超聲波輔助酶法提取琯溪柚皮海綿層水溶性抗氧化膳食纖維工藝優化

薛 山，肖 夏，謝建山

(1.閩南師范大學生物科學與技術學院，福建漳州363000;2.菌物產業福建省高校工程研究中心，福建漳州363000;3.四川理工學院生物工程學院，四川自貢643000)

膳食纖維(dietary fiber，DF)憑借其特殊的結構組成和生理功效得到了學術界的廣泛關注［1］。1998年，Saura－Calixto［2］提出了一個新概念——抗氧化膳食纖維(antioxidant dietary fiber，ADF)，即大量天然抗氧化劑結合到DF基質中的產物。ADF按水中溶解性的不同分為水溶性膳食纖維(Soluble antioxidant dietary fiber，SADF)和非水溶性膳食纖維(Insoluble antioxidant dietary fiber，IADF)，SADF中富含黃酮類、酚酸以及縮合單寧等天然抗氧化成分［3－4］。在前期研究中，本團隊已證實植物性膳食纖維具有明顯的抗氧化活性，并且已廣泛應用于食品保鮮與功能食品研發等領域［5－7］。

琯 溪 蜜 柚(Citrus maxima(Burm.)Merr.cv.Guanximiyou)是享譽中外的我國特有的優良柚類品種，也是漳州平和地區的地標性水果，具有果大、汁多、口感酸甜等優良品性［8］。福建省平和縣琯溪蜜柚年產量達到180余萬t，總產值(超過20億元)占全縣農業總產值的40%以上［9］。近年來，柚類水果種植面積和產量不斷增長帶動了柚子加工業的快速發展。在柚子加工過程中，形成了大量的副產物，其中，占柚子鮮重16%～32%左右的柚皮是最主要的副產物［10－11］。琯溪蜜柚柚皮海綿層中富含水分、纖維素、木質素和多種生理活性成分，如果能作為功能原料被綜合利用，既可以減少資源浪費，也可以保護環境。

柚皮的綜合利用已成為國內外研究的熱點，但有關柚皮海綿層ADF的研究尚未有見報道。張荔菲等［3］研究認為，柚皮DF傳統提取方法(如熱水浸提法、堿提法)效率低且成本高，而超聲波、酶解等輔助提取法具有良好的效果，這是因為超聲波能在液體中高頻振動并產生空化效應，破壞細胞組織結構，有助于多糖的溶出和擴散;酶則可使植物細胞壁及細胞膜中的成分有效分解，從而提高提取率。因此，本研究采用Box－Benhnken設計與Matlab分析法，基于SADF的得率與抗氧化性，優化超聲波輔助酶法提取琯溪蜜柚柚皮海綿層的SADF，擬為蜜柚的綜合利用提供理論依據，為蜜柚產業的發展提供動力。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮的平和琯溪蜜柚柚皮 采收于九月下旬漳州柚之鄉食品有限公司提供;水楊酸、無水乙醇、七水合硫酸亞鐵、30%過氧化氫、硫酸、苯酚、十二水合磷酸氫二鈉、二水合磷酸二氫鈉 以上試劑均為分析純，購于西隴科技股份有限公司;纖維素酶(50 U/mg)河南亞統食品原料有限公司。

DGG－9140B電熱恒溫鼓風干燥箱 上海森信實驗儀器有限公司;FW100高速萬能粉碎機 天津市泰斯特儀器有限公司;AR124CN電子天平 奧豪斯儀器(上海)有限公司;US6180D超聲波發生器 北京優晟聯合科技有限公司;HH－2數顯電子恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司;UV5100B紫外可見分光光度計 上海元析儀器有限公司;STARTER 2100 pH計 奧豪斯儀器(上海)有限公司;SHZ－D(III)循環水式多用真空泵 河南省予華儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 原料預處理 將新鮮的柚子皮去除表面黃油胞層，剩余的海綿層切成0.2 cm薄片，于60℃鼓風烘干至恒重，之后粉碎過40目篩，得到海綿層柚皮粉，密封置于干燥器中備用。

1.2.2 柚皮SADF的提取工藝 參考吳笑臣等［12］方法略微修改。稱取柚皮粉5.0 g(m1)，按料液比1∶40 g/mL加入p H6.0(0.2 mol/L)的PBS緩沖溶液，均質后于常溫超聲功率180 W的條件下超聲處理30 min。向混合體系加入2.5%的纖維素酶溶液(稱取25 mg的纖維素酶，溶解1 mL pH6.0的檸檬酸緩沖液中)，45℃水浴80 min。酶解結束之后，冷卻至室溫，于8000 r/min離心10 min，收集上清液。將上清液65℃真空度－0.098 MPa旋蒸濃縮至原體積的1/3，轉入燒杯中，加入4倍體積的無水乙醇，室溫中靜置醇沉12 h，過濾后洗滌凍干得到SADF(m2)。SADF的得率按下試計算:

1.2.3 單因素實驗

1.2.3.1 超聲波作用時間對柚皮SADF得率和羥自由基清除率的影響 設定料液比1∶40 g/mL，纖維素酶溶液添加量2.5%，纖維素酶作用溫度45℃，纖維素酶作用時間80 min，考察不同超聲波作用時間10、20、30、40、50 min對柚皮SADF得率和羥自由基清除率的影響。

1.2.3.2 料液比對柚皮SADF得率和羥自由基清除率的影響 設定超聲波作用時間30 min，纖維素酶溶液添加量2.5%，纖維素酶作用溫度45℃，纖維素酶作用時間80 min，考察不同料液比1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60 g/mL對柚皮SADF得率和羥自由基清除率的影響。

1.2.3.3 纖維素酶添加量對柚皮SADF得率和羥自由基清除率的影響 設定超聲波作用時間30 min，料液比1∶50 g/mL，纖維素酶作用溫度45℃，纖維素酶作用時間80 min，考察不同纖維素酶添加量1.5%、2.0%、2.5%、3%、3.5%對柚皮SADF得率和羥自由基清除率的影響。

1.2.3.4 纖維素酶解溫度對柚皮SADF得率和羥自由基清除率的影響 設定超聲波作用時間30 min，料液比1∶50 g/mL，纖維素酶添加量3%，纖維素酶作用時間80 min，考察不同纖維素酶作用溫度25、35、45、55、65℃對柚皮SADF得率和羥自由基清除率的影響。

1.2.3.5 纖維素酶作用時間對柚皮SADF得率和羥自由基清除率的影響 設定超聲波作用時間30 min，料液比1∶50 g/mL，纖維素酶添加量3%，纖維素酶作用溫度45℃，考察不同纖維素酶作用時間40、60、80、100、120 min對柚皮SADF得率和羥自由基清除率的影響。

1.2.4 Box－Benhnken法試驗優化 在單因素實驗的基礎上，選擇對實驗結果影響最為顯著的三個因素料液比(A)、纖維素酶作用溫度(B)和纖維素酶作用時間(C)，以柚皮海綿層SADF得率和羥自由基清除率，根據Box－Behnken的中心組合試驗設計原理，建立3因素3水平的組合試驗進行優化。因素和水平見表1。

表1 響應面試驗因素水平Table 1 Factors and levels of response surface experiment

1.2.5 柚皮SADF抗氧化性的測定 參考Yu等［13］方法修改為:準確稱取0.30 g SADF，定容至100 mL制得樣品液。在10 mL比色試管中依次加入4.5 mmol/L的FeSO4溶液1.00 mL、4.5 mmol/L的水楊酸溶液1.00 mL、樣品液0.50 mL，4.4 mmol/L的H2O2溶液1.00 mL，用去離子水水定容至10 mL，搖勻，置于37℃恒溫水浴中處理30 min，在510 nm處測其吸光度，重復實驗，取平均值Ai;另用去離子水代替H2O2溶液重復上述試驗，測得參比吸光度Aj;用去離子水代替樣品溶液重復上述試驗，測得空白吸光度A0。羥自由基清除率用下式計算:

1.2.6 Matlab分析法 利用Matlab軟件，采用優化計算方法以及算法語言的圖形處理功能，通過編制程序M(程序代碼)，計算出料液比(A)，纖維素酶作用溫度(B)，纖維素酶作用時間(C)對SADF得率(y1)和羥自由基清除率(y2)的四維及三維交互影響結果。

1.3 數據處理

所有數據均用3次平行實驗的平均值表示，利用SPSS Statistics 24.0統計軟件對試驗數據進行單因素顯著性分析，P＜0.05表示結果顯著，標示為不同字母。利用Matlab(MATrix LA Boratory)軟件進行交互試驗數據計算及四維、三維繪圖。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 超聲波作用時間對柚皮SADF得率和羥自由清除率的影響 超聲波作用時間對柚皮SADF得率和羥自由基清除率的影響如圖1所示。物料的數量和結構性質都會影響超聲波提取的效果，長時間超聲產生的強烈空化效應會導致大分子成分降解［14－15］。在超聲波作用時間10～50 min范圍內，SADF的得率整體穩步升高后降低，在30 min時得率取得最大值。不同超聲波處理時間(10～30 min)所提SADF溶液(3 mg/mL)的羥自由基清除率隨著超聲時間的延長而顯著升高(P＜0.05)，之后顯著下降，其中30與40 min處理時間下所提SADF羥自由基清除率差異不顯著(P＞0.05)。綜合考慮SADF得率和羥自由基清除率，選擇超聲波作用時間30 min進行后續優化實驗。

圖1 超聲波作用時間對柚皮SADF得率和羥自由基清除率的影響Fig.1 Effect of ultrasonic time on extraction yield and antioxidant activity of SADF from spongy layer of pomelo peels

2.1.2 料液比對柚皮SADF得率和羥自由清除率的影響 如圖2所示，隨著料液比的升高，柚皮SADF的得率呈現先顯著升高后下降的趨勢(P＜0.05)，在料液比1∶40～1∶50 g/mL區間有較大值。在料液比1∶20～1∶60 g/mL范圍內，SADF的羥自由基清除率呈現整體顯著升高趨勢。推測原因可能是因為，料液比的增大有利于提取反應的正向進行，當料液比增大到一定程度，酶促反應底物濃度大大下降，導致SADF提取受到了抑制，但同時較高的料液比可能使得反應體系中其他水溶性、且具有抗氧化性的物質溶出，故SADF的羥自由基清除率不降反而升高。在保證有較高得率的前提下，選擇有較高羥自由基清除率的工藝條件，故選擇料液比1∶50 g/mL進行后續的試驗。

圖2 料液比對柚皮SADF得率和羥自由基清除率的影響Fig.2 Effect of solid－liquid ratio on extraction yield and antioxidant activity of SADF from spongy layer of pomelo peels

2.1.3 纖維素酶添加量對柚皮SADF得率和羥自由清除率的影響 當底物濃度一定時，增大酶添加量可以提高反應的速度，從而提高得率;當酶濃度達到足以使反應迅速完成時，即為酶的最大加入量，此時的化學反應達到動態平衡;但是當酶添加量過大時，則會打破動態平衡而抑制反應的進行，從而使得率下降［16］。隨著纖維素酶添加量的增加，柚皮SADF的得率和羥自由基清除率呈現整體升高的趨勢(P＜0.05)。纖維素酶添加量在2.5%～3.5%范圍內有較高得率，在3.0%添加量時羥自由基清除率最高，故纖維素酶添加量選擇3.0%。推測其原因，纖維素酶的添加可使柚皮中部分IADF發生降解，大分子鏈被切斷，分子量降低，溶解度增大，且部分IADF也會轉變成SADF，使得得率升高，同時，生成的SADF也具有一定的抗氧化活性，故羥自由基清除能力也顯著升高;當酶添加量繼續增加，IADF會降解為分子質量更小的低聚糖甚至單糖，聚合度低且無法被醇沉，從而使SADF得率降低，提取物的羥自由基清除能力也有所減弱［12］。

圖3 纖維素酶添加量對柚皮SADF得率和羥自由基清除率的影響Fig.3 Effect of cellulase addition on extraction yield and antioxidant activity of SADF from spongy layer of pomelopeels

2.1.4 纖維素酶作用溫度對柚皮SADF得率和羥自由清除率的影響 加熱溫度能夠顯著影響纖維素酶的活力，溫度過高，酶會失活，溫度過低，酶的活力會下降［16］。如圖4所示，隨著纖維素酶作用溫度的升高，柚皮SADF的得率及羥自由基清除率均呈現先顯著升高后降低的趨勢(P＜0.05)。SADF得率在水浴45℃時有最大值，不同酶作用溫度條件下所提SADF(3 mg/mL)羥自由基清除率在45～65℃區間有較大值，且數據差異不顯著(P＞0.05)。因此，纖維素酶作用溫度選擇45℃。

圖4 纖維素酶作用溫度對柚皮SADF得率和羥自由基清除率的影響Fig.4 Effect of cellulase temperature on extraction yield and antioxidant activity of SADF from spongy layer of pomelopeels

2.1.5 纖維素酶作用時間對柚皮SADF得率和羥自由清除率的影響 纖維素酶作用時間對柚皮SADF得率和羥自由基清除率的影響如圖5所示。隨著纖維素酶作用時間的延長，SADF的得率在40～100 min加熱過程中顯著升高(P＜0.05)，其中，酶作用80和100 min條件下得率差異不顯著(P＞0.05)，繼續延長加熱時間則得率顯著下降(P＜0.05)。SADF的羥自由基清除率在測定時間內也呈現先升高后下降的趨勢(P＜0.05)，在酶處理80 min后取得最大值。在保障有較高得率的前提下，選擇有較高羥自由基清除率的工藝參數，故綜合考慮選擇纖維素酶作用時間80 min。

圖5 纖維素酶作用時間對柚皮SADF得率和羥自由基清除率的影響Fig.5 Effect of cellulase action time on extraction yield and antioxidant activity of SADF from spongy layer of pomelopeels

2.2 Box－Benhnken優化柚皮SAD提取工藝實驗結果

2.2.1 Box－Benhnken雙響應面模型的建立 在單因素試驗結果的基礎上，確定了響應面試驗的參數范圍和工藝條件，根據Box－Behnken的中心組合試驗設計原理，選取三個顯著性影響較大的因素料液比(g/mL)、纖維素酶作用溫度(℃)、纖維素酶作用時間(min)作為考察因素，分別以A、B、C表示，以柚皮SADF的得率(Y1)和羥自由基清除率(Y2)為響應值，建立3因素3水平的響應面優化實驗，試驗結果如表2所示。

采用Design－Expert 8.0.6軟件對Box－Benhnken雙響應面分析得出Y1和Y2的回歸方程分別為:

表2 Box－Benhnken響應面優化試驗設計及結果Table 2 Design and results of response surface optimization of Box－Benhnken

2.2.2 Box－Benhnken響應模型的顯著性檢驗 對回歸模型進行方差分析，對模型系數進行顯著性檢驗，結果見表3和表4。方程可靠性由R2表示，其統計學上的顯著性由F值檢驗，影響因素的顯著性由模型系數的P值檢驗。由表3和表4可知:模型P均小于0.01(極顯著)，失擬項P均大于0.05(不顯著)，表明該回歸方程對試驗的擬合度高，誤差小。可以用該方程對不同條件下的提取效果進行分析、預測。通過F值可以得出，各因素對SADF提取量和羥自由基清除率的影響顯著性大小均為:料液比(A)＞纖維素酶作用時間(C)＞纖維素酶作用溫度(B)。

回歸方程可行度分析結果見表5。R2值越接近1，說明回歸方程越可靠，表明該回歸方程可以描述該試驗各因素與響應值的關系。SADF得率和羥自由基清除率的回歸方程相關系數R2分別為0.95和0.93，說明回歸方程的可靠性較好。值表明回歸方程校正后可以解釋的響應值變化，回歸方程矯正決定系數分別為0.89和0.84，得率方程信噪比Adeq Precision為14.02，說明該模型可用于預測，但羥自由基清除率的方程Adeq Precision為0.905，可預測性較低。C.V.(%)值反映的是回歸方程的置信度，值越小，說明回歸方程的置信度越高。因此這兩個回歸方程都具有較高可信度。

2.2.3 Box－Benhnken雙響應面最優工藝預測及驗證 根據Box－Benhnken雙響應面實驗結果分析，得到最佳工藝參數的理論值為:料液比1∶55 g/mL、纖維素酶作用溫度50℃和纖維素酶作用時間90 min，此時SADF提取量和羥自由基清除率的理論值分別為31.39%和63.98%，按照該工藝條件進行3組平行實驗對其進行驗證，得到得率和自由基清除率分別為32.82%±0.33%和64.43%±1.88%。

2.3 Matlab分析最優工藝區間

Matlab是國際上最優秀的科技應用軟件之一，具有強大的科學計算功能，并提供了專門的優化工具箱，通過建立研究問題的數學模型，編寫程序代碼，有效計算出最優解，廣泛應用于各研究領域［17］，如化工油脂提取優化［18］。Matlab可以通過編程得到某一影響因素(不同高、中、低)取值時對應的最優工藝取值范圍，從而彌補Box－Benhnken設計僅得到具體最佳工藝參數取值的不足，因此，Matlab優化分析針對實際生產過程中工藝參數的波動性更具有參考價值。

表3 基于SADF得率的方差分析結果Table 3 The variance analysis result based on the extraction yield of SADF

表4 基于SADF羥自由基清除率的方差分析結果Table 4 The variance analysis result based on the hydroxyl radical scavenging rate of SADF

表5 回歸方程的可行度Table 5 The feasibility of the regression equation

經過分析，得到料液比(g/mL)、纖維素酶作用時間(min)和纖維素酶作用溫度對柚皮SADF得率和羥自由基清除率的四維效果圖(圖6、圖7)。當SADF得率(y1)取得理論最大值(31.40%)時，通過矩陣計算得到料液比1∶55 g/mL，纖維素酶作用溫度為49.18℃，纖維素酶作用時間90 min;同理，當SADF羥自由基清除率(y2)取得理論最大值(66.68%)時，料液比1∶55 g/mL，纖維素酶作用溫度為40℃，酶作用時間為70 min。

圖6 基于y1優化的四維交互曲面Fig.6 The 4－D interactive surface based on the optimizing of y1

為了更好地描述分析數據間的交互影響，分別繪制當纖維素酶作用時間短(70 min)、中(80 min)、長(90 min)時，料液比與纖維素酶作用溫度對y1，y2交互影響的三維旋轉曲面與等高線投影圖(圖8)。

圖7 基于y2優化的四維交互曲面Fig.7 The 4－D interactive surface based on the optimizing of y2

當提取時間(C)取下限值(C=70 min)時，固定酶作用溫度(B)，隨著料液比(A)的升高，y1(實線)呈現逐漸升高的趨勢，y2(虛線)在料液比高于1∶50 g/mL之后呈現顯著升高的趨勢;固定A值，隨著B的升高，y1持續升高，y2則先降低后升高。此時，y1取值范圍為20.71%～29.72%，y2取值范圍為45.94%～66.68%。當料液比為1∶53～1∶55 mL/g，酶作用溫度在44～50℃時，y1和y2可同時取得最大值。

當提取時間(C)取中間值(C=80 min)時，y1和y2的變化趨勢與C=70℃時較為類似。固定B值，隨著A值增大，y1先減小后增大，料液比越趨近1∶55 mL/g越可以取得最大值。固定A值，隨著B值的增大，y2先減小，后增大，越趨向溫度或者高溫，反而越能夠取得最大值，約在45℃左右取值較低。此時，y1取值范圍為21.21%～28.86%，y2取值范圍為47.80%～64.66%。當料液比大于1∶53.5 mL/g，酶作用溫度約趨向50℃時，y1和y2可同時取得最大值。

當提取時間(C)取上限值(C=90 min)時，y1和y2的變化趨勢與C=70 min和80 min時也較為類似。此時，y1取值范圍為25.12%～31.40%，y2取值范圍為51.50%～66.16%。當料液比大于1∶53 mL/g，酶作用溫度48～50℃時，y1和y2可同時取得最大值。

圖8 各因素交互作用對SADF提取量及自由基清除率影響的等高線圖和響應面圖Fig.8 Contour plots and response surface plots of the effects of the interaction of various factors on the extraction amount and radical scavenging rate of SADF

綜上所述，當提取時間取上限值(C=90 min)時，y1可以取得較高理論值，當提取時間取下限值(C=70 min)時，y2可以取得理論較大值;當提取時間取較高值(C=90 min)，料液比越趨近1∶55 mL/g，纖維素酶作用溫度越趨近50℃，y1和y2的值越趨近最大值。

3 結論

以漳州平和琯溪蜜柚柚皮為原料，采用Box－Behnken響應面結合Matlab分析法優化柚皮海綿層SADF超聲波輔助酶法提取工藝。兼顧SADF得率與羥自由基清除率，得到最優提取工藝參數取值(范圍)為:超聲波前處理30 min，料液比1∶55 g/mL(1∶53～1∶55 g/mL)，纖維素酶添加量3%，纖維素酶作用溫度50℃(48～50℃)，纖維素酶作用時間90 min(上限值C=90 min)。此時，柚皮SADF的得率與羥自由基清除率可分別達到32.82%±0.33%，64.43%±1.88%，模型顯著可靠。Box－Benhnken響應面設計與Matlab分析相結合的優化方法，不僅能夠準確得到最佳提取方案，也能夠更直觀的找出合理的工藝參數區間，為SADF工業化加工利用研究提供理論基礎與創新依據。