary for callus formation of Kandelia candel leaves. Adding a certain amount of 6-BA was helpful to improve the callus induction rate. The best hormone ratio was MS+1.0 mg/L 2，4-D+1.0 mg/L 6-BA， and the induction rate was up to 35.0%. The leaves and callus of Kandelia candel had browning phenomenon， and the browning rate reached 33.3% - 45.0% within 21 days. [Conclusion] The callus induction conditions and browning influencing factors of Kandelia candel leaves were preliminarily determined.

Key words?Kandelia candel;Callus;Subculture;Browning

紅樹林是我國東南沿海的木本植物群落，對調節(jié)全球的氣候變化具有重要意義[1-2]，又因其有著豐富的生物量而具有巨大的生態(tài)價值[3-4]。同時，完整的紅樹林不僅可以為人類提供良好的游憩場所，還是一個藥源寶庫，因此具有很高的社會價值和經(jīng)濟價值[5-6]。秋茄（Kandelia candel）是紅樹林的主要造林樹種[6]，具有重要的生態(tài)保護價值。目前，秋茄的自然分布北界位于福建北部（27°20′N），浙江溫州有少量人工栽培[7-9]。秋茄一般采用胚軸（胎生苗）直接插植進行繁殖，不僅繁殖方式單一，還存在繁殖周期較長、效率低、可控性差、人工移植成活率低、成本高及不易大面積推廣等問題。隨著組織培養(yǎng)技術在林業(yè)上的應用[10]，研究如何利用這一技術來解決秋茄擴大繁殖具有重要意義。目前，關于秋茄組織培養(yǎng)的報道較少，黃有軍[11]以秋茄頂芽和幼葉為外植體研究了光照和黑暗條件下，不同激素配比對愈傷組織形成的影響，結果表明，外源生長素對秋茄的幼葉愈傷組織形成是必需的，1 mg/L 2，4-D 或≥4 mg/L NAA 對愈傷組織形成有較好作用。筆者通過建立紅樹秋茄的愈傷組織體系，研究最佳誘導激素配比及褐變影響因素，旨在為深入保護和開拓紅樹林植物種質資源的遺傳多樣性以及保護紅樹林資源、促進紅樹林生態(tài)環(huán)境的良性循環(huán)提供理論依據(jù)。

1?材料與方法

1.1?材料

以福建省晉江坫頭國有防護林場紅樹植物秋茄幼葉作為外植體進行組織培養(yǎng)。

1.2?方法

1.2.1?秋茄愈傷組織形成。

挑選新鮮外植體，取嫩葉，在洗潔精溶液中浸泡5 min，自來水沖洗2 h，在無菌條件下將外植體置于75%乙醇浸泡30 s，無菌水沖洗1次;然后用0.2%HgCl2溶液消毒8 min，無菌水漂洗4～5次，切取約9 cm2葉塊接種在不同激素配比的培養(yǎng)基上進行愈傷組織誘導。定期觀察葉片愈傷組織的誘導與生長情況。

1.2.2?不同激素配比對秋茄愈傷組織形成的影響。

以MS為基本培養(yǎng)基，分別添加不同濃度的外源生長素2，4-D、細胞分裂素6-BA進行激素配比完全試驗（表1），其中，pH為5.8，于25 ℃完全黑暗條件下培養(yǎng)。每處理接種20瓶。培養(yǎng)20、30、40 d后，觀察記錄愈傷形成情況，并記錄葉片誘導數(shù)，計算誘導率。

誘導率=誘導出愈傷組織的瓶數(shù)/接種數(shù)×100%

1.2.3?不同激素水平下秋茄葉片褐變現(xiàn)象觀察。

用秋茄葉片進行愈傷組織誘導試驗，選取其中1組作為秋茄葉片褐變現(xiàn)象觀察材料，并定期觀察秋茄葉片的褐變現(xiàn)象，4種不同激素配比為

A1：MS+0.5 mg/L 2，4-D+0 mg/L 6-BA;

A2：MS+0.5 mg/L 2，4-D+1.0 mg/L 6-BA;

A3：MS+0.5 mg/L 2，4-D+2.0 mg/L 6-BA;

A4：MS+0.5 mg/L 2，4-D+4.0 mg/L 6-BA。

1.2.4?不同激素水平下秋茄愈傷組織褐變現(xiàn)象觀察。

不同激素水平下，對已經(jīng)繼代4次的秋茄愈傷組織進行植物器官組織誘導，定期觀察愈傷組織褐變現(xiàn)象。每處理接15瓶，每瓶接2～3個愈傷團，培養(yǎng)基設置為

B1：MS+2.0 mg/L 2，4-D+0 mg/L 6-BA;

B2：MS+2.0 mg/L 2，4-D+1.0 mg/L 6-BA;

B3：MS+2.0 mg/L 2，4-D+2.0 mg/L 6-BA;

B4：MS+2.0 mg/L 2，4-D+4.0 mg/L 6-BA。

1.3?培養(yǎng)條件

溫度為（25±2） ℃，相對濕度保持在70%～80%，光強為1 000～1 500 lx，光照12 h/d。

1.4?數(shù)據(jù)統(tǒng)計

采用Excel軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

2?結果與分析

2.1?秋茄愈傷組織形成情況

經(jīng)觀察，接種20 d 后在切口處可見少量愈傷組織，呈淡綠色;30 d 左右愈傷組織逐漸明顯，形態(tài)松散，呈淡黃色;40 d左右愈傷組織呈淡黃色，且不再擴大;約60 d呈黃褐色。

2.2?不同激素配比對秋茄愈傷組織形成的影響

由表1可知，2，4-D能誘導秋茄愈傷組織的形成，添加6-BA 后，誘導率有一定程度的提高，且隨著2，4-D濃度的升高，誘導率呈先升高后下降趨勢，當2，4-D濃度為1.0 mg/L時，誘導率最高，而2，4-D濃度為2.0 mg/L時，誘導率反而下降。綜合來看，以處理B11（MS+1.0 mg/L 2，4-D+1.0 mg/L 6-BA）的誘導率最高，達35.0%，其次為處理⑩，誘導率為25.0%。

2.3?不同激素水平下秋茄葉片褐變情況

在不同激素水平條件下，誘導秋茄葉片愈傷組織過程中，葉片褐變先從外植體的切口開始，并逐漸向外植體中心部位蔓延，最后外植體呈腐熟狀。由表2可知，4種處理方法均引起秋茄葉片的褐變，在外植體移入培養(yǎng)皿初期，秋茄葉片褐變速率較快，隨后逐漸減慢。秋茄葉片的褐變率都相對較高，在第21天，A1和處理A3達到40%，A2和A4達到45%。

經(jīng)方差分析可知，不同處理對秋茄葉片的褐變作用差異顯著（P<0.05），不同培養(yǎng)時間對秋茄葉片的褐變作用差異極顯著（P<0.01）。

2.4?不同激素水平下秋茄愈傷組織褐變情況

從圖1可見，在不同激素水平條件下，誘導秋茄愈傷組織形成器官的過程中，秋茄愈傷組織與培養(yǎng)基接觸部分先出現(xiàn)褐變，并向其他部位蔓延，直至整團愈傷組織全部褐變。

由表3可知，4種處理均會引起秋茄愈傷組織的褐變，在愈傷組織移入培養(yǎng)皿初期，褐變速率較快，而后逐漸減慢，愈傷組織的褐變率都相對較高，在第21天，B1、B2和B3均達到40.0%，B4達到33.3%。經(jīng)方差分析，不同激素濃度處理對秋茄愈傷組織的褐變作用差異顯著（P<0.05），不同培養(yǎng)時間對秋茄愈傷組織的褐變作用差異極顯著（P<0.01）。

3?結論與討論

3.1?秋茄愈傷組織形成條件

該試驗表明，幼葉可以作為紅樹秋茄組織培養(yǎng)的外植體，同時，在挑選外植體材料時盡量選取葉片幼嫩部位，且無機械損傷，防止消毒劑傷害外植體細胞，導致其在誘導愈傷過程中發(fā)生褐變。

3.2?外源物質對秋茄愈傷組織形成的影響

該研究結果表明，外源生長素對秋茄幼葉愈傷組織的形成是必需的，這與馬麗等[12]的研究結果一致。筆者通過篩選，得到葉片愈傷組織的誘導最佳激素配比為MS+1.0 mg/L 2，4-D+1.0 mg/L 6-BA，即當2，4-D 濃度在1.0 mg/L 時有較高的愈傷組織誘導率，添加一定量的6-BA 有助于提高愈傷組織誘導率，但過高的6-BA 則抑制愈傷組織的發(fā)生。據(jù)報道[13-15]，外源物質活性炭在組培技術上具有廣泛的應用，特別是用活性炭來預防外植體褐變的發(fā)生具有重要作用[16]，這有待于今后進行進一步研究。

3.3?秋茄組織培養(yǎng)過程中葉片和愈傷組織褐變原因

該試驗結果表明，在秋茄葉片愈傷的誘導和愈傷組織繼代的過程中均會發(fā)生褐變，且褐變率均較大。總體來看，褐變是阻礙秋茄組織培養(yǎng)技術發(fā)展的一大難題。該研究表明，選用較嫩部位進行培養(yǎng)可有效減少褐變的發(fā)生，選取秋茄次生物質含量較少的部位也可有效降低褐變率。有研究表明，在進行愈傷組織誘導器官試驗時，使用繼代次數(shù)較低的愈傷組織可降低褐變的發(fā)生。

參考文獻

[1] 張再旺，李甲亮，隋濤，等.中國紅樹林濕地有機污染物研究進展[J].生態(tài)科學，2017，36（5）：232-240.

[2] 陳小勇，林鵬.我國紅樹林對全球氣候變化的響應及其作用[J].海洋湖沼通報，1999（2）：11-17.

[3] 林益明，林鵬.中國紅樹林生態(tài)系統(tǒng)的植物種類、多樣性、功能及其保護[J].海洋湖沼通報，2001（3）：8-16.

[4] JAKOVAC C C，LATAWIEC A E，LACERDA E，et al.Costs and carbon benefits of mangrove conservation and restoration：A global analysis[J/OL].Ecological economics，2020，176[2020-05-25].https：//doi.org/10.1016/j.ecolecon.2020.106758.

[5] 林鵬，林益明，楊志偉，等.中國海洋紅樹林藥物的研究現(xiàn)狀、民間利用及展望[J].海洋科學，2005，29（9）：76-79.

[6] 林鵬.中國紅樹林研究進展[J].廈門大學學報（自然科學版），2001，40（2）：592-603.

[7] 吳麗君.木本植物組織培養(yǎng)技術在林業(yè)科研與生產(chǎn)中的應用與局限[J].福建林業(yè)科技，2003，30（1）：67-69.

[8] CHEN L Z，WANG W Q，LIN P.Photosynthetic and physiological responses of Kandelia candel L. Druce seedlings to duration of tidal immersion in artificial seawater[J].Environ Exp Bot，2005，54（3）：256-266.

[9] 李建清，徐何方，葉麗珍，等.秋茄紅樹林北移引種造林技術[J].浙江林業(yè)科技，2001，21（6）：51-53.

[10] 牟愛友，劉際建，楊建青，等.我國最北緣秋茄紅樹林引種試驗調查[J].防護林科技，2005（S1）：6-8.

[11] 黃有軍.紅樹秋茄愈傷組織誘導的初步研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學，2007，35（27）：8467，8486.

[12] 馬麗，郭學良，周勝楠，等.雙色茉莉葉片初代培養(yǎng)物的建立及愈傷組織誘導[J].東北林業(yè)大學學報，2020，48（5）：67-71.

[13] 徐映萍.生長素和細胞分裂素對荸薺離體植株再生的影響[D].杭州：浙江大學，2019.

[14] 袁云香，商澎.小果衛(wèi)矛組織培養(yǎng)與快速繁殖[J].植物生理學報，2020，56（6）：1243-1247.

[15] 孫艷艷，江皓，卞健，等.‘玲瓏楓香葉片愈傷組織培養(yǎng)技術[J].中南林業(yè)科技大學學報，2020，40（7）：58-64.

[16] 甘艷，莫開敏，廖仁財.不同活性炭成分對香樟組織培養(yǎng)的影響[J].內蒙古林業(yè)調查設計，2017，40（1）：89-91.