長鏈非編碼RNA CRNDE 通過調(diào)控NPHS1的表達促進糖尿病腎病足細胞損傷

林卡帥?邱月?董蘭?周姍姍?黃俊?秦曙光?何鳳

【摘要】目的 探討長鏈非編碼 RNA（lncRNA）在糖尿病腎?。―N）發(fā)生發(fā)展中的作用。方法 收集臨床腎活組織檢查標本，采用RNA-seq 測序技術(shù)檢測DN組與正常對照組（NC組）腎組織中差異表達的lncRNA及mRNA。通過 GO、KEGG數(shù)據(jù)庫分析差異表達mRNA的生物學功能，并通過共表達網(wǎng)絡分析預測差異表達lncRNA的相互作用基因。采用實時熒光定量 PCR（qRT-PCR）檢測目標lncRNA、mRNA 在DN腎組織中的相對表達水平。結(jié)果 RNA-seq 測序結(jié)果表明，與NC組相比，DN組共有353個差異表達的lncRNA，其中224個表達上調(diào)，129個表達下調(diào)。qRT-PCR 結(jié)果顯示，DN組中CRNDE、PVT1和 BLZF2P 相對表達水平較NC組升高（P均< 0.001），而WT1-AS、TARID 和 ST13P6相對表達水平較NC組降低（P均< 0.001）。共表達網(wǎng)絡分析及雙變量相關分析顯示lncRNA CRNDE 與 NPHS1（編碼的 nephrin 是足細胞結(jié)構(gòu)完整性和發(fā)揮功能的決定性關鍵蛋白）呈負相關。結(jié)論 lncRNA CRNDE 在DN腎組織中表達明顯升高，且與 NPHS1存在負相關關系，lncRNA CRNDE 可能通過調(diào)控 NPHS1 的表達促進DN足細胞損傷。

【關鍵詞】糖尿病腎病;長鏈非編碼核糖核酸;CRNDE;NPHS1;足細胞

Long non-coding RNA CRNDE promotes podocyte indury in diabetic nephropathy by regulating NPHS1 expression Lin Kashuai， Qiu Yue， Dong Lan， Zhou Shanshan， Huang Jun， Qin Shuguang， He

Feng. School of Medicine， South China University of Technology， Guangzhou 510006， China

Corresponding author， He Feng， E-mail： eyhefeng@ scut. edu. cn

【Abstract】Objective To investigate the role of long non-coding RNAs （lncRNAs） in the incidence and progression of diabetic nephropathy （DN）. Methods The differentially-expressed lncRNAs and mRNAs in the kidney biopsy specimens were detected by RNA-seq sequencing between the DN and normal control groups （NC）. The biological functions of differentially-expressed mRNAs were analyzed through the GO and KEGG databases， and the interaction among differentially-expressed lncRNAs and mRNAs was analyzed through co-expression network analysis. The relative expression levels of target lncRNAs and mRNAs in DN kidney tissues were detected by real-time fluorescent quantitative PCR （qRT-PCR）. Results RNA-seq sequencing results showed that a total of 353 differentially-expressed lncRNAs in the DN group compared with that in the NC group， in which 224 were up-regulated and 129 were down-regulated. qRT-PCR revealed that the relative expression levels of CRNDE， PVT1 and BLZF2P in the DN group were significantly higher （all P < 0.001）， whereas the relative expression levels of WT1-AS， TARID and ST13P6 were remarkably lower than those in the NC group （all P < 0.001）. Moreover， co-expression network analysis and bivariate correlation analysis demonstrated that lncRNA CRNDE was negatively correlated with NPHS1 （the encoded nephrin is the decisive key protein for the structural integrity and function of podocytes）. Conclusions The expression level of lncRNA CRNDE is significantly up-regulated in DN patients， which is negatively correlated with NPHS1， indicating that lncRNA CRNDE may promote the podocyte damage in DN by regulating the expression level of NPHS1.

【Key words】Diabetic nephropathy;Long non-coding RNA;CRNDE;NPHS1;Podocyte

糖尿病腎?。―N）是糖尿病全身性微血管病變常見的并發(fā)癥，是我國終末期腎?。‥SRD）的主要病因，并且成為目前慢性疾病防治的重要問題之一[1-2]。越來越多的研究顯示，在DN早期，當系膜細胞和內(nèi)皮細胞尚未改變時就已出現(xiàn)足細胞損傷，表現(xiàn)為足細胞數(shù)量減少，胞體縮小，足突增寬融合、消失，進而引起蛋白尿?qū)е履I功能惡化進展[3-4]。因此，足細胞損傷是DN早期重要的病理基礎，然而其參與DN發(fā)生發(fā)展的機制尚未完全闡明。

隨著測序技術(shù)的發(fā)展及精準醫(yī)學的提出，以 Illumina高通量測序為代表的二代測序技術(shù)成為當下檢測已知、預測未知RNA的首選技術(shù)，為在分子水平尋找生物標志物提供了極大的便利。長鏈非編碼 RNA（lncRNA）是一類數(shù)量龐大、轉(zhuǎn)錄本長度大于 200個核苷酸且不具有編碼蛋白質(zhì)功能的RNA。近年多項研究顯示，lncRNA的異常表達與惡性腫瘤、心血管疾病、神經(jīng)疾病及代謝性疾病等多種疾病相關[5-7]。同時也有研究提示lncRNA 廣泛參與DN發(fā)生發(fā)展的各個環(huán)節(jié)[6， 8-9]。然而，目前發(fā)現(xiàn)功能的lncRNA還是少數(shù)，lncRNA的具體作用方式仍未完全清楚。本研究通過對人臨床樣本腎組織進行RNA-seq測序，檢測并分析DN組與正常對照組（NC組）差異表達的lncRNA及其特點，這將有助于深入探討lncRNA在DN中發(fā)揮的作用機制，為尋找DN防治的有效新靶點提供依據(jù)。

材料與方法

一、標本來源

本研究收集了2018年10月至2019年12月在廣州市第一人民醫(yī)院住院并經(jīng)活組織檢查（活檢）證實為DN的患者腎組織樣本4例（DN組），以及來源于腫瘤相鄰的正常腎切除樣本腎組織4例（NC組）。DN診斷符合中國防治指南2019年版的診斷標準[10]。DN組標本來源患者中，男2例、女2例，年齡（55.7±3.6）歲，BMI（24.2±2.2）kg/m2;NC組標本來源患者中男2例、女2例，年齡（54.8±4.5）歲，BMI（24.2±2.2）kg/m2。本研究經(jīng)廣州市第一人民醫(yī)院倫理委員會批準，并獲得所有入組患者的知情同意。標本采集后，立即使用RNA保護液浸泡于凍存管中，放入液氮罐中保存?zhèn)溆谩?/p>

二、主要儀器及試劑

包括Thermo Eppendorf常溫/低溫離心機，Thermo Nanodrop 2000分光光度計，Roche普通PCR儀，Roche實時熒光定量PCR（qRT-PCR）儀，

TRIzol RNA提取液及Takara含EB的RNA載樣緩沖液，OMEGA RNA保護液，諾唯贊高效模板DNA（cDNA）一鏈合成試劑盒，諾唯贊SYBR? Premix Ex TaqTM （GreenⅠ嵌合熒光法法），Sigma焦碳酸二乙酯（DEPC）。

三、方 法

1. 組織RNA的提取

使用TRIzol 提取液提取組織標本RNA，按試劑盒說明步驟操作，提取RNA后使用Nanodrop 2000分光光度計測定RNA的濃度及鑒定純度。隨后，使用瓊脂凝膠電泳鑒定RNA完整度。

2. RNA-seq測序及篩選差異基因

分離提純RNA后，送上海康成生物工程有限公司行RNA-seq測序，得到腎組織組間差異表達的lncRNA、mRNA及各自表達豐度值（FPKM）等信息。本研究中差異基因篩選標準為：log2 倍數(shù)變化（FC）≥ 1 且P≤0.05。log2 FC ≥ 1 即為上調(diào)的差異基因，log2 FC ≤-1 為下調(diào)的差異表達基因。

3. 基因表達水平檢測

將RNA按照試劑盒說明書步驟合成cDNA， 然后進行qRT-PCR，反應體系總體積20 μl，具體如下：SYBR? Green預混液10 μl、正向引物 0.2 μl、反向引物0.2 μl，無酶水 7.6 μl、cDNA 2 μl。反應條件如下： 94 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s，58℃ 30 s 共40個循環(huán)，72 ℃ 20 s。溶解曲線分析：62 ～ 95 ℃。

每份樣本重復3次。2-ΔΔCt法計算熒光強度閾值（Ct值），以GAPDH為內(nèi)參，計算樣品基因相對表達量。

4. 生物信息學分析

選出DN和NC組織之間差異表達的lncRNA和mRNA，并使用R軟件（3.4.1版）“l(fā)imma”軟件包將其可視化。簡而言之，根據(jù)篩選標準Padjust（P < 0.05和FC > 2）處理數(shù)據(jù)以選擇差異表達基因（DEG）。此外，分別采用GO、KEGG數(shù)據(jù)庫進行功能和信號通路富集分析。使用R軟件“ggplot2”“easygplot2”軟件包，通過dotplot和joyplot將KEGG結(jié)果中最豐富的信號通路（調(diào)整后的P < 0.01）可視化。Cytoscape（版本3.6.0）用于基于差異表達的lncRNA和mRNA進行共表達網(wǎng)絡分析。

四、統(tǒng)計學處理

采用SPSS 22.0進行統(tǒng)計學分析，DN組與NC組腎組織組間差異采用獨立樣本t檢驗。差異表達的lncRNA與mRNA之間關系采用Spearman秩相關分析。P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié)果

一、lncRNA CRNDE在人DN腎組織中表達上調(diào)

DN組與NC組間鑒定出353條差異表達的lncRNA，與NC組相比，DN組中有224條表達上調(diào)，129條表達下調(diào)。其中以 |log2FC| ≥2且P≤ 0.01為篩選條件，選取了DN組中顯著差異表達的上調(diào)和下調(diào)各20條lncRNA，見圖1A。同時，圖1B的火山圖顯示了DN組與NC組間總的差異表達的lncRNA。進一步，采用qRT-PCR對樣本進行驗證，與測序結(jié)果一致，PVT1（t = -12.518，P < 0.001）、CRNDE（t = -13.964，P < 0.001）和BLZF2P（t = -12.817，P < 0.001）的表達水平在DN組中相對NC組上升，而ST13P6（t = 11.409，P < 0.001）、TARID（t = 9.987，P < 0.001）和WT1-AS（t = 7.787，P < 0.001）在DN組中的表達水平相對NC組下降，見圖1C。

二、足細胞結(jié)構(gòu)與功能決定性基因NPHS1在DN腎組織中表達下調(diào)

生物信息學差異分析篩選出DN組和NC組之間的DEG，用熱圖的形式展示了2組差異表達的mRNA，見圖2A。利用R軟件對差異表達的mRNA進行KEGG 通路富集分析，DN組的NF-κB 信號通路、趨化因子通路、細胞因子受體通路異常激活，見圖2B。圖2C顯示了DN組中上調(diào)和下調(diào)各10個差異表達的mRNA， NPHS1在DN組中表達下調(diào)，圖2D GO富集分析功能表明NPHS1與腎單位發(fā)育及腎臟系統(tǒng)形成密切相關，提示 NPHS1的下調(diào)參與了DN的發(fā)病。

三、DN組織中l(wèi)ncRNA CRNDE 與NPHS1的表達呈負相關

利用R軟件和Cytoscape在DN腎組織差異表達的lncRNA和mRNA之間建立共表達網(wǎng)絡，DN組織中l(wèi)ncRNA CRNDE與NPHS1的表達相關，見圖3。同時，通過qRT-PCR分析DN臨床腎組織樣本，Spearman秩相關分析驗證了lncRNA CRNDE與NPHS1之間負性相關的表達調(diào)控關系（rs = -0.798，P < 0.001）。結(jié)果提示lncRNA CRNDE 可能通過調(diào)控 NPHS1的表達促進DN足細胞損傷，從而參與調(diào)控DN發(fā)生發(fā)展的過程。

討論

本研究通過RNA-seq測序挖掘DN中差異表達的lncRNA，DN組與NC組間共檢測到353條差異表達的lncRNA，其中224條在DN表達上調(diào)，129條表達下調(diào)。運用生物信息學分析及qRT-PCR 檢測，結(jié)果顯示在DN組中l(wèi)ncRNA CRNDE表達升高，而其與參與調(diào)控足細胞的正常結(jié)構(gòu)和功能的關鍵基因NPHS1有關。既往研究表明，核因子-κB （NF-κB）是DN的關鍵炎癥刺激通路，同時趨化因子和細胞因子也與炎癥狀態(tài)有關[11]。

NPHS1基因編碼的nephrin蛋白，Tossidou 等在2010年已經(jīng)證明其位于腎小球相鄰足細胞之間的裂隙隔膜上，是腎小球足細胞的標志性分子之一。同年，Vitureira 等報道，該蛋白在控制細胞骨架結(jié)構(gòu)、影響足細胞的形態(tài)和活性以及維持腎小球濾過功能的完整性等方面發(fā)揮著重要作用。適當水平的nephrin表達對正常腎小球功能是必要的。早在2002年Cooper等已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在蛋白尿性腎病的動物模型中，nephrin的表達被證明是減少的，盡管還有其他蛋白質(zhì)參與足細胞的結(jié)構(gòu)，特別是裂孔的結(jié)構(gòu)，但nephrin似乎在阻止蛋白質(zhì)通過腎小球屏障方面起著關鍵作用，而DN與大量蛋白尿和裂孔密度降低有關[3， 12-14]。本研究通過RNA-seq篩選及qRT-PCR驗證，結(jié)果均表明DN腎組織中NPHS1表達下調(diào)，明確了DN腎臟存在足細胞損傷，揭示NPHS1的表達調(diào)控將有利于闡明足細胞損傷的機制。

lncRNA CRNDE與膿毒癥相關腎損傷，炎癥通路異常激活觸發(fā)的疾病，以及與癌癥進展相關性，并在其中可能所起的作用已經(jīng)有了相關報道[15-17]。

在腎損傷模型中，通過敲低lncRNA CRNDE可以阻斷Toll樣受體3/NF-κB途徑的激活來降低脂多糖誘導的腎損傷[15]。在肺炎模型中，有研究表明CRNDE過表達加重人胚肺細胞（WI-38）的損傷，降低細胞活力，升高細胞凋亡和炎性細胞因子水平[16]。同時有研究表明，lncRNA CRNDE可能通過Toll樣受體途徑觸發(fā)炎癥反應來調(diào)節(jié)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[17]。此前的諸多研究表明，炎癥狀態(tài)與DN的發(fā)生發(fā)展密切相關[18-19]。在結(jié)直腸癌中，lncRNA CRNDE通過miR-181a-5p介導的Wnt/β-catenin信號通路傳導調(diào)控促進癌細胞的增殖和化學抗性[20]。β-catenin是介導DN Wnt信號通路的關鍵因子，其異常可導致足細胞功能障礙、蛋白尿以及腎臟纖維化[21]。本研究顯示lncRNA CRNDE 與NPHS1存在負相關，基于nephrin對于維持足細胞正常結(jié)構(gòu)和發(fā)揮功能的重要性，我們推測在DN腎組織中長鏈非編碼RNA CRNDE通過調(diào)控NPHS1的表達，從而對足細胞造成損傷，進而破壞腎小球濾過功能的完整性，參與調(diào)控了DN的發(fā)生發(fā)展。

本研究顯示，DN中l(wèi)ncRNA CRNDE的表達與NPHS1呈負相關，提示lncRNA CRNDE可能通過調(diào)控NPHS1影響足細胞關鍵蛋白nephrin的表達，從而破壞腎小球濾過屏障的完整性，參與了DN的發(fā)生發(fā)展。這進一步豐富了DN的發(fā)病機制，為DN靶基因治療提供了新的靶點，為尋找DN診斷及預后的生物學標志物提供依據(jù)。而lncRNA CRNDE如何調(diào)控NPHS1的表達值得進一步深入研究，這將為闡明DN足細胞損傷提供科學依據(jù)。

參 考 文 獻

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（收稿日期：2021-03-24）

（本文編輯：林燕薇）