分析實時熒光PCR 技術檢測結核桿菌的臨床應用價值

劉梅，楊芳

濟寧市公共衛生醫療中心檢驗科，山東濟寧 272100

結核病是醫學領域較難解決的一個問題， 且是一項全球性問題。 就目前的形式來看，該疾病的發生率逐年上升。 根據相關報道[1]全球范圍內約有2 000 的結核病患者，除此之外，每年會大約出現900 萬的患者，而這些患者中， 每年會有將近340 萬患者因為結核病死亡，病死率較高，給全球人類均帶來較大的影響。 結核病不論是在我國還是其他國家都是一個醫學熱點問題， 許多國家都將醫學研究重點放在了結核病的預防和控制[2]。 要想有效預防結核病，就必須要及時并正確的診斷結核病， 目前臨床對于結核病的確診通常是涂片法與培養法，但這兩種方法均存在著不同的弊端，必須另尋可靠的方法， 才能做好結核病的控制與預防[3]。該文隨機選取2018 年 2 月—2019 年 2 月收治的 100例患者分析應用實時熒光PCR 技術對結核桿菌的診斷作用，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

從該院收治的結核病患者中隨機抽取100 例，其中男性 56 例， 女性 44 例； 年齡 20~61 歲， 平均年齡（43.26±4.05）歲；發病時間 2 個月~16 年，平均發病時間為（8.21±2.33）年。 所有患者均經由該院相關醫學檢查確診為結核病患者， 患者的臨床表現多為咳嗽、 咳痰等，部分患者會伴隨氣急、胸悶等臨床癥狀。 研究得到醫院倫理會批準和認可。 納入標準：患者在知情的基礎上自愿簽署相關協議。 排除標準：單一或多器官功能衰竭；存在嚴重疾病者。

1.2 方法

標本采集：對所有患者進行標本采集，肺結核患者在早晨晨起體檢時利用清水與30 mL 雙氧水漱口，用力深咳，第一口痰吐于垃圾簍，收集患者第二口痰置于器皿中，送至檢驗科檢測。 所有患者的痰標本均根據相關規程嚴格操作，應用涂片抗酸染色與結核菌培養進行實驗室研究診斷。 抗酸染色法步驟：使用石碳酸復紅滴入2~3 滴到涂片標本當中， 避免沸騰的情況下在火焰高處加熱，出現蒸汽即離開，根據染液的減少情況適當增加，標本冷卻后用水沖洗；利用3%鹽酸酒精進行脫色，后用水沖洗；使用堿性美藍溶液復染1 min，用水沖洗，并使用吸水紙將水分吸干，使用油鏡觀察。 將標本與化驗單均根據相應的程序在樣本接受處進行編號，并嚴格根據相應的程序操作。應用實時熒光PCR 技術（儀器編碼MX3000P），根據《全國結核病診斷細菌學檢驗規程》當中的有關規定挑取痰液部分， 通過鏡檢后找到結核分枝桿菌判定為陽性，無結核分枝桿菌則為陰性。

痰液標本處理： 在痰液標本當中加入4 倍體積的4%氫氧化鈉（NaOH），并將其搖晃均勻，在室溫的環境下靜置30 min 使其液化后，取出1 mL 的液體，將其離心。 離心速率設定在15 000 r/min，離心時間為5 min，離心后取出上清液，經過2 次的沉淀后加入1 mL 的無菌生理鹽水，并蓋緊混勻。 同時，采用實時熒光PCR 技術進行實驗，該實驗主要是提取DNA；該實驗中應用全自動PCE 基因擴增儀， 根據標準作業程序相關規定進入擴增分析區，將擴增儀與電腦開啟后進入系統，預熱擴增儀的燈泡，然后按照標準程序進行下一步操作，電腦會自動生成相應的監測報告。 經25 μL 的反應體系反應結束后，檢測標準品的循環閾值（Ct），檢測方式為陽性梯度，如果Ct≤37 則為陽性，等于40 則為陰性，Ct在38~40 為可疑樣本，針對可疑樣本需要進行復檢；經復檢后Ct 無數值判定為陰性，否則為陽性。

1.3 觀察指標

對所有患者應用實時熒光PCR 技術、 培養法與涂片法進行結核桿菌檢測， 根據得出的數據分析所有患者的陽性率，并對其進行對比。 陽性率=陽性例數/總例數×100%。

1.4 統計方法

采用SPSS 22.0 統計學軟件予以數據處理，計數資料以頻數和百分比(%)表示，組間差異比較采用χ2檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

應用實時熒光PCR 技術、培養法、涂片法檢測患者的結核標本的陽性率分別為53%、32%、27%，實時熒光PCR 技術的陽性率明顯高于培養法與涂片法， 差異有統計學意義（χ2=9.023、14.083，P＜0.05）。 見表 1。

表1 3 種方式檢測陽性率對比

3 討論

肺結核屬于一種慢性傳染病， 其特征為細胞免疫力低下，是由結核桿菌引起的，患病后對患者全身器官均有一定影響，從全球范圍來看，約有1/3 的人感染結核桿菌[4-5]。 對于結核病的治療原則是早期及時發現、及時診斷以及及時治療， 通過這一方法可以有效控制肺結核感染情況，改善預后，對患者的生活質量也有一定的優化作用[6]。

目前臨床針對肺結核疾病最準確的診斷方式就是結核菌分離培養方法， 但傳統的培養法與涂片法檢測效率并不高， 往往需要許多的工作人員共同進行實驗室培養檢測，消耗時間較長，在一定程度上影響了肺結核的檢測速度，且檢測的陽性率較低，不能準確地檢測出患者體內的結核桿菌[7]。 為了克服傳統涂片法與培養法的問題與弊端， 近年來隨著醫療服務行業的不斷進步，實時熒光PCR 技術應運而生，實時熒光PCR 技術一經出現就立刻試用于臨床， 并在臨床得到快速的發展，尤其是對肺結核患者的結核桿菌進行檢測[8]。

實時熒光PCR 技術應用于檢測結核桿菌中， 相比涂片法與培養法，具有更高的敏感度和特異性，即便是含有結核桿菌較少的標本， 如患者的尿液以及胸腹水等， 通過實時熒光PCR 技術也能有效檢測出結核桿菌的存在，能夠極大提升結核桿菌的檢出率，提升檢測效率[9]。 這一優勢有助于醫院及時對結核病患者進行有效干預，從而對患者進行有針對性的預防和控制。 在該次實驗當中，同時對100 例結核病患者行涂片法、培養法與實時熒光PCR 技術檢測法， 結果顯示應用實時熒光PCR 技術檢測法的檢測陽性率均明顯高于涂片法和培養法[10]。

實時熒光PCR 技術通過加入一條與靶基因序列互補的熒光雙標記寡核苷酸探針，當患者的標本中出現特異性PCR 擴增的情況，則會出現特異性的熒光，根據熒光值的變化，能有效且準確的判定擴增產物的量[11-13]。但實時熒光PCR 技術的使用也受到一定的限制， 究其原因在于結核菌難能破壁以及樣本當中存在著各種各樣的抑制物，會導致其出現假陰性[14-16]。 如果在檢測過程中出現假陽性的結果， 則首先要考慮標本是否受到污染， 也可以進一步分析是否擴增了患者體內潛伏的分枝桿菌。 如果患者體內有惡性腫瘤，則免疫抑制特性就會導致患者的結核病復發， 如果患者體內腫瘤壞死，則會將潛伏的結核分枝桿菌釋放出來，將陰性轉變為陽性[17-19]。

該次研究結果表明，應用實時熒光PCR 技術、培養法、涂片法檢測患者的結核標本的陽性率分別為53%、32%、27%，實時熒光PCR 技術的陽性率明顯高于培養法與涂片法。該文的研究結果與譚珂等[14]人的研究結論一致， 即應用實時熒光PCR 技術顯示出的陽性數量明顯高于涂片法與培養法的檢測方式， 應用實時熒光PCR 技術檢測患者的結核標本陽性率為56%， 培養法的陽性率為33%，涂片法的陽性率為26%，且差異有統計學意義（P＜0.001）。 說明，應用實時熒光 PCR 技術處理對結核桿菌DNA 具有更高的敏感性，檢出率也更高。

綜上所述， 實時熒光PCR 技術應用于結核桿菌的檢測中具有較為明顯的優勢，且檢出率也較高，有更高的應用價值。