高糖狀態通過WIF1-Wnt/β-catenin通路調控結腸腫瘤細胞的增殖

林志玲?黎潔瑤?閔筱輝?許稷豪?于濤?陳其奎

【摘要】目的 分析高糖狀態對結腸腫瘤細胞增殖的影響，并探討Wnt抑制因子1（WIF1）通過Wnt/β-連環蛋白（β-catenin）通路影響高糖狀態下結腸腫瘤細胞增殖的機制。方法 用不同濃度的D-葡萄糖處理結腸腫瘤細胞株SW620細胞，通過實時熒光定量PCR（qPCR）和蛋白免疫印跡法測定增殖相關基因的表達，行細胞增殖活性檢測、細胞計數實驗，用細胞平板克隆形成實驗檢測細胞增殖情況，采用qPCR和蛋白免疫印跡法測定WIF1和β-catenin的表達。轉染siRNA和過表達質粒調控WIF1的表達后，檢測WIF1對SW620細胞增殖能力和β-catenin表達水平的影響。結果 隨著糖濃度的增加，SW620細胞的增殖能力增強（P均< 0.05），WIF1的表達下降而β-catenin的表達增高（P均< 0.05）。下調WIF1的表達，SW620細胞的增殖能力增強且β-catenin的表達增高（P均< 0.05），而過表達WIF1后，SW620細胞的增殖能力受到抑制且β-catenin的表達下降（P均< 0.05）。結論 高糖狀態下WIF1表達的下降，可能通過活化Wnt/β-catenin通路促進高糖狀態下結腸腫瘤細胞的增殖。

【關鍵詞】高糖;結腸腫瘤;Wnt抑制因子1;β-連環蛋白;增殖

High glucose regulates the proliferation of colon cancer cells through the WIF1-Wnt/β-catenin signaling pathway Lin Zhiling， Li Jieyao， Min Xiaohui， Xu Jihao， Yu Tao， Chen Qikui. Department of Gastroenterology， Sun Yat-sen Memorial Hospital of Sun Yat-sen University， Guangzhou 510120， China

Corresponding author， Chen Qikui， E-mail： qkchen2015@ 163. com

【Abstract】Objective To evaluate the effect of high glucose on the proliferation of colon cancer cells， and investigate the mechanism of the effect of Wnt inhibitory factor 1 （WIF1） on the proliferation of colon cancer cells under high glucose state through the Wnt/β-catenin signaling pathway. Methods Colon cancer cell line SW620 cells were treated with different doses of D-glucose. The expressions of proliferation-associated mRNA and protein were measured by real-time fluorescent quantitative PCR （qPCR） and Western blot. The proliferation ability of SW620 cells was measured by cell proliferation assay， cell counting assay and colony formation assay. The expression levels of WIF1 and β-catenin were detected by qPCR and Western blot. After regulating the expression of WIF1 by the transfection with siRNA and over-expressed plasmid， the effect of WIF1 upon the proliferation ability and the expression of β-catenin in SW620 cells was evaluated. Results Along with the increase in glucose concentration， the proliferation ability of SW620 cells was significantly increased， the expression of WIF1 was remarkably down-regulated and the expression of β-catenin was significantly up-regulated （all P < 0.05）. The proliferation ability of SW620 cells was considerably increased and the expression of β-catenin was significantly up-regulated after down-regulating the WIF1 expression （all P < 0.05）. However， after the over-expression of WIF1， cell proliferation ability was significantly inhibited and the expression of β-catenin was remarkably down-regulated （all P < 0.05）. Conclusion Down-regulation of WIF1 expression under high glucose state may promote the proliferation of colon cancer cells under high glucose state via the activation of Wnt/β-catenin signaling pathway.

【Key words】High glucose;Colon cancer;Wnt inhibitory factor 1;β-catenin;Proliferation

近年來糖尿病和結腸癌的發病率逐漸上升，越來越多的研究者發現糖尿病可增加結腸腫瘤的發生風險，但糖尿病增加結腸腫瘤發生風險的機制尚不明確[1-2]。Wnt抑制因子1（WIF1）是由WIF1基因編碼的一種分泌性蛋白，是Wnt/β-連環蛋白（β-catenin）信號通路的抑制因子，其與Wnt蛋白直接結合，通過細胞膜上的卷曲蛋白受體家族將信號傳至胞內，引起通路關鍵分子β-catenin的磷酸化，促進β-catenin的降解，從而抑制Wnt/β-catenin信號通路[3]。有研究顯示WIF1具有抑制腫瘤發生的作用[4]。Wnt/β-catenin信號通路在細胞增殖、胚胎發育和成體組織再生中發揮重要作用。既往研究顯示，合并糖尿病的結腸癌患者的腫瘤細胞存在Wnt信號通路的異常激活，糖尿病患者的正常結腸上皮出現β-catenin的升高，Wnt/β-catenin信號通路與其抑制因子WIF1可能參與增加糖尿病患者發生結腸癌風險[5-6]。因此，本研究擬探討高糖狀態對WIF1表達的影響，及WIF1影響高糖狀態下結腸癌細胞增殖的具體分子機制。

材料與方法

一、細 胞

人結腸癌細胞株SW620細胞由中山大學孫逸仙紀念醫院醫學研究中心惠贈。將細胞用含10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM完全培養基于37℃、5%二氧化碳細胞培養箱中培養。

二、主要試劑

DMEM培養液（Gibco，美國），細胞增殖-毒性檢測試劑盒CCK-8（APExBIO，美國），TRIzol Reagent（Invitrogen， 美國），逆轉錄試劑盒Prime ScriptTM RT reagent Kit（Takara， 日本），qPCR SYBR

TB Green? Premix Ex TaqTM Ⅱ（Takara，日本），RIPA

細胞裂解液（康為世紀，中國），BCA蛋白定量試劑盒（康為世紀， 中國），增強化學發光法ECL試劑盒（Millipore， 美國），WIF1多克隆抗體（Cell Signaling Technology， 美國），β-catenin多克隆抗體（Cell Signaling Technology， 美國），PCNA多克隆抗體（Cell Signaling Technology， 美國），Ki67多克隆抗體（abclonal， 中國），LGR5多克隆抗體（abclonal， 中國），GAPDH多克隆抗體（Cell Signaling Technology， 美國），羊抗兔二抗（Cell Signaling Technology， 美國），Lipofectamin 3000（Invitrogen， 美國），WIF1 siRNA（銳博生物， 中國），pcDNA3.1-WIF1過表達質粒（艾基生物， 中 國）。

三、方 法

1.細胞培養與分組

將SW620細胞培養于含10%胎牛血清的普通DMEM完全培養基。將SW620細胞接種于6孔板中，待SW620細胞貼壁后更換成無血清培養基，24 h后分別用不同糖濃度培養基培養72 h，并將其分為3組：5 mmol/L葡萄糖+25 mmol/L甘露醇（低糖組，LG組），20 mmol/L葡萄糖+10 mmol/L甘露醇（正常糖組，NG組），30 mmol/L葡萄糖（高糖組，HG組）。每日換液，72 h后收取樣本用于后續實驗。

2.實時熒光定量PCR（qPCR）

收集各組細胞，棄去培養基，用磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗1次，用TRIzol按說明書提取總RNA，測定RNA濃度和純度后，將RNA按逆轉錄試劑盒體系合成cDNA。按qPCR試劑盒配制反應體系，在Roche LightCycler 480 qPCR儀中反應，反應結束后得到各樣本的Ct值，以GAPDH為內參計算目的基因相對表達量進行統計分析。

3.蛋白免疫印跡法

于冰上收集各組細胞，加入細胞裂解液（含蛋白酶抑制劑），混勻后于冰上裂解30 min，離心后收取上清，按BCA法測定蛋白濃度。加入上樣緩沖液后，于100℃加熱5 min使蛋白變性，蛋白經SDS-聚丙烯酰氨凝膠電泳后，將其電轉移至PVDF膜。PVDF膜在5%脫脂牛奶中于室溫下封閉1 h，加入相應一抗（1∶1000）于4℃搖床過夜，加入與一抗對應的HRP標記的二抗（1∶2000）于室溫孵育1 h。用ECL法曝光目的條帶，用ImageJ軟件分析條帶灰度值。

4.細胞增殖活性檢測

將SW620細胞按每孔3000個接種于96孔板中，按分組處理繼續培養，分別于0、24、48、72 h在每孔加入10 μl的CCK-8溶液，37℃孵育2 h，用多功能酶標儀在450 nm波長下檢測每孔的吸光度，用吸光度表示增殖活性。對增殖相關基因增殖細胞核抗原（PCNA）、Ki67、富含亮氨酸重復單位的G蛋白偶聯受體（LGR5）進行mRNA和蛋白水平的檢測。

5.細胞計數實驗

將SW620細胞按每孔1×104個接種于12孔板中，按分組處理后，棄去培養基，用PBS清洗1次，分別于0、24、48、72 h用胰酶消化制備成細胞懸液，按1∶1加入0.4%臺盼藍溶液，滴加至血球計數板中，于顯微鏡下進行計數。

6.細胞平板克隆形成實驗

將SW620細胞按每孔1000個接種于6孔板中，按分組處理后繼續培養14 d，每3 d換液1次。棄去培養基，用PBS清洗1次，加入4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗滌1次，加入0.1%結晶紫溶液，染色30 min，再用清水洗滌數次后晾干，于顯微鏡下計數并計算克隆形成率。

討論

越來越多的研究顯示糖尿病可增加結腸癌的發生風險，而其中分子機制尚未明確。本研究組探討了不同糖濃度對結腸癌細胞株SW620細胞的增殖、WIF1的表達、Wnt/β-catenin通路關鍵因子表達的影響，以及進一步研究分子調控和相關機制，結果顯示在高糖狀態下WIF1表達的下降，可能通過活化Wnt/β-catenin通路來促進高糖狀態下結腸腫瘤細胞的增殖。

以往的研究顯示高糖可以促進細胞的增殖[7]。本研究證實了SW620細胞的增殖能力隨著糖濃度的升高而增加。同時，隨著糖濃度的升高，WIF1的表達逐漸下降，而β-catenin的表達則逐漸增高。既往研究顯示合并糖尿病的結腸癌患者中存在Wnt信號通路的異常激活[5]。本研究結果顯示，高糖抑制WIF1的表達和促進Wnt/β-catenin通路的活性可能與高糖促進細胞增殖有關。多項研究顯示，WIF1在各系統腫瘤中表達降低，如口腔內膜鱗狀細胞癌、鼻咽癌等，WIF1在各腫瘤中表達降低可能與其啟動子甲基化有關[8-10]。同時有研究者發現，上調WIF1可以抑制結腸腫瘤細胞的侵襲和遷移，說明WIF1可能是影響結腸腫瘤細胞生長的抑癌基因[11]。Wnt信號通路在細胞增殖、胚胎發育、成體組織的再生和腫瘤干細胞特性等中均起著至關重要的作用，Wnt/β-catenin通路中某些基因的突變或表達失調導致其異常活化可誘發癌癥[12-14]。WIF1通過與Wnt蛋白直接結合，抑制Wnt蛋白與細胞膜上的Fzd受體作用，影響細胞內的信號傳導，細胞質中的Axin、APC和GSK3β形成毀滅復合體，導致β-catenin磷酸化而后降解，使下游靶基因轉錄受抑制，抑制細胞增殖[15]。本研究顯示，WIF1的表達與SW620細胞的增殖能力和β-catenin的表達均呈負相關關系，表明WIF1通過抑制Wnt/β-catenin通路的活性抑制細胞增殖。以上研究結果提示，高糖抑制WIF1的表達，WIF1表達的下降進一步通過Wnt/β-catenin通路促進結腸腫瘤細胞在高糖狀態下的增殖。

綜上所述，本研究結果提示，高糖下調WIF1的表達，使WIF1對Wnt/β-catenin通路的抑制作用受阻，從而促進高糖狀態下結腸腫瘤細胞的增殖。本發現或可為糖尿病促進結腸腫瘤發生提供理論基礎和新的干預靶點。

參 考 文 獻

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（收稿日期：2021-02-13）

（本文編輯：洪悅民）