不同演替階段下球囊霉素相關土壤蛋白對團聚體穩定性的影響

邸涵悅，郝好鑫, ，孫兆祥，姜海，程諒, ，郭忠錄*

1.華中農業大學水土保持研究中心，湖北 武漢 430070；2.長江水資源保護科學研究所，湖北 武漢 430051；3.丹江口市水土保持監測站，湖北 丹江口 442700；4.中國電力工程顧問集團中南電力設計院有限公司，湖北 武漢 430071

1996年，美國馬里蘭大學的Wright et al.（1996）在叢枝菌根真菌（Arbuscular mycorrhiza fungi，AMF）菌絲表面發現了一種能夠和單克隆抗體（MAb32B11）發生免疫性熒光反應的蛋白質。進一步研究發現，球囊霉素主要是由AMF所分泌的，AMF能夠與大多數植物物種形成共生體，當菌絲死亡后球囊霉素從菌絲表面脫落進入根際土壤中。由于現有的提取方法從土壤中提取出的蛋白還含有其他非球囊霉素成分，所以Rosier et al.（2006）認為，用“球囊霉素相關土壤蛋白”（Glomalin-related soil protein，GRSP）代替球囊霉素更為合適。研究發現，一方面GRSP具有較強的黏附土壤顆粒的能力（Wright et al.，1998），它能將較小的土壤顆粒粘聚成為微團聚體，進而形成一個較穩定的土壤單位（彭思利等，2010）；另一方面GRSP在土壤碳固定及循環過程中起著重要作用，其對土壤碳和氮庫作出的貢獻遠超出土壤中活性微生物的貢獻（Rillig et al.，2001）。

丹江口水庫是中國南水北調中線工程的水源地，流域良好的生態環境對水庫長期安全穩定運行起重要作用。土壤團聚體是土壤結構的基本單元，團聚體穩定性與土壤有機碳儲存與固定關系密切，是評價土壤質量和健康的重要指標之一（朱興菲等，2018）。研究表明植被演替過程對團聚體穩定性、GRSP均有影響。趙世偉（2012）就植被演替過程中土壤有機碳（Soil organic carbon，SOC）和團聚體穩定性的關系進行了探討，結果顯示隨著植被群落的恢復，土壤總有機碳含量和土壤固碳能力明顯提高，土壤的團聚體平均質量直徑逐漸增加，即土壤結構穩定性提高。闕弘等（2015）的研究表明，0—40 cm土層中總量球囊霉素相關土壤蛋白（Total Glomalin-related soil protein，T-GRSP）和易提取球囊霉素相關土壤蛋白（Easily extractable Glomalin-related soil protein，EE-GRSP）含量均表現為林地高于草地。孫利鵬（2018）研究發現，隨著植被恢復年限的增加，GRSP和有機質含量升高，團聚體穩定性指數增加，表明在植被恢復過程中GRSP對團聚體穩定性的提高及固碳作用的增強有顯著影響。然而，隨著演替的進行，GRSP和SOC對植被恢復的響應程度、團聚體有機碳的保護機制等問題尚不完全清楚。為此，本研究以胡家山小流域植被恢復過程中典型演替階段為研究對象，對其團聚體穩定性、GRSP和SOC分布特征進行分析，對比不同演替階段、不同土壤深度下GRSP與團聚體穩定性、土壤有機碳之間的關系，為丹江口地區植被恢復提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 研究區概況

研究區位于湖北省丹江口市胡家山小流域（ 111°12′22″— 111°15′20.5″E，32°44′17.8″—32°49′15.6″N），該地區屬于亞熱帶半濕潤季風氣候，多年平均氣溫 16.1 ℃，多年平均降水量 798 mm。流域內主要土壤類型包括紫色土、石灰土和黃棕壤。自然植被為溫性常綠針葉林、暖性常綠針葉林、落葉闊葉林、常綠闊葉林、針闊葉混交林、灌叢和草叢等。

1.2 樣品采集

土壤樣品采集在2018年8月進行，實驗于2018年 10—12月在華中農業大學資源與環境學院實驗室進行。選取研究區植被恢復過程中5種典型演替階段，即裸地、草地、灌木林、喬木林、喬灌混合林為研究對象，在每個樣地選擇4個植被蓋度較為一致的樣方（裸地、草地1 m×1 m，灌木林5 m×5 m，喬木林、喬灌混合林10 m×10 m）進行地上植被調查和土壤樣品的采集。其中裸地無優勢種，草地優勢種包括白茅（ImPeratacylindrica）、小蓬草（Conyzacanadensis）、牛筋草（Eleusineindica）、藎草（ArthraxonhisPidus），灌木林優勢種包括酸棗（ZiziPhusjujuba）、烏桕（SaPiumsebiferum）、白刺花（SoPhoradavidii）、小薹草（CarexParva）、杜荊（Vitexnegundo）、雞眼草（Kummerowiastriata），喬木林優勢種包括側柏（Platycladusorientalis）、小薹草（C.Parva），喬灌混合林優勢種包括側柏（P.orientalis）、杜荊（V.negundo）、白刺花（S.davidii）、小薹草（C.Parva）。在選取的典型樣地的對角線上挖掘3個土壤剖面，并自下而上采集0—10、10—20、20—30 cm土壤深度的土樣，3個剖面中相同層次的土樣進行混合，用四分法分取適量土樣裝入鋁盒，并用標簽記錄采樣信息。帶回實驗室后，去除土樣中的雜物、細根，部分土樣風干、碾碎后過0.105 mm孔徑土壤篩備用，其余土樣沿土壤裂隙掰成小塊并過篩，選取3—5 mm土樣備用。

1.3 研究方法

土壤容重和毛管孔隙度采用環刀法測定。有機碳采用重鉻酸鉀外加熱法測定（鮑士旦，2000）。土壤團聚體穩定性采用 LB法測定（Le Bissonnais，1996）。將風干獲得的3—5 mm團聚體在40 ℃條件下烘干24 h，使樣品初始含水量一致。而后分別進行如下3種處理，（1）快速濕潤（FW），將稱得的5 g團聚體迅速浸沒在去離子水中，10 min后用針管吸多余的水分。該處理模擬暴雨條件下團聚體的破壞過程。（2）預濕潤振蕩（WS），將稱得的5 g團聚體迅速浸沒在酒精中，排出團聚體顆粒中的空氣，10 min后用移液管吸掉酒精，將團聚體轉入盛有50 mL去離子水的錐形瓶中，加水到200 mL，加塞封蓋后上下振蕩20次，靜置30 min使其沉淀，然后用針管吸掉多余水分。該處理模擬機械外力作用下，例如雨滴打擊或徑流沖刷對團聚體的破壞作用。（3）慢速濕潤（SW），將稱得的5 g團聚體置于張力為?0.3 kPa的濕潤濾紙上，靜置30—40 min后團聚體完全濕潤。該處理模擬地表濕潤條件下，土壤通過毛管引力吸水從而造成團聚體破壞。將上述3種處理的團聚體轉移到沉浸在95%酒精中的篩子（0.05 mm）上，上下振蕩20次，每次振幅約2 cm，然后轉入燒杯中，在40 ℃的烘箱中烘干酒精。干篩過2、1、0.5、0.25、0.105 mm土壤篩，稱得每個粒級的破碎團聚體質量。每個處理設置3組重復。

團聚體穩定性指標采用以下公式計算：

式中，MWD為平均質量直徑（mm）；ri為篩組中第i個篩的孔徑（mm），r0=ri，rn=rn+1；wi為第i個篩上的破碎團聚體質量分數；n為篩子個數。

球囊霉素相關土壤蛋白采用考馬斯亮藍法測定（Wright et al.，1998）。EE-GRSP：取 0.5 g 風干土于試管中，加入 4 mL 的 20 mmol·L?1（pH 7.0）檸檬酸鈉溶液，在121 ℃、103 kPa的高壓滅菌鍋中提取30 min，冷卻后離心5 min（10000 g），收集上清液；T-GRSP：取0.5 g風干土于試管中，加入4 mL 的 50 mmol·L?1（pH 8.0）檸檬酸鈉溶液，在121 ℃、103 kPa的高壓滅菌鍋中提取60 min，冷卻后離心5 min（10000 g），收集上清液，重復提取直到上清液基本無色。分別吸取上清液1 mL加入5 mL考馬斯亮藍染色劑，在595 nm波長下比色。用牛血清蛋白標液，考馬斯亮藍法顯色，繪制標準曲線，計算EE-GRSP和T-GRSP含量。

1.4 數據處理與分析

本文中利用Excel 2016對數據進行整理，利用SPSS 17.0軟件基于鄧肯法對不同演替階段和不同土壤深度進行單因素方差分析（P＜0.05）；對GRSP和SOC與LB法3種處理方式下MWD和＞0.25 mm團聚體含量進行Pearson相關分析；對GRSP和SOC對團聚體穩定性指標的影響進行多元逐步回歸分析。利用Origin 2017軟件繪圖。

2 結果

2.1 不同演替階段下土壤理化性質

不同演替階段之間土壤有機碳存在顯著差異，0—10 cm 土層 SOC 含量介于 2.10—15.65 g·kg?1，喬木林和喬灌混合林的 SOC含量顯著高于裸地和草地（P＜0.05），10—20 cm 土層 SOC 含量介于1.51—10.81 g·kg?1，喬木林 SOC 含量顯著高于裸地和草地（P＜0.05），20—30 cm土層SOC含量介于0.60—3.64 g·kg?1，裸地 SOC 含量顯著低于其他演替階段（P＜0.05）。同一演替階段，不同土壤深度SOC含量表現為0—10＞10—20＞20—30 cm。草地、灌木林、喬木林和喬灌混合林0—30 cm平均SOC含量分別是裸地的2.9、4.9、7.3和5.8倍。同一土壤深度中不同演替階段土壤容重無明顯變化規律，同一演替階段下容重隨土壤深度的增加表現出增高的趨勢。不同土壤深度中喬木林和喬灌混合林毛管孔隙度較大（表1）。

表1 不同演替階段土壤性質Table 1 Soil properties as affected by different succession stages

2.2 不同演替階段下GRSP分布特征

不同演替階段EE-GRSP和T-GRSP含量都隨土壤深度的增加而降低，不同演替階段下在 0—30 cm土層均存在顯著差異（P＜0.05）。這是由于表層土壤中AMF含量更為豐富，能夠產生并積累更多的球囊霉素。裸地EE-GRSP含量最低，在0—20 cm顯著低于灌木林、喬木林和喬灌混合林，在20—30 cm顯著低于草地、喬木林和喬灌混合林（P＜0.05）。草地、灌木林、喬木林和喬灌混合林0—30 cm平均EE-GRSP含量分別是裸地的3.0、6.5、9.8、10.2倍。裸地T-GRSP含量最低，在0—10 cm顯著低于灌木林、喬木林和喬灌混合林，在10—30 cm顯著低于喬木林和喬灌混合林（P＜0.05）。草地、灌木林、喬木林和喬灌混合林0—30 cm平均T-GRSP含量分別是裸地的3.6、13.4、27.6、21.2倍。灌木林和喬灌混合林的 EE-GRSP/T-GRSP比值隨土壤深度的增加而顯著升高（P＜0.05）。0—10 cm 土層中 EEGRSP/T-GRSP比值介于24.1%—73.8%，灌木林、喬木林和喬灌混合林的 EE-GRSP/T-GRSP比值顯著低于裸地和草地，10—20 cm土層中EE-GRSP/TGRSP比值介于 32.5%—77.4%，喬木林的 EEGRSP/T-GRSP比值顯著低于裸地和草地（P＜0.05），20—30 cm土層 EE-GRSP/T-GRSP比值介于58.0%—85.3%，不同演替階段EE-GRSP/T-GRSP比值無顯著差異（P＞0.05）。與裸地相比，草地、灌木林、喬木林和喬灌混合林在 0—30 cm土層的 EEGRSP/T-GRSP平均值分別降低了 6.4%、21.2%、52.5%和41.5%（圖1）。

圖1 不同演替階段球囊霉素相關土壤蛋白差異Fig.1 Differences in GRSP in different succession stages

2.3 不同演替階段下團聚體特征

總體上不同處理方式下團聚體穩定性從大到小依次為MWDWS、MWDSW、MWDFW。同一土壤深度同一處理方式下，不同演替階段MWD和＞0.25 mm團聚體占比均有顯著差異（P＜0.05）。在FW處理下同一土壤深度不同演替階段MWD和＞0.25 mm團聚體占比差異最明顯，基本表現為喬木林和喬灌混合林最高，其次是灌木林，最后是草地和裸地。FW 處理下，灌木林、喬木林和喬灌混合林不同土壤深度間MWD差異顯著；WS處理下，喬木林和喬灌混合林不同土壤深度間 MWD差異顯著；SW處理下灌木林、喬木林和喬灌混合林不同土壤深度間 MWD 差異顯著（P＜0.05）。隨著土壤深度的增加，MWD基本呈減小趨勢。FW處理下，草地、灌木林、喬木林和喬灌混合林不同土壤深度間＞0.25 mm團聚體占比差異顯著；WS處理下，喬木林和喬灌混合林不同土壤深度間＞0.25 mm團聚體占比差異顯著；SW 處理下草地、灌木林、喬木林和喬灌混合林不同土壤深度間＞0.25 mm團聚體占比差異顯著（P＜0.05）。FW處理下，草地、灌木林、喬木林和喬灌混合林0—30 cm平均MWD分別是裸地的1.28、1.62、2.46和2.48倍；WS處理下分別為0.93、1.11、1.19和1.16倍；SW處理下分別為1.27、1.49、1.84和1.86倍（圖2）。

圖2 不同演替階段土壤團聚體穩定性Fig.2 Soil aggregate stability in different succession stages

2.4 團聚體穩定性與GRSP和SOC之間的關系

EE-GRSP、T-GRSP和SOC與LB法3種破壞機制下MWD和＞0.25 mm團聚體占比均有極顯著正相關關系（P＜0.01）。其中與EE-GRSP相關性最好的是MWDSW，其次為MWDFW；與T-GRSP相關性最好的是MWDSW和MWDFW；與SOC相關性最好的是MWDSW，其次為MWDFW。而EE-GRSP/SOC與團聚體穩定性指標無顯著相關關系，TGRSP/SOC與FW處理下團聚體穩定性指標有極顯著正相關關系（P＜0.01），與SW處理下團聚體穩定性指標有顯著正相關關系（P＜0.05），與WS處理下團聚體穩定性指標無相關關系。FW、SW處理下團聚體穩定性指標與EE-GRSP最為相關，WS處理下聚體穩定性指標與T-GRSP最為相關（表2）。

表2 SOC和GRSP及其比值與團聚體穩定性之間的相關關系Table 2 Relationship between SOC and GRSP and their ratios to soil aggregate stability

為了更好地探究EE-GRSP、T-GRSP和SOC對于6種團聚體穩定性指標的影響水平，對EE-GRSP、T-GRSP、T-GRSP/SOC和SOC這4個因素進行多元逐步回歸分析。分析結果顯示，在FW處理下，EE-GRSP對團聚體穩定性的影響最大，能夠解釋MWD 變化的 85.6%，EE-GRSP 每升高 1 mg·g?1導致MWD增大1.194 mm，T-GRSP/SOC是第2順次引入的因子，R2adj提高至89.4%。EE-GRSP能夠解釋＞0.25 mm團聚體變化的81.9%，EE-GRSP每升高 1 mg·g?1導致＞0.25 mm 團聚體增多 44.38%，TGRSP/SOC的引入將R2adj提高至86.7%。在WS處理下，僅有 T-GRSP被選入回歸方程，能夠解釋MWD 變化的 62.5%，T-GRSP 每升高 1 mg·g?1導致MWD增大0.116 mm，能夠解釋＞0.25 mm團聚體變化的 68.2%，EE-GRSP 每升高 1 mg·g?1導致＞0.25 mm團聚體增多3.972%。在SW處理下，僅有EEGRSP被選入回歸方程，能夠解釋 MWD變化的87.2%，EE-GRSP 每升高 1 mg·g?1導致 MWD增大1.093 mm，能夠解釋＞0.25 mm團聚體變化的68.4%，EE-GRSP 每升高 1 mg·g?1導致＞0.25 mm 團聚體增多37.758%。根據逐步回歸分析的顯著性檢驗，3種處理的 SOC變量均不顯著，因此未被選入回歸方程（表3）。

表3 SOC和GSRP及其比值與團聚體指標逐步回歸結果分析表Table 3 Multiple stepwise regression analysis between SOC and GRSP and their ratios to soil aggregate stability indexes

3 討論

3.1 不同演替階段球囊霉素相關土壤蛋白的差異

本研究中EE-GRSP和T-GRSP含量均隨土壤深度的增加而逐漸下降，不同演替階段存在顯著差異（P＜0.05）。這是由于枯落物、根系分泌物和微生物在土壤表層聚集（王振等，2013），導致表層土壤養分較高，AMF活性強，AMF的侵染率和孢子密度大，從而釋放更多的球囊霉素（Bauer et al.，1994）。本研究中灌木林、喬木林和喬灌混合林的GRSP含量較高，這是由于在喬灌木的覆蓋下，土壤中根系分布更密集，利于AMF與植物根系形成共生體，進而增加GRSP含量。

本研究中，相同土壤深度下喬木林和喬灌混合林EE-GRSP/T-GRSP比值低于裸地和草地，這可能是由于易提取球囊霉素是土壤中新近產生的與土壤結合不緊密的球囊霉素（Lovelock et al.，2004），總提取球囊霉素含量則較穩定，而裸地和草地土壤中缺少使易提取球囊霉素與土壤緊密結合的條件，因此其中 EE-GRSP/T-GRSP比值較大。而闕弘等（2015）的研究中林地和草地土壤中 EE-GRSP/TGRSP比值顯著高于耕作土壤，他認為人為干擾（如施用化肥、農藥）會降低AMF豐富度和活性，減少土壤中球囊霉素的產生，并加速球囊霉素分解，且使土壤中易提取球囊霉素易于向總球囊霉素轉化。本研究中EE-GRSP/T-GRSP比值隨土壤深度的增加而上升，與闕弘等（2015）的研究結果一致，而朱興菲等（2018）的研究結果中農地、核桃和側柏樣地土壤 EE-GRSP/T-GRSP比值隨土壤深度的增加而降低，苜蓿和刺槐樣地土壤 EE-GRSP/TGRSP比值隨土壤深度的增加而上升。由于 EEGRSP和T-GRSP含量均隨土壤深度的增加而逐漸下降，因此EE-GRSP/T-GRSP比值隨土壤深度的變化，取決于EE-GRSP和T-GRSP含量隨土壤深度變化的快慢，所以不同研究中該比值呈現出不同的變化規律。

3.2 不同演替階段土壤團聚體穩定性的差異

本研究結果顯示不同演替階段和不同土壤深度中土壤團聚體穩定性有所不同，與李鑒霖等（2014）、陳國靖等（2018）的研究結果一致。有研究表明，植物釋放的根系分泌物可以影響土壤中的微生物和土壤的物理性質，根系分泌物中的多糖對土壤顆粒有很強的黏著力，進而促進土壤團聚化。而且喬灌混合林和喬木林土壤根系數量多、分布深，根系通過穿插、擠壓和纏繞等物理作用，也能增加土壤中的大團聚體。植被群落演替過程中，土壤中粉+黏團聚體（＜0.053 mm）的含量逐漸減少，粉+黏團聚體黏合形成的微團聚體（0.053—0.25 mm）和中間團聚體（0.25—2 mm）含量逐漸增加，土壤團聚體穩定性逐漸提高。宋日等（2009）認為，不同的植物根系分泌物提高團聚體穩定性的大小也不同，這種差別是由于根系分泌物成分組成和根際微生物種類不同，分泌含碳多的有機物有利于土壤穩定性結構的形成。還有研究認為土壤團聚體穩定性與細根密切相關（Hao et al.，2020）。細根通過與菌根真菌相互作用產生的滲出物和結合劑促進了土壤團聚體的形成，并增強了土壤團聚體穩定性（Eisenhauer et al.，2011）。

郭曼（2009）認為植被群落正向演替與土壤性質改善互為動力，互相影響。一方面隨著演替的進行，植被覆蓋度和多樣性增加，植物產生的枯枝落葉和根系腐解物回歸土壤，使土壤的理化性質得到改善；另一方面腐解過程中產生的酸類物質可以促進土壤中難溶性物質向可供植物吸收利用的有效物質轉化，進而形成良性循環。同樣的，演替與團聚體穩定性提高也是互為動力，互相影響。一方面隨著演替的進行，植被覆蓋度增大，減緩雨滴對土壤的打擊能力，減少地表徑流，同時根系數量增多、分布加深，根系分泌物增多，土壤有機碳逐漸積累，都為大團聚體的形成提供有利條件；另一方面團聚體穩定性的提高意味著在相同的降雨條件下，土壤團聚體更不易被破壞，提高土壤的抗侵蝕能力同時也增強了水土保持的能力，為植被的生長和植被群落的演替提供了更好的環境。因此，通過植被恢復或其他措施提高地表覆蓋度，減少雨水對土壤團聚體的破壞，提高土壤抗侵蝕能力是解決土壤侵蝕問題的重要途徑。

3.3 球囊霉素與團聚體穩定性的關系

LB法是模擬不同濕潤破壞機制下團聚體穩定性的研究方法，其中FW處理模擬夏季大雨或暴雨時的消散作用，WS處理模擬雨滴打擊時的機械破碎作用，SW 處理模擬溫和降雨時團聚體內部黏土礦物不均勻脹縮導致的破壞（Le Bissonnais，1996）。一方面，本研究中FW處理對團聚體破壞性最大，說明暴雨是破壞研究區內土壤團聚體的主要因素。另一方面，逐步回歸結果顯示EE-GRSP對FW處理和 SW 處理下團聚體穩定性指標的解釋效果最好，T-GRSP對WS處理下團聚體穩定性指標的解釋效果更好，可見 EE-GRSP含量的升高對土壤團聚體抵抗消散作用和不均勻脹縮作用都有很大影響，而T-GRSP的升高對團聚體抵抗機械破碎作用有很大影響。已有研究指出土壤中的球囊霉素黏附土壤顆粒的能力比其他糖類物質高 3—10倍（Franzluebbers et al.，2000）。GRSP可以識別和保護有助于團聚體穩定性的多糖和微生物等（Oades，1984），能夠保護 SOC不被分解，促進 SOC的積累，提升團聚體穩定性（Zhang et al.，2015）。景航等（2017）的研究發現不同粒徑團聚體 T-GRSP、EE-GRSP含量與團聚體穩定性參數之間的關系有所差異，其中＞0.25 mm團聚體T-GRSP、EE-GRSP含量均與團聚體穩定性參數顯著相關，說明團聚體穩定性更依賴于大團聚體GRSP。

4 結論

（1）植被演替有助于土壤質量的提升和團聚體的穩定。喬木林和喬灌混合林覆蓋下土壤的 GRSP含量、SOC含量及團聚體穩定性均顯著高于其他演替階段（P＜0.05）。喬木林和喬灌混合林 0—30 cm平均 SOC 含量分別是 10.25 g·kg?1和 8.20 g·kg?1，分別為裸地的7.3倍和5.8倍；平均EE-GRSP含量分別是0.58 mg·g?1和0.61 mg·g?1（9.8倍和10.2倍），平均 T-GRSP 含量分別是 2.15 mg·g?1和 1.65 mg·g?1（27.6倍和21.2倍）；平均MWDFW分別是1.52 mm和1.53 mm（2.46倍和2.48倍）。說明演替階段進行到喬木之后GRSP和SOC的累積加強，進一步提高了團聚體穩定性。

（2）EE-GRSP、T-GRSP和SOC與LB法3種破壞機制下MWD和＞0.25 mm團聚體占比均有極顯著正相關關系（P＜0.01）。根據逐步回歸結果，本研究中FW處理和SW處理下EE-GRSP對團聚體穩定性指標的解釋效果最好，而在 WS處理下 TGRSP的解釋效果更好。