煤矸石對(duì)鯽魚體內(nèi)微量元素含量及組織結(jié)構(gòu)的影響

劉麗丹 ，周瑤 ，孫慶業(yè)

1.安徽大學(xué)資源與環(huán)境工程學(xué)院，安徽 合肥 230601；2.濕地生態(tài)保護(hù)與修復(fù)安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230601

煤矸石是煤碳開采和洗選過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)品，排放量占開采量的10%—15%，是礦區(qū)儲(chǔ)存量最大、占地最廣的固體廢物（田莉等，2020）。露天堆放的煤矸石不僅占用土地資源，而且會(huì)釋放多種有害物質(zhì)如硫化物、微量元素等，其中微量元素的釋放主要通過淋溶作用（Zhou et al.，2014；鄧君，2019）。在富有游離氧氣的降雨作用下，煤矸石中的硫化鐵發(fā)生氧化，生成[Fe2(SO4)3]和硫酸，使煤矸石中的碳酸鹽和氫氧化物溶解，致微量元素以硫酸鹽形式隨溶液析出、遷移，如Cu、Pb、Zn等（劉桂建等，2001）。堆積在采煤沉陷區(qū)周邊的煤矸石，微量元素析出后可通過地表徑流等途徑進(jìn)入水體，一方面使水體微量元素含量升高，對(duì)沉陷區(qū)附近的地表水和水源、土壤等產(chǎn)生污染（Davies et al.，2011；Sahoo et al.，2014；Villenuve et al.，2017）；另一方面微量元素進(jìn)入生物體內(nèi)后，很難通過代謝作用排出體外，在生物體內(nèi)積累，通過食物鏈作用向較高營(yíng)養(yǎng)級(jí)生物遷移，有致癌、致突變風(fēng)險(xiǎn)，甚至威脅人類健康（Hook et al.，2002；Mann et al.，2009；Rose et al.，2015；Strong et al.，2016；Dipark，2017）。

水中微量元素對(duì)魚體組織的影響國(guó)內(nèi)外已有較多研究。Khan et al.（2015）進(jìn)行了Pb、Cd對(duì)鯽魚毒性的研究，發(fā)現(xiàn)水體中Pb、Cd可對(duì)鯽魚肝臟和血液產(chǎn)生影響，表現(xiàn)為貧血、肝腎功能損害等；王瑞霖等（2015）研究灤河流域鯽魚體內(nèi)Cu、Zn、Pb、As、Cd的分布特征，指出水體中Cu、Cr主要蓄積在鯽魚肝臟，Zn、Pb、Cd主要富集在鰓部，As的蓄積器官隨地域變化而變化；唐建勛等（2012）研究Pb、Cu在鯽魚卵巢的富集和卵細(xì)胞損傷效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)水體中Pb、Cu可對(duì)卵巢和卵細(xì)胞產(chǎn)生影響，卵巢中Pb、Cu的富集量隨水體中離子濃度的增加和時(shí)間的延長(zhǎng)而加大，表現(xiàn)為卵巢逐漸萎縮、卵細(xì)胞受損繼而失去代謝能力，最終引起卵巢功能破壞或喪失。

煤矸石中除含有微量元素外，還含有多環(huán)芳烴、硫化物等（Wang et al.，1999；歐陽賽蘭等，2013）。目前關(guān)于煤矸石中微量元素污染對(duì)魚體的影響，大多是器官蓄積能力差異和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)，對(duì)魚體組織結(jié)構(gòu)的影響較少被關(guān)注（Belton et al.，2014；楊軍英等，2015；閆永峰等，2015）。因此本研究以鯽魚為試驗(yàn)動(dòng)物，通過水池養(yǎng)殖試驗(yàn)，探討煤矸石對(duì)鯽魚體內(nèi)微量元素含量及組織結(jié)構(gòu)的影響，為采煤沉陷區(qū)的濕地生物保護(hù)及周邊居民健康提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

安徽大學(xué)磬苑校區(qū)溫室養(yǎng)殖池作為試驗(yàn)池，容積均為9×103L。模擬采煤沉陷區(qū)現(xiàn)狀，在養(yǎng)殖池底部鋪滿10 cm左右厚的風(fēng)干無污染土壤，浸泡7 d后投放已發(fā)芽的馬來眼子菜（Potamogeton wrightii）、苦草（Vallisneria）等水生植物；25—40個(gè)圓頂珠蚌（Uniodouglasiae）、褶紋冠蚌（Cristaria plicata）等水生動(dòng)物，保證一定的物種豐富度。

30 d左右，待生物適應(yīng)穩(wěn)定后，投放5—10條鮮活無污染鯽魚。對(duì)安徽省阜陽市潁上縣謝橋煤礦進(jìn)行實(shí)地調(diào)查，估算多個(gè)塌陷塘體積與周邊矸石堆質(zhì)量、占地面積之間的關(guān)系，將篩選風(fēng)干后的煤矸石，按照0 kg（空白對(duì)照組A）、60 kg（實(shí)驗(yàn)組B）、140 kg（實(shí)驗(yàn)組C）稱質(zhì)量，于2019年9月用網(wǎng)兜沉入塘底。

1.2 樣品采集和處理

水樣于2019年9月和2020年9月采集兩次，采集深度為0.5 m，每個(gè)試驗(yàn)池各3個(gè)平行；同時(shí)2020年9月采集個(gè)體大小、質(zhì)量相似、活力較強(qiáng)的鯽魚樣本各5—10條。

1.3 上覆水理化指標(biāo)檢測(cè)

上覆水pH檢測(cè)使用pH計(jì)，氨氮測(cè)定參照《水質(zhì) 銨的測(cè)定（GB/T 7479—1987）》、總氮測(cè)定參照《水質(zhì) 總氮的測(cè)定（GB/T 11894—1989）》、CODMn測(cè)定參照《水質(zhì) 高錳酸鉀指數(shù)的測(cè)定（GB/T 11892—1989）》。

1.4 微量元素含量檢測(cè)

上覆水微量元素質(zhì)量濃度檢測(cè)：取水樣50 mL，各3個(gè)平行。用濃硝酸和過氧化氫消解，定容至50 mL后使用ICP-MS對(duì)Cu、Cd、As、Zn、Pb進(jìn)行檢測(cè)（張武，2018）。各元素加標(biāo)回收率在95%—115%。

鯽魚組織微量元素質(zhì)量分?jǐn)?shù)檢測(cè)：取凍干磨碎后的樣品0.2 g，各3個(gè)平行。硝酸和過氧化氫浸泡過夜后進(jìn)行消解、定容（段元慧等，2015）。使用ICP-MS對(duì) Cu、Cd、As、Zn、Pb進(jìn)行檢測(cè)。采用扇貝標(biāo)準(zhǔn)樣品（GBW-10024）作標(biāo)準(zhǔn)品，回收率在92%—103%。

1.5 鯽魚不同組織結(jié)構(gòu)觀察

取鮮活鯽魚相同部位組織，經(jīng)吸水紙擦干后，用 4%多聚甲醛固定，石蠟包埋切片后進(jìn)行 HE染色，中性樹膠封片，于顯微鏡下觀察。

1.6 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。應(yīng)用SPSS 20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，Excel 2016軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 上覆水理化指標(biāo)與微量元素質(zhì)量濃度

比較上覆水的基本理化指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)自2019年9月—2020年9月，對(duì)照組與試驗(yàn)組pH值均在7.3—7.81，呈中性，是由于煤矸石中的一些離子化合物發(fā)生水解反應(yīng)，消耗H+，使周邊水體pH逐漸呈現(xiàn)弱堿性（安茂國(guó)，2019）。氨氮質(zhì)量濃度在0.011—0.157 mg·L?1、總氮質(zhì)量濃度在 0.192—0.573 mg·L?1、CODMn質(zhì)量濃度在 6.188—9.942 mg·L?1。采用單因子水質(zhì)標(biāo)識(shí)指數(shù)和綜合水質(zhì)標(biāo)識(shí)指數(shù)對(duì)上覆水氨氮、總氮、CODMn進(jìn)行污染程度評(píng)價(jià)（徐祖信，2005）。結(jié)果表明，未造成上覆水營(yíng)養(yǎng)鹽污染，水質(zhì)整體可達(dá)到Ⅲ類綜合水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)，符合水產(chǎn)養(yǎng)殖的漁業(yè)水域的標(biāo)準(zhǔn)。

表1表明，微量元素質(zhì)量濃度表現(xiàn)為 Zn＞Cu＞As＞Pb＞Cd，其中 Cu、Pb質(zhì)量濃度隨水/煤矸石比的增大而增加，在C組中最高。可見由于時(shí)間和水/煤矸石比的增加，溶質(zhì)濃度增大，溶液濃度也會(huì)隨之增加。肖利萍等（2006）研究煤矸石：水固液比為 1∶5、1∶10和 1∶20時(shí)，固液比越大，浸泡時(shí)間越長(zhǎng)，煤矸石中溶解釋放的污染物總量越多。本研究中As含量隨pH值增大而減小，B組pH值低于C組，As含量也略高。馮啟言等（2002）通過研究?jī)贾菝喉肥牧転V條件，指出pH為4和8時(shí)，As質(zhì)量濃度分別是 0.082、0.010 mg·L?1。pH 值越低、酸性越強(qiáng)的淋溶液可增加煤矸石中 As的析出量也被其他研究所證實(shí)（劉桂建等，2001）。上覆水 Cd質(zhì)量濃度隨時(shí)間、水/煤矸石比的增加而降低，可能是由于Cd在pH＞7的水溶液中，形成Cd(OH)2沉淀，導(dǎo)致含量降低（安茂國(guó)，2019）。本研究所測(cè)微量元素結(jié)果與其他研究相比，元素變化相同，但含量卻較低，可能有兩方面原因：一是水/煤矸石比的不同，二是煤矸石滲出方式。本研究使用無污染水體作淋溶液，水/煤矸石質(zhì)量比為300∶1和300∶7，不同于酸溶液淋濾條件，無法快速增加污染物釋放速率，遠(yuǎn)低于肖利萍等（2006）研究中煤矸石的固液比。本研究中煤矸石一直浸泡在水體內(nèi)，不同于動(dòng)態(tài)淋濾過程，無法持續(xù)進(jìn)行間歇復(fù)氧，改變微量元素含量及存在形態(tài)，釋放大量污染物（王暉等，2006），這可能是導(dǎo)致水體微量元素含量較低的主要原因。

表1 上覆水微量元素質(zhì)量濃度Table 1 Mass concentration of trace elements in overlying water μg·L?1

2.2 鯽魚不同組織微量元素質(zhì)量分?jǐn)?shù)

鯽魚不同組織微量元素質(zhì)量分?jǐn)?shù)見表 2。鯽魚屬底層魚類，以植食性飼料為主，通過取食周邊浮游植物和藻類、或鰓體的吸附過濾作用富集微量元素，在身體中不斷積累（張旭升，2016）。肌肉作為鯽魚主要食用部分，組織內(nèi)微量元素安全問題尤為重要。在B、C組中，肌肉Cu、Cd、Zn、Pb質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著增加（P＜0.05），表現(xiàn)為 Zn＞Cu＞As＞Pb＞Cd。鯽魚主要以浮游藻類等作為餌料，浮游藻類不僅可以作為監(jiān)測(cè)重金屬污染水體的有利指示物，自身也可吸附和轉(zhuǎn)運(yùn)一定的微量元素（嚴(yán)如玉等，2020）。上覆水中的微量元素被浮游藻類吸附后，通過食物鏈作用進(jìn)入鯽魚體內(nèi)，造成肌肉中微量元素的富集。與A組相比，上覆水和肌肉Cu、Zn、Pb含量均有增加，且微量元素含量變化一致，表現(xiàn)為 Zn＞Cu＞As＞Pb＞Cd。顏世銘（2008）和李濤（2014）發(fā)現(xiàn)生物體內(nèi)微量元素含量與環(huán)境中該元素含量呈正比，并認(rèn)為鯽魚組織中微量元素含量與攝食環(huán)境和生存背景密切相關(guān)。鰓是魚類的呼吸器官，水環(huán)境中的微量元素通過呼吸作用或鰓表面的粘液附著進(jìn)行富集，B、C組中，鰓 Cu、As、Zn、Pb質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著增加（P＜0.05），表現(xiàn)為 Zn＞Cu＞Pb＞As＞Cd。與A組相比，上覆水和鰓中Cu、Zn、Pb、As含量也均有增加，其中Pb、As質(zhì)量分?jǐn)?shù)在鰓中表現(xiàn)為Pb＞As，與上覆水和肌肉組織含量表現(xiàn)不同，可能與鰓對(duì)微量元素的富集能力有關(guān)（蔡深文等，2011）。王瑞霖等（2015）發(fā)現(xiàn)鯽魚鰓對(duì) Pb、As的富集能力大于肌肉，主要受不同器官蓄積能力差異的影響。

表2 鯽魚不同組織重金屬質(zhì)量分?jǐn)?shù)Table 2 Mass fraction of trace elements in different tissues of Carassius auratus mg·kg?1

肌肉和鰓中Zn、Cu質(zhì)量分?jǐn)?shù)遠(yuǎn)高于Cd、As、Pb，和生命非必需元素相比，生物體更易吸收生命必須元素（Uluturhan et al.，2007；楚祿建等，2020）。5種微量元素中，肌肉、鰓的Cd含量均最低，鰓中Cd含量大于肌肉，可能與Cd具有強(qiáng)組織親和性相關(guān)，低劑量的Cd就會(huì)對(duì)生物產(chǎn)生巨大毒害，魚體生活在Cd污染的水體中，鰓最先受到影響，組織細(xì)胞形態(tài)也會(huì)受到危害（王志芳等，2019）。本研究中鰓微量元素含量大于肌肉，表明鰓對(duì)微量元素的富集能力較強(qiáng)，Pb在鯽魚不同組織的分布規(guī)律為：鰓＞肌肉。魚體不同組織對(duì)Pb的蓄積能力不同，內(nèi)臟和鰓對(duì)Pb的富集能力大于肌肉（唐建勛，2009；王田田等，2015；倪明龍等，2019）。鯽魚通過鰓從外界獲得溶解氧，主要濾食浮游藻類（楚祿建等，2020），通過呼吸、吸附等作用富集微量元素，導(dǎo)致鰓中微量元素質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加。兩種組織中微量元素含量，均隨水/煤矸石比和水體微量元素含量的上升而增加。

2.3 鯽魚不同組織結(jié)構(gòu)變化

2.3.1 鯽魚肌肉組織結(jié)構(gòu)變化

鯽魚背部肌肉組織橫切見圖 1。肌肉組織結(jié)構(gòu)受多種因素影響，如餌料、代謝等外界環(huán)境。A組鯽魚背部肌肉組織結(jié)構(gòu)完整，未產(chǎn)生組織學(xué)病變。B組肌內(nèi)膜輕度裂解，導(dǎo)致肌纖維細(xì)胞核分布呈部分離散狀態(tài)；肌纖維輕度壞死呈分裂像，結(jié)締組織增生，鯽魚肌肉組織結(jié)構(gòu)已受到影響。C組肌肉組織完整性最低，出現(xiàn)較多碎裂細(xì)胞，肌內(nèi)膜裂解程度加深，肌纖維細(xì)胞核數(shù)目少、離散程度大，結(jié)締組織增生嚴(yán)重，鯽魚肌肉組織結(jié)構(gòu)受到嚴(yán)重影響。隨著水/煤矸石比和組織中微量元素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，肌肉組織學(xué)病變程度加深。細(xì)胞完整性降低，細(xì)胞核數(shù)目不斷減少、分布離散程度逐漸加深。微量元素含量較高的肌肉組織中，肌纖維壞死情況和結(jié)締組織增生情況更嚴(yán)重。

圖1 鯽魚肌肉組織橫切（×200）Fig.1 Cross section of Carassius auratus muscle tissue (×200)

與A組相比，上覆水和肌肉中微量元素含量逐漸增加，肌肉組織病變程度也加深，其中上覆水Zn、Cu、As質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于Pb、Cd，與肌肉變化一致。水體微量元素可在生物組織中富集，導(dǎo)致組織微量元素含量升高，對(duì)機(jī)體不同器官，如卵細(xì)胞、肌肉等產(chǎn)生危害，表現(xiàn)為卵細(xì)胞受損、卵巢萎縮，肌纖維直徑和密度減少、肌纖維束的紋絡(luò)形態(tài)受到損傷等（唐建勛等，2012；李濤，2014）。但由于煤矸石中還含有其他污染物（如多環(huán)芳烴），也具有生物累積性，污染物進(jìn)入生物體后，可導(dǎo)致肌肉、肝臟等組織發(fā)生病變，表現(xiàn)為細(xì)胞破裂、溶解，胞質(zhì)中空泡化程度加重等。肌肉組織病變是否與煤矸石中其他污染物有關(guān)，有待于進(jìn)一步研究（陳晶，2005；蔣閏蘭等，2014）。

2.3.2 鯽魚鰓組織結(jié)構(gòu)變化

鯽魚鰓組織橫切見圖 2。鯽魚的鰓進(jìn)行著氣體交換、濾食和排泄等重要生理過程（Samajdar et al.，2017），是魚類響應(yīng)環(huán)境變化的重要器官。它受多種因素的影響（Miron et al.，2008；Rojas et al.，2013；劉娟娟等，2015），其形態(tài)變化可直接影響魚類存活（Samajdar et al.，2017）。A組鯽魚的鰓組織結(jié)構(gòu)正常，表現(xiàn)為鰓絲間距均勻，鰓絲內(nèi)部可見一棒狀軟骨無異常，鰓小片呈柳葉狀有序地位于鰓絲兩側(cè)。B組鰓絲間距增大、末端膨大，鰓小片逐漸脫落導(dǎo)致數(shù)目減少，垂直于鰓絲兩側(cè)并輕度彎曲；鰓絲軟骨輕度變薄，開始出現(xiàn)組織學(xué)病變。C組中鰓絲間距不等，末端膨大情況加重，鰓小片嚴(yán)重彎曲、無規(guī)則扭曲排列在鰓絲兩側(cè)，鰓絲末端鰓小片出現(xiàn)脫落；鰓絲軟骨組織變薄程度加深。

圖2 鯽魚鰓組織橫切（×200）Fig.2 Cross section of Carassius auratus gill tissue (×200)

B、C組中，上覆水和鰓的微量元素含量不斷增加，鰓病變程度也逐漸加深，上覆水和鰓中Pb、As含量表現(xiàn)不同，可能與鰓對(duì)微量元素富集能力的差異有關(guān)（王瑞霖等，2015）。鰓組織病變程度隨上覆水、組織微量元素含量的增加而加重，在微量元素污染的水體中，鰓組織可對(duì)微量元素進(jìn)行富集，并出現(xiàn)鰓絲排列混亂、斷裂融合等現(xiàn)象（吳林德等，2015）。但煤矸石中含有的多環(huán)芳烴等污染物，也會(huì)導(dǎo)致生物體鰓組織發(fā)生病變，出現(xiàn)鰓纖毛和微絨毛脫落，鰓絲上皮細(xì)胞排列不規(guī)則、細(xì)胞壞死等現(xiàn)象，嚴(yán)重影響鰓絲呼吸功能。鰓組織病變與煤矸石中其他污染物的關(guān)系，需再進(jìn)行深入研究（吳玲玲等，2007）。

3 結(jié)論

試驗(yàn)期間，煤矸石未對(duì)上覆水產(chǎn)生營(yíng)養(yǎng)鹽污染，上覆水水質(zhì)整體可達(dá)到地表水Ⅲ類標(biāo)準(zhǔn)，符合水產(chǎn)養(yǎng)殖漁業(yè)水域的標(biāo)準(zhǔn)。隨著水/煤矸石比率由300∶1 增至 300∶7，鯽魚肌肉和鰓中 Zn、Cu、Cd、Pb質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著增加（P＜0.05），其中Zn、Cu質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高、Cd質(zhì)量分?jǐn)?shù)最低，鰓對(duì)微量元素的富集能力大于肌肉；肌肉組織中微量元素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)表現(xiàn)為 Zn＞Cu＞As＞Pb＞Cd，鰓組織中微量元素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)表現(xiàn)為 Zn＞Cu＞Pb＞As＞Cd。

在水/煤矸石質(zhì)量比率為 300∶1，肌肉中 Cu、Zn、Cd、Pb、As平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 1.501、105.718、0.005、0.136、0.388 mg·kg?1，鰓為 1.919、222.587、0.010、0.908、0.265 mg·kg?1時(shí)，組織開始出現(xiàn)病變，病變程度隨水/煤矸石比的增加而加重。肌肉組織中細(xì)胞完整性降低、細(xì)胞核數(shù)目減少、分布離散程度加深；鰓組織中鰓絲間距增大，鰓絲軟骨變薄，鰓絲末端鰓小片出現(xiàn)脫落，鰓小片彎曲程度加深、呈無規(guī)則排列。