響應(yīng)面法優(yōu)化黃精 大棗果酒發(fā)酵工藝及其抗氧化活性

宋藝君，郭 濤，劉世軍，呂慧鋒，徐娜娜，葉 建，焦 慧，賀如夢

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，陜西咸陽712046;2.空軍第九八六醫(yī)院藥劑科，陜西西安710054;3.西安千禾藥業(yè)股份有限公司 質(zhì)量部，陜西西安710075)

黃精為百合科植物黃精Polygonatum sibiricum Red.、多花黃精Polygonatum cyrtonema Hua或滇黃精Polygonatum kingianum Coll.et Hemsl.的干燥根莖，具有補氣養(yǎng)陰、健脾、潤肺、益腎的功效，用于脾胃氣虛，體倦乏力，胃陰不足，口干食少，肺虛燥咳等［1］。黃精主要含有多糖、皂苷、多酚、黃酮等成分，另外還含有多種氨基酸和微量元素［2］，具有抗衰老、提高免疫力、降血糖、抗病原微生物等作用［3－4］。大棗來源于鼠李科植物棗(Ziziphus jujuba Mill.)的干燥成熟果實［1］，具有補中益氣，養(yǎng)血安神的作用，用于脾虛食少，乏力便溏，婦人臟躁等［1］。大棗富含糖類、粗纖維、維生素、氨基酸、礦物質(zhì)等多種營養(yǎng)成分［5－7］，其中，多糖是大棗中具有重要生物功能的成分，營養(yǎng)保健價值很高［8－10］。現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)黃精、大棗均有抗氧化活性，且配伍后抗氧化作用增強，同時黃精、大棗均為藥食兩用中藥，近年來，隨著保健、營養(yǎng)食品的發(fā)展，黃精、大棗開始逐漸用于食品制造［11－14］，如飲料、果丹皮等。

以果汁或新鮮水果為原料，經(jīng)過破碎、榨汁，經(jīng)部分或全部發(fā)酵釀制而成的酒，稱為果酒。采用干果加水發(fā)酵保健果酒，發(fā)酵時間比較靈活，解決了原料的季節(jié)性問題，干果發(fā)酵避免了打漿的過程，對干果溫浸后發(fā)酵即可，且干果不容易霉變，使原料的貯存更容易。果酒品質(zhì)受到發(fā)酵工藝、物料質(zhì)量及酵母用量等因素影響［15－18］，所以確定最優(yōu)發(fā)酵工藝條件對釀造的果酒的質(zhì)量至關(guān)重要。

本試驗采用響應(yīng)面試驗設(shè)計，以酒精度和感官評分的總評歸一值為評價指標，優(yōu)化黃精－大棗果酒主發(fā)酵工藝，同時還采用1，1－二苯基－2－三硝基苯肼(DPPH)法，2，2－聯(lián)氮－二(3－乙基－苯并噻唑－6－磺酸)二銨鹽(ABTS)法測定不同發(fā)酵時間黃精－大棗果酒的抗氧化活性。通過對黃精－大棗果酒發(fā)酵工藝和抗氧化活性的研究，可為黃精－大棗果酒的發(fā)酵提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黃精 購自陜南;大棗 購自渭南市合陽縣，由陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院王繼濤教授分別鑒定為百合科植物黃精(Polygonatum sibiricum Red.)的干燥根莖，鼠李科植物棗(Zizyphus jujuba Mill.)的干燥成熟果實;XR干酵母 法國諾盟集團;果膠酶 法國LAFFORT公司;偏重亞硫酸鉀 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;ABTS、DPPH對照品 上海生物科技有限公司;白砂糖(食品級)人人樂超市;純凈水 咸陽漣漪有限公司;其余試劑 均為分析純。

SPX－Ⅱ型生化培養(yǎng)箱 上海新苗醫(yī)療器械公司;APLI型手持折光儀 衡州艾普計量儀器公司;BT－25S型電子天平 北京賽多利斯儀器有限公司;UV2550型紫外可見分光光度計 島津公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 黃精大棗果酒發(fā)酵工藝流程 大棗+黃精→加水浸泡、煎煮→過濾→藥液→酵母活化→成分調(diào)整→接種發(fā)酵→倒瓶→后發(fā)酵→澄清→灌裝→殺菌→陳釀→成品

1.2.1.1 黃精的加工炮制 取黃精藥材，按照2015版《中國藥典》黃精飲片方法炮制［1］。

1.2.1.2 酵母活化 于XR干酵母中加入大約10倍量38～42℃水，在40℃恒溫水浴鍋活化0.5 h，每隔10 min攪拌一次［19－20］。

1.2.1.3 操作要點 大棗剔除棗核、切小塊，黃精切片，將兩種物料按不同配比組合，放入燒杯，并加入適量水浸泡30 min，煎煮(沸騰后文火30 min)，煎煮液用紗布過濾，濾液加入一定量酵母后在25℃靜置發(fā)酵，發(fā)酵前3 d每天保持攪拌1次，發(fā)酵液無氣泡后發(fā)酵基本完成。

1.2.2 單因素實驗

1.2.2.1 (黃精∶大棗)物料組分比對果酒發(fā)酵效果的影響 選取1∶4、2∶3、1∶1、3∶2、4∶1(g/g)物料組分比，控制酵母用量0.5 g/L，液料比20∶1(mL/g)，以酒精度和感官評分為評價指標確定物料組分比。

1.2.2.2 液料比對果酒發(fā)酵效果的影響 選取15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1(mL/g)液料比，控制(黃精∶大棗)物料組分比1∶1(g/g)，酵母用量0.5 g/L，以酒精度和感官評分為評價指標確定液料比。

1.2.2.3 酵母用量對果酒發(fā)酵效果的影響 選取0.1、0.3、0.5、0.7 g/L酵母用量，控制物料組分比(黃精∶大棗)1∶1(g/g)，液料比20∶1(mL/g)，以酒精度和感官評分為評價指標確定干酵母用量。

1.2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗 以單因素實驗結(jié)果為基礎(chǔ)，進行三因素三水平的響應(yīng)面試驗，確定黃精－大棗果酒最優(yōu)的主發(fā)酵條件，試驗因素水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗因素水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments

1.2.4 發(fā)酵指標的測定

1.2.4.1 感官評價 黃精－大棗果酒酒體淡黃色，醇香可口，具有黃精和大棗特有的香味，無異味，澄清。由10名專業(yè)人員組成的感官評定小組參照GB/T 15038－2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》對黃精－大棗果酒從澄明度(25分)、色澤(25分)、滋味(25分)和香氣(25分)4個方面進行感官評定，酒樣總分為4項得分之和，滿分為100分。感官評分標準見表2。

1.2.4.2 酒精度測定 按GB/T 15038－2006相關(guān)規(guī)定執(zhí)行。

1.2.4.3 理化指標和微生物指標的測定 按GB/T 15038－2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中規(guī)定的方法測定果酒中的總糖、總酸、干浸出物指標。按GB/T 4789.2、GB/T 4789.3、GB/T 4789.4、GB/T 4789.5、GB/T 4789.10規(guī)定的方法測定微生物指標。

表2 果酒感官評分標準Table 2 Sensory evaluation standards of fruit wine

1.2.5 抗氧化活性試驗 黃精－大棗果酒的抗氧化活性試驗分為對DPPH﹑ABTS自由基的清除能力的測定，參考文獻方法測定。

1.2.5.1 DPPH自由基清除能力的測定 參考文獻方法［21］。稱取9.85 mg DPPH以無水乙醇定容至250 mL作為DPPH工作液，在反應(yīng)體系中，于10 mL試管中加入200μL不同濃度的樣品溶液，再加入2 mL DPPH工作液，振蕩搖勻，于室溫下避光靜置30 min，測定517 nm處的吸光值，以加入等量的超純水作為空白對照。以樣品濃度為自變量，自由基清除率為因變量作圖并進行線性擬合，計算IC50值，其中IC50值定義為清除率為50%時所需抗氧化劑的濃度，所需濃度越低，表明該物質(zhì)抗氧化性越強。

DPPH自由基清除率(%)=(1－As/A0)×100

其中:As為樣品管的吸光值，A0為對照管的吸光值。

1.2.5.2 ABTS自由基清除能力的測定 參考文獻方法［21］。稱取0.1920 g ABTS，0.0331 g K2S2O8于燒杯中，并用去離子水定容至50 mL，使ABTS濃度為7 mmol/L，過硫酸鉀的濃度為2.45 mmol/L，將該溶液于室溫下暗處靜置12～16 h。將生成的ABTS自由基溶液用磷酸緩沖液(PBS，0.01 mol/L，pH7.4)稀釋至734 nm處吸光值為0.70［22］。反應(yīng)體系中，于10 mL試管中加入20μL不同濃度的樣品，再加入2 mL ABTS反應(yīng)液，振蕩搖勻，室溫下靜置10 min，測定反應(yīng)液在734 nm處的吸光值，以不加入樣品的ABTS自由基溶液為空白對照，并計算IC50值。

ABTS自由基清除率(%)=(1－As/A0)×100

其中，As為樣品管的吸光值，A0為對照管的吸光值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel軟件進行數(shù)據(jù)分析和作圖，采用Design Expert 8.0.6軟件進行響應(yīng)面試驗設(shè)計和結(jié)果分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 物料組分比對主發(fā)酵效果的影響 由圖1可知，當黃精所占比例相對較小時，隨著其比例的逐步增加，果酒的感官評分也隨之增高，但酒精度指標變化不明顯;當黃精和大棗的比例達到3∶2(g/g)時，果酒的感官評分達峰值(93分);但當黃精比例繼續(xù)增加時，酒精度和感官評分均出現(xiàn)下降的趨勢。盡管黃精經(jīng)發(fā)酵后產(chǎn)生的獨特風(fēng)味可克服原料少釀酒香氣單一的缺點，但其所占比例增大后易使酒體出現(xiàn)較強的甜味。故當大棗、黃精兩者比例適當時，可賦予果酒特殊的風(fēng)味，因此選擇物料組分比(黃精∶大棗)2∶3、1∶1和3∶2(g/g)用于后續(xù)響應(yīng)面優(yōu)化試驗設(shè)計。

圖1 物料組分比對主發(fā)酵的影響Fig.1 Effects of material composition ratio on main fermentation

2.1.2 液料比對主發(fā)酵效果的影響 由圖2可知，液料比在15∶1～25∶1(mL/g)范圍內(nèi)變化時，果酒的評價指標(酒精度和感官評分)隨著溶劑比例的增大而增高，感官評分最高為91分，對應(yīng)的酒精度也達到最大，為8.02%vol;當液料比進一步增大，易出現(xiàn)酒精度偏低、風(fēng)味不佳的現(xiàn)象。因此選擇液料比20∶1、25∶1、30∶1(mL/g)用于后續(xù)響應(yīng)面優(yōu)化試驗設(shè)計。

圖2 液料比對主發(fā)酵的影響Fig.2 Effects of water/material ratio on main fermentation

2.1.3 酵母用量對主發(fā)酵效果的影響 由圖3可知，當酵母用量處于0.1～0.5 g/L時，隨著其用量的逐步增加，果酒的評價指標(酒精度和感官評分)也隨之增加。一般酵母用量過低時，物料發(fā)酵不完全，造成發(fā)酵液酒精度偏低及酒香不明顯等現(xiàn)象。當酵母用量增加到0.5 g/L時，果酒的感官評分為90分;當酵母用量進一步增加時，酒精體積分數(shù)雖有增大，但易造成酒醅發(fā)酵過于快速、整個果酒酒體出現(xiàn)苦味的現(xiàn)象。故選擇酵母用量為0.3、0.5、0.7 g/L用于后續(xù)響應(yīng)面優(yōu)化試驗設(shè)計。

圖3 干酵母用量對主發(fā)酵的影響Fig.3 Effects of dry yeast dosage on main fermentation

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化發(fā)酵工藝

2.2.1 試驗設(shè)計和結(jié)果 在單因素實驗的基礎(chǔ)上，選取物料組分比(X1)、液料比(X2)、酵母用量(X3)為考察因素，以酒精度和感官評分的OD值(Y)為評價指標進行響應(yīng)面試驗設(shè)計。OD值計算步驟［23］:采用Hassan法對酒精度(d1)和感官評分(d2)指標進行歸一化處理，di=(Mi－Mmin)/(Mmax－Mmin)。式中di為每一指標的OD值，Mi為指標測量值，Mmax和Mmin指每一指標在所有實驗中的最大值和最小值。總評歸一值(OD)=(d1+d2+d3+…dk)/k(k為指標數(shù))。響應(yīng)面試驗設(shè)計方案和結(jié)果如表3所示。

2.2.2 模型擬合和顯著性分析 采用Design－Expert 8.0.6軟件，將表3中的指標成分(酒精度和感官評分)的OD值進行多元回歸擬合和二項式分析，建立黃精－大棗果酒發(fā)酵工藝OD值(Y)對物料組分比(X1)、液料比(X2)、酵母用量(X3)的二次回歸模擬方 程Y=－5.02424+1.21322X1+0.36842X2+1.43136X3－0.084928X1X2+1.41747X1X3－0.15363X2X3

回歸模型的方差分析結(jié)果見表4。由表4可知，在1次項中，X1為顯著項(P＜0.05)，X2、X3為極顯著項(P＜0.01)，P值分別為0.0151、0.0022、0.0002，顯著程度X3﹥X2﹥X1，說明酵母用量對響應(yīng)值的影響最大，液料比次之，物料組分比最小;2次項中，為顯著項(P＜0.05)，說明液料比對響應(yīng)值的影響是非線性的;交互項中，X1X2、X2X3為極顯著項(P＜0.01)，X1X3為顯著項(P＜0.05)，表明X1和X2、X2和X3之間交互作用極顯著，X1和X3之間交互作用顯著。

擬合模型的P值小于0.01，本模型極顯著，失擬項的P值大于0.05，不顯著;該回歸模型的總決定系數(shù)R2=0.9294，調(diào)整決定系數(shù)，變異系數(shù)CV=5.08，以上參數(shù)均說明該模型擬合程度好，實驗誤差小，且模型的殘差可能是由隨機誤差所產(chǎn)生。模型能夠較好地反映物料組分比(X1)、液料比(X2)、酵母用量(X3)與酒精度和感官評分的OD值(Y)之間的變化關(guān)系，能夠用來對黃精－大棗果酒發(fā)酵工藝進行分析和預(yù)測。

按所得模型繪制物料組分比、液料比和酵母用量的交互作用對黃精－大棗果酒主發(fā)酵工藝影響的3D響應(yīng)面圖如圖4所示。響應(yīng)面圖是響應(yīng)值對各影響因素所形成的三維空間曲面圖，通過響應(yīng)面圖可形象看出最優(yōu)取值點及各參數(shù)之間的相互作用［24］。由圖4可直觀看出各因素交互作用對果酒酒精度和感官評分的OD值的影響，如果曲線越陡，則表明該因素對果酒OD值的影響越大［25］。從圖4可看出X3(酵母用量)對果酒OD值的影響最大，X2(液料比)次之，X1(物料組分比)最后，與表4方差分析的結(jié)果一致。根據(jù)試驗分析結(jié)果，計算并預(yù)測二次回歸方程，結(jié)果黃精－大棗果酒最優(yōu)主發(fā)酵工藝為物料組分比(黃精∶大棗)2∶3(g∶g)，液料比29.71(mL∶g)，酵母用量0.35 g/L，OD值為0.9852。

表3 響應(yīng)面試驗設(shè)計和試驗結(jié)果Table 3 Design and results of response surface

表4 方差分析Table 4 Analysis of variance

圖4 X1、X2、X3交互作用的三維響應(yīng)面圖Fig.4 3D response surface of X1，X2，X3 for their mutual interaction

2.3 驗證實驗

根據(jù)最優(yōu)工藝篩選結(jié)果，結(jié)合實際情況，將黃精－大棗果酒最優(yōu)主發(fā)酵工藝調(diào)整為物料組分比2∶3(g/g)、液料比30∶1(mL/g)，酵母用量0.35 g/L。根據(jù)各因素優(yōu)選的結(jié)果進行3組平行驗證試驗，得到的黃精－大棗果酒的感官評分為(90.67±1.53)分，酒精度為9.23%±0.30%vol，測定結(jié)果穩(wěn)定，偏差不大，說明該試驗結(jié)果合理可靠。

2.4 理化指標

經(jīng)測得黃精－大棗果酒在最優(yōu)發(fā)酵工藝條件下的酒精度為9.2%vol，干浸出物32.8 g/L，總酸7.2 g/L(以酒石酸計)，總糖37.4 g/L(以葡萄糖計)，半甜型。均符合國家標準的要求。

2.5 微生物指標

大腸菌群≤3 MPN/100 mL，菌落總數(shù)≤50 CFU/mL，致病菌(沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌):不得檢出。均符合國家標準的要求。

2.6 黃精－大棗果酒發(fā)酵過程抗氧化活性的變化

2.6.1 黃精－大棗果酒發(fā)酵過程DPPH自由基清除率的變化 由圖5可知，黃精－大棗果酒發(fā)酵過程對DPPH自由基的清除率基本處于高水平，最高值99.5%，說明黃精－大棗提取液和發(fā)酵液均具有較強的清除DPPH自由基能力。圖5中DPPH自由基清除率先緩慢上升后緩慢下降，可能與發(fā)酵液中所含抗氧化成分多糖、多酚和黃酮的含量變化有關(guān)。0～72 h，DPPH自由基清除率升高，此階段果酒發(fā)酵速度較快，由于黃精、大棗前處理時的浸泡、煎煮使所含多糖、黃酮和多酚等成分溶出從而使其含量升高，抗氧化活性提升。72 h后是發(fā)酵后期，DPPH自由基清除率慢慢下降，可能是由于發(fā)酵過程中多糖的轉(zhuǎn)化，黃酮的不穩(wěn)定性及多酚被分解，導(dǎo)致抗氧化活性降低［26－27］。

圖5 發(fā)酵過程DPPH自由基清除率的變化Fig.5 Changes of DPPH radical scavenging rate during fermentation process

2.6.2 黃精－大棗果酒發(fā)酵過程ABTS自由基清除率的變化 由圖6發(fā)現(xiàn)，ABTS與DPPH自由基清除率有相似的變化趨勢，總體呈現(xiàn)先升高后降低趨勢，72 h時最高值為92.0%。0～72 h，果酒發(fā)酵速度快，同樣由于黃精、大棗的浸泡、煎煮使所含多糖、黃酮和多酚等成分溶出從而使其含量升高，ABTS自由基清除率升高。72 h后，發(fā)酵速率降低，酒精含量最高，多糖、黃酮和多酚等抗氧化成分含量降低，ABTS自由基清除率降低。發(fā)酵結(jié)束后黃精－大棗果酒的ABTS自由基清除率略高于黃精－大棗提取液。

圖6 發(fā)酵過程ABTS自由基清除率的變化Fig.6 Changes of ABTSradical scavenging rate during fermentation process

3 結(jié)論

在單因素實驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，對黃精－大棗果酒的主發(fā)酵工藝條件采用響應(yīng)面法進行了優(yōu)化，根據(jù)試驗結(jié)果，影響果酒評價指標的因素按主次順序依次為干酵母用量、液料比和物料組分比，最終確定黃精－大棗果酒最優(yōu)主發(fā)酵工藝條件為:物料組分比2∶3(g/g)，液料比30∶1(mL/g)，酵母用量0.35 g/L;在此條件下得到的黃精－大棗果酒表現(xiàn)出均勻的淡黃色，酒香優(yōu)雅，酒體協(xié)調(diào)，清澈透明，具有黃精和大棗典型風(fēng)味;黃精－大棗果酒發(fā)酵過程中的DPPH清除率、ABTS清除率均呈現(xiàn)前期快速增長，后期逐漸下降的變化趨勢，其最大值分別達到了99.5%、92.0 %。