砷脅迫下外源磷對香蒲根表鐵膜形成及吸附砷的影響

俞佳 ，黃穎 ，張晉龍，劉云根 *，王妍，楊思林

1.西南林業大學生態與環境學院，云南 昆明 650224；2.云南省山地農村生態環境演變與污染治理重點實驗室，云南 昆明 650224

砷（As）是環境中常見的有毒類金屬，其主要產生于地質和人為活動。人類活動包括金屬開采和冶煉，含 As農藥、除草劑、木材防腐劑、食品添加劑等的使用，以及含 As染水灌溉。美國環境保護署（EPA）將As列為有效的人類致癌物，并且是造成嚴重健康問題的主要原因（紀冬麗等，2016）。磷（P）作為一種常見的營養元素，大量的排放進入水體會造成水體富營養化等一系列環境問題（趙祖軍等，2018）。

云南地處高原地區擁有數量眾多的高原濕地且各種礦產資源十分豐富尤其以磷礦和有色金屬礦物為主，在礦產資源開發利用過程中As、P等元素也會隨著水體而進入濕地（劉總堂等，2010；Xing et al.，2017）。濕地有著凈化水質等重要生態功能（邱彭華等，2010），濕地植物由于其獨特的生長生存環境產生了一系列適應淹水環境的生理生態特征，其中根表鐵膜就是一種重要的生態現象。根表鐵膜有著獨特的結構特征，是一種兩性膠體對環境中的各種元素都有一定的吸附能力，是植物抵御脅迫的一種重要手段（陳春麗等，2014；劉春英等，2014）。研究表明，廣泛存在于濕地植物根表的鐵膜（Zimmer et al.，2011；Huang et al.，2012），因其具有較大的表面積并帶有正負電荷基團，可以通過吸附和共沉淀等作用，影響養分和重金屬元素在土壤中的化學行為和生物有效性，對濕地植物根系吸收養分和攔截污染物起著重要的門戶作用（Zhang et al.，2020）。目前，有關于根表鐵膜對水稻吸收營養物質和污染物影響的研究已有較多報道，對于濕地植物鐵膜的研究也有開展，但由于鐵膜的生成是一個動態的過程，在植物的不同生長時期有一定的差異性。

香蒲被公認為是濕地水生植物中的優勢物種對多種重金屬具有較高的耐性，是吸收重金屬的優良水生植物，但在濕地生態環境中，As污染下香蒲對 As的積累與遷移特征及影響機制的相關研究尚待進一步深入（任偉等，2019）。根表鐵膜廣泛生成與香蒲根系上與香蒲吸收砷有著密切關系。因此，亟待研究在受到As污染的濕地在外源P輸入情況下典型濕地植物香蒲整個生長期內根表鐵膜的生成及其對 As的吸附規律。本實驗通過水培的方式，通過對典型濕地植物香蒲的整個生長周期（生長期、繁殖期、枯落期）的鐵膜形成量、鐵膜吸附As及香蒲根系As含量進行動態監測，探究在兩種P質量濃度下（0.2、2 mg·L?1）香蒲根表鐵膜的形成及其吸附 As的規律與特征，對于受污染濕地的植物修復有著重要的意義。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

供試植物為典型的濕地植物香蒲，購自云南省昆明市富民泛亞苗圃植基地，選取當年高度一致（株高約15 cm）、長勢良好且生長狀況一致的幼苗作為實驗材料。挑選出生長一致的幼苗移栽到1.5 L的塑料桶中，共計18桶，每桶3株幼苗，每個桶中供應Hoagland營養液，體積為1 L。營養液組分為 NH4NO3114.3 mg·L?1、NaH2PO4·2H2O 50.4 mg·L?1、K2SO489.3 mg·L?1、CaCl2158.2 mg·L?1、MgSO4·7H2O 40.5 mg·L?1、MnCl2·4H2O 7.5 mg·L?1、(NH4)6Mo7O24·2H2O 0.37 mg·L?1、H3BO34.62 mg·L?1、ZnSO4·7H2O 0.175 mg·L?1、CuSO4·5H2O 0.155 mg·L?1、Fe-EDTA 1.128 mg·L?1。營養液 pH值調至 5.0，每個星期更換一次營養液，待香蒲生長成熟之后在每個桶內加如20 mg·L?1的Fe-EDTA作為鐵源。以Na2HAsO4·7H2O為As源，以KH2PO4作為P源。

分別設置 0、2、10 mg·L?13個 As質量濃度，設置0.2、2 mg·L?1兩個P質量濃度進行交叉實驗，分別記為 As0P0、As0P0.2、As2P0、As2P0.2、As5P0、As5P0.2

香蒲自2019年4月22日購置移栽水培，適應性培育15 d后加入外源As、P之后繼續培養60 d，分別在生長期（7月7日）、繁殖期（9月7日）、枯落期（11月7）采集植株樣品進行相關分析（以香蒲實際生長情況來劃分3個不同時期）。

1.2 鐵膜及其吸附砷、植物根系砷、根系活力測定

將植株從營養液中取出，用去離子水沖洗3次，然后從莖基部將香蒲根系和地上部分開，地上部裝入袋中。根系用DCB（dithionite-citrate-bicarbonate method）法提取根表鐵膜中Fe、As，具體方法為：將用去離子水洗干凈后的水稻根系放入 150 mL三角瓶中，加入 0.3 mol·L?1的 Na3C6H5O7·2H2O 40 mL，1 mol·L?1NaHCO35 mL，3 g Na2S2O4，振蕩 3 h（Haold et al.，2004），溶液轉移至100 mL容量瓶中定容，將定容后的浸提液分為兩部分，一部分使用火焰光度計測定其中鐵含量，一部分使用原子熒光光度計測定砷含量。使用經DCB浸提之后的根系，先用去離子水洗凈，然后使用濃硝酸-高氯酸-鹽酸進行消煮，使用原子熒光法測定消煮液中的砷含量，即為去除鐵膜后的根系砷含量。根表鐵膜形成量、砷吸附量、根系中砷含量的計算方式參考黃穎等（2020）的研究。

采用TTC法對窄葉香蒲的根系活力進行測定，具體方法為：稱取洗凈根尖樣品0.5 g，放入10 mL燒杯中，加入0.4% TTC溶液和磷酸緩沖液的等量混合液10 mL，把根充分浸沒在溶液內，在37 ℃下暗保溫 1—3 h，此后加入 1 mo·L?1硫酸 2 mL，以停止反應。（與此同時做一空白實驗，先加硫酸與根樣品，10 min以后再加其他藥品，操作同上）把根取出，吸干水分后與乙酸乙酯3—4 mL和少量石英砂一起在研缽內磨碎，以提出甲攢。紅色提取液移入試管，并用少量乙酸乙酯把殘渣洗滌2、3次，皆移入試管，最后加乙酸乙酯使總量為10 mL，用分光光度計在波長485 nm下比色，以空白試驗作參比測出吸光度，查標準曲線，即可求出四氮唑還原量。

式中，W為四氮唑還原強度（mg·g?1·h?1）；a為四氮唑還原量（mg）；b為根重（g）；c為反應時間。

1.3 數據分析與計算

圖表制作采用Origin 2015，所有結果為3次平行試驗數據的平均值，差異顯著性和相關性分析采用IBM SPSS Statistics 25（Duncan法）進行檢驗，統計顯著性設為P＜0.05。鐵膜及其吸附As含量的計算，先測出浸提液中 Fe、As的濃度計算出浸提液中Fe、As的質量除以浸提時根的干質量。

2 結果與分析

2.1 砷脅迫對植物株高與生物量的影響

由圖1可知在不同生長期As對植物株高的影響不同，在生長期的同一P質量濃度處理下香蒲的株高為 0 mg·L?1As＞5 mg·L?1As＞2 mg·L?1As；在繁殖期的 0.2 mg·L?1P 組株高的變化規律為 10 mg·L?1As＞2 mg·L?1As＞0 mg·L?1As，0.2 mg·L?1P 組為 2 mg·L?1As＞0 mg·L?1As＞10 mg·L?1As；在枯落期的0.2 mg·L?1P 組株高的變化規律為 0 mg·L?1As＞2 mg·L?1As＞10 mg·L?1As，2 mg·L?1P 組為 2 mg·L?1As＞0 mg·L?1As＞10 mg·L?1As。由表 1 可知，在不同外源 As濃度下，在不同生長時期的香蒲生物量均產生顯著性差異，僅在外源P為0.2 mg·L?1的繁殖期與2 mg·L?1的生長期未見顯著性差異。這一結果表明，在低外源P情況下一定濃度的As脅迫在生長期和繁殖期有利于植物生長，在本實驗中的兩種P濃度下As脅迫都會對植物生長產生一定影響。

表1 砷脅迫下不同生長時期香蒲生物量（鮮質量g）Table 1 Cattail biomass at different growth stages under arsenic stress

圖1 砷脅迫下不同磷質量濃度香蒲株高Fig.1 Plant heights of cattails with different phosphorus concentrations under arsenic stress

2.2 不同生長期香蒲根表鐵膜生成量

如圖2a所示，當不存在As脅迫的情況下在低P（0.2 mg·L?1）和高 P（2 mg·L?1）兩組質量濃度下，不同的生長時期根表鐵膜的生成量是有一定的差異。其中最大的生成量均為生長期量為 2963.83mg·kg?1和 1176.63 mg·kg?1；最小值為枯落期生成量為 746.77 mg·kg?1和 553.66 mg·kg?1。通過顯著性分析的結果可知，在低P組鐵膜的生成量僅生長期的數值與其他兩個時期的存在差異，繁殖期和枯落期的不存在顯著性差異。在高P組3個生長時期的鐵膜生成量都存在顯著性差異。當 As脅迫質量濃度為 2 mg·L?1時鐵膜的生成量的最大值分別為1558.29、886.13 mg·kg?1為香蒲的生長期；鐵膜生成量的最小值分別為 379.13、306.14 mg·kg?1為香蒲的枯落期。在兩組不同外源P濃度下鐵膜的生成量僅在生長期有顯著性差異，在繁殖期和枯落期的生成量不存在顯著性差異。在As脅迫質量濃度為10 mg·L?1時在生長期鐵膜的生成量有最大值分別為2411.57、799 mg·kg?1；在枯落期有最小值分別為227.00、206.32 mg·kg?1。通過對數據進行顯著性分析可知在低P條件下生長期、繁殖期、枯落期的生成量都存在顯著性差異，在高P條件下僅生長期的存在顯著性差異，繁殖期和枯落期的生成量不存在顯著性差異。

圖2 不同質量濃度As處理根系鐵膜生成量Fig.2 Iron film production of root treated with different concentrations of As

通過對比分析As質量濃度為0、2、10 mg·L?13組情況下不同時期根表鐵膜的生成量的情況可知，無論是何種As濃度和不同P濃度下，根表鐵膜的生成量在不同時期都有所不同，其規律為生長期＞繁殖期＞枯落期，其中在某些As濃度和P濃度下繁殖期和枯落期的生成量不存在顯著差異。

2.3 兩組外源磷濃度對香蒲根表鐵膜生成的影響

通過分析和對比在低P和高P兩個不同濃度的鐵膜生成量（圖3），可知在外源P濃度較低時，是有利于鐵膜的生成。在低P濃度下鐵膜的最大生成量為 2753.62 mg·kg?1，平均值為 1085.72 mg·kg?1，最小生成量為227.69 mg·kg?1。在高P濃度下鐵膜的生成量較低且分布的范圍也較窄，其生成的范圍為 1176.63—206.32 mg·kg?1，遠小于在低 P 濃度下的范圍 227.69—2753.62 mg·kg?1。且低 P 條件下鐵膜的平均生成量越要高于高P濃度。這一結果表明在不同外源 P條件下鐵膜的生成量是有明顯差異的，且差異十分顯著。這一實驗結果與在其他植物中進行的實驗的結果基本一致，即鐵膜的生成量與環境中的P濃度有著十分顯著的關系，在其他植物中的（實驗）結果為低P可促進植物根表鐵膜的形成，高P會抑制植物根表鐵膜的形成。

圖3 不同P濃度下香蒲根表鐵膜生成量Fig.3 The amount of iron film generation of the fennel surface under different P concentrations

2.4 香蒲根系活力與根表鐵膜生成

通過分別測量香蒲在繁殖期和枯落期兩個時期的根系活力（圖4、5），對比分析在0.2 mg·L?1P和2 mg·L?1P兩組不同外源P輸入下香蒲的根系活力可知，隨著As脅迫的增加在高P濃度下根系活力會隨之下降，在低P濃度下的變化規律為先下降后上升但根系活力最高的點均為無 As脅迫時。這一結果也表明 As脅迫會對香蒲的生長有一定的毒害作用，且一定量外源P的加入有利于減輕此種毒害。通過對根系活力和根表鐵膜生成量進行相關性分析可知，二者呈現出正相關關系（P=0.784，r2=0.615），這表明在本實驗體系中香蒲根表鐵膜的生成量與其根系活力有一定的關系。根系活力高的植物可在根系周圍形成局部的氧化環境，增強根系的呼吸強度，從而促進Fe2+等還原物質在根際進行氧化反應，使得根表鐵膜生成量增加。

圖4 繁殖期根系活力Fig.4 Root activity in breeding period

圖5 枯落期根系活力Fig.5 Root activity in dead leave period

2.5 根表鐵膜吸附砷的能力

由于香蒲根表鐵膜吸附的As、P的含量與香蒲鐵膜的形成量有著很明顯的關系，呈現出正相關，直接用鐵膜上富集的As含量來反映鐵膜對于As的吸附無法準確地反映其吸附能力，故通過計算DCB浸提液中As與Fe的濃度比（As/Fe）作為衡量植物根表鐵膜吸附As，也可以避免同一處理的香蒲植株形成不同鐵膜量造成的吸附差異，從而真實地反應出不同生長時期以及在不同外源砷作用下香蒲根表鐵膜對于砷的吸附能力。

表 2 為 As脅迫濃度為 2 mg·L?1時的 As/Fe，通過顯著性分析的結果可知，在不同生長期和不同外源P處理下As/Fe都有顯著性差異。在兩組外源P處理下As/Fe的大小都為枯落期＞生長期＞繁殖期；在生長期和枯落期時，0.2 mg·L?1P時的 As/Fe＞2 mg·L?1P時的As/Fe，而繁殖期結果相反。通過以上結果可知在As濃度為2 mg·L?1中根表鐵膜對環境中As的吸附能力主要受生長時期和外源P濃度這兩個因素的影響。表3為As脅迫濃度為10 mg·L?1時的 As/Fe。通過對計算結果分析可知，在兩組不同外源P濃度下As/Fe的大小都是繁殖期＞枯落期＞生長期且在 3個不同的生長時期 As/Fe均為 2 mg·L?1P＞0.2 mg·L?1P。通過對數據進行顯著性分析的結果可知在不同生長期和不同外源P處理下都存在顯著性差異，這一結果說明在香蒲不同生長時期和不同P處理下都會對根表鐵膜吸附As的能力有一定的影響。

表 2 2 mg?L?1 As處理時 As/Fe比率 As/FeTable 2 As/Fe ratio at 2 mg·L?1 As treatment

表3 10 mg·L?1 As處理時As/Fe比率Table 3 As/Fe ratio at 10 mg·L?1 As treatment

2.6 砷在根表鐵膜與根系中的分配

通過計算在低P和高P兩種P濃度下As在根表鐵膜和根系內的分配比例可得到，在不同的生長時期以及不同的 As濃度下，砷的分配比例結果是有一定的差異性和特征規律的。

如圖6在P濃度為0.2 mg·L?1時，在生長期外源As濃度為0 mg·L?1時，根系中的As分配比率超過40%，達到65%左右，在繁殖期和枯落期較低，As濃度處理下As在根系中分配比率都低于40%，最高的為枯落期的As濃度為0 mg·L?1時，比率為47%左右，最低的為生長期As濃度為2 mg·L?1，比率為10%。在不同的生長時期這一分配比率都有所不同。在 P濃度為2 mg·L?1時，在生長期外源As濃度為 0 mg·L?1時，根系中的 As分配比率超過40%，達到 49%左右，在其他 As處理和不同生長期內，As在根系中的分配比率都低于 40%，在生長期內最低的為10 mg·L?1，分配比率低于10%，在2 mg·L?1處理下的分配比率也低于10%；在繁殖期As的分配比率都低于20%，最低的為砷濃度10%，在As濃度為2、10 mg·L?1時相差不大；在枯落期最低的為2 mg·L?1，比率為10%。通過對比在相同生長時期和相同As處理下高P和低P兩組情況下As在根系和鐵膜中的分配比率可知，在生長時期和As處理相同的情況下，高P組處理下As在根系中的分配比率都有低于低P處理，這一結果直接表明了外源添加 P可以有效抑制香蒲對于環境中的 As的吸附。在不同生長時期，As在根系和鐵膜中的分配比率都有很大不同，沒有呈現出一個明顯的規律。這一結果表明，在不同的生長時期和不同的As處理下，香蒲根系對于As的吸附能力有一定的差異性，在本試驗體系中影響這一能力的主要因素為香蒲的生長時期和外源As的濃度。

圖6 As在根系和鐵膜的分配比Fig.6 As distribution ratio in root system and iron film

3 討論

3.1 砷磷作用下不同生長時期香蒲生長與根表鐵膜生成量

As是植物生長不需要的有毒痕量元素，影響正常生理代謝（陳國梁等，2017），已有研究證明，低濃度As作用下對植物的生物量積累會有一定程度的促進作用，但這種刺激存在閾值，超出后會抑制植物生長（陳天等，2019）。在本試驗中兩組外源P濃度輸入下不同濃度的As脅迫對植物生長都有顯著影響，在外源P濃度為0.2時As對植物的生長都表現出抑制，在外源P濃度為2 mg·L?1時則出現出一定的促進作用。由于As和P化學性質相似，最外層電子數相同，在晶體結構中可互相代替，所以當外源P濃度較高時對環境中的 As脅迫是有一定的緩解作用。通過分析低P和高P兩組P濃度下不同生長時期下香蒲根表鐵膜的變化規律可知在不同生長時期根表鐵膜的生成量也有一定的差異（王丹等，2015），其規律為生長＞繁殖期＞枯落期，其中生長期的形成量與繁殖期、枯落期有著顯著差異，繁殖期與枯落期差異不顯著。根據對香蒲繁殖期和枯落期根系活力的研究表明根系活力與根表鐵膜的形成呈現正相關。綜合分析表明，香蒲根表鐵膜的含量是一個動態的變化過程，隨著植物的生長時期不同，根系活動強弱也不同（鐘順清，2015），從而導致這一結果。根系活力是評價包括根系呼吸作用在內的根系代謝狀況的指標之一，在一定程度上可以反映根系釋放出氧化性物質的情況（劉振國等，2016）。在對兩種P濃度下鐵膜形成量的分析比較可知，在低P條件下植物形成根表鐵膜的能力是高于高P條件下的，這一結果與其他植物中低P促進形成高P抑制形成的（實驗）結果一致。在本實驗中鐵膜的生成量與環境中的P濃度有著十分顯著的關系，在其他植物中的（實驗）結果為低P可促進植物根表鐵膜的形成，高P會抑制植物根表鐵膜的形成，在本實驗體系中也得到了一致的結果（傅友強等，2014）。

3.2 砷磷作用下香蒲根表鐵膜對砷的吸附能力

通過計算和分析As/Fe比可知，在不同的生長時期和不同的外源砷作用下香蒲根表鐵膜對于 As的吸附能力是有一定的區別的，產生這一區別的原因主要是在香蒲不同的生長時期對于營養物質的吸收以及香蒲本身的生長狀況有關，As/Fe的值在不同生長時期是有顯著性差異的。通過方差分析的結果（表4）可知，在低P條件下影響根表鐵膜吸附As的能力的主要因素為生長時期，在高P條件下的主要影響因素為不同的 As濃度，但不同生長時期和不同P濃度的交互作用在兩組P濃度下都會產生影響。這一結果出現的原因與As、P處于同一主族元素，在根表鐵膜吸附這兩種元素的過程中存在競爭（楊忠蘭等，2020）。

表4 方差分析Table 4 Analysis of variance

3.3 砷在根表鐵膜與植物的分配

在分析兩種P濃度下As在根表鐵膜和根系的分配比率可知，除去生長期外源 As、P濃度為 0 mg·L?1時根系中的 As分配比率高于鐵膜中的分配比率，在其他組別中根系砷的分配比率都要低于鐵膜As。這表明，根表鐵膜的形成的確有利于香蒲抵御As脅迫，對于環境中的As有較強的吸附能力從而減少了As進入植物體內，進而減緩了As對于植物生長的影響。根系通氣組織發達的根系可產生更多的氧氣和氧化性分泌物，有利于形成更多的根表鐵膜，進而使根表鐵膜中富集更多的As（張秀等，2013）。在對比低P和高P兩個組別的分配比率發現，高P組中砷在根系中的分配比率都要低于低P組，這一結果也表明P的添加會減緩植物對于砷的吸收，從而降低的植物根系中砷的含量。由于As、P為同一主族元素，結構相似，在植物吸收時共用一個細胞通道，所以在植物吸收時二者處于一個競爭狀態，當環境中的P含量上升時，也會減少植物對于As的吸收（陳同斌等，2002；陳璐等，2015；陳國梁等，2017；徐水萍等，2019）。

4 結論

在不同的生長時期，香蒲根表鐵膜的形成量是有明顯的差異性，這一結果表明在香蒲的全生長周期，鐵膜的生成量是一個動態的變化而非靜態的量，在不同的生長時期和香蒲的不同生理狀態下也會產生變化，外源P對于鐵膜的生成量的影響表為低促高抑。香蒲根表鐵膜對于 As的吸附能力是與環境中的P含量以及生長時期有關，也與環境中的As濃度有關，其具體變化規律在本實驗中未有體現，需要進一步實驗研究。根表鐵膜的形成有利于香蒲抵御外界As脅迫，且絕大多數的As都會吸附于鐵膜表面，減少 As通過根系進入植物體內的量從而減緩對植物的毒害作用。