黑果枸杞花色苷p H和氨氣敏感性及其抗氧化活性

張美清，曾繁森，葉妍琦，鄭詩鈺，李 潔，費 鵬，*

(1.閩南師范大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，福建漳州363000;2.閩南師范大學(xué)閩臺特色園林植物福建省高校重點實驗室，福建漳州363000)

黑果枸杞(Lycium ruthenicum)在中國西北干旱地區(qū)分布較為廣泛，作為茄科(Solanceae)枸杞屬(Lycium)的植物［1］，其果實一般呈黑色，在成熟的漿果中含有豐富的花色苷，其種類有矮牽牛素－3－O－(6－O－對香豆酰)蕓香糖苷－5－O－葡萄糖苷、矮牽牛素－5－O－葡萄糖苷和飛燕草素－3－O－葡萄糖苷等八種［2］。花色苷類色素在不同p H條件下苯并吡喃氧鎓離子結(jié)構(gòu)會轉(zhuǎn)變成其它結(jié)構(gòu)形式，酸性環(huán)境中以紅色的氧鎓陽離子呈現(xiàn)，堿性環(huán)境中以藍(lán)色的醌型結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)［3］，花色苷具有較高的營養(yǎng)價值和良好的功效作用，當(dāng)今國內(nèi)外大部分專家學(xué)者已經(jīng)接受并認(rèn)可其抗氧化性以及防治心腦血管和預(yù)防癌癥等疾病的功效［4－5］。

肉類食品中揮發(fā)性鹽基氮的含量能夠客觀地反映其腐敗程度，目前理化檢驗中揮發(fā)性鹽基氮檢測法檢測準(zhǔn)確度較高，但需要在實驗室中操作，過程繁瑣且耗時較長，不能高效、簡便地進行檢測［6］，難以廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)生活中。花色苷對于揮發(fā)性鹽基氮具有良好的響應(yīng)，且其顏色變化和肉類的腐敗程度呈現(xiàn)出一定的相關(guān)性［7］，因此，通過花色苷溶液顏色的變化可以直觀反映肉制品的新鮮程度。

目前，對于黑枸杞中花色苷的pH敏感性、對不同濃度氨氣和肉類腐敗氣味的響應(yīng)、及其抗氧化活性等方面研究鮮見，這使黑果枸杞的功效及價值得不到充分利用，資源開發(fā)不夠全面。因此，本研究采用溶劑浸提及旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮的方法，提取黑果枸杞中的花色苷。通過觀測花色苷顏色在不同pH下的變化，分析其p H敏感性;不同濃度氨氣及對肉類腐敗氣味的響應(yīng)測試，探究其對腐敗氣體的敏感度;將VC溶液作為花色苷溶液的對照品，通過測定其羥基自由基清除率來探討黑果枸杞花色苷的抗氧化性。全文研究結(jié)果能夠為黑果枸杞資源開發(fā)利用提供一定的科學(xué)理論依據(jù)，也為其是否能應(yīng)用于氣敏性及抗氧化性食品包裝材料的制備作為參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑果枸杞干 特級，寧夏;豬肉、牛肉 購于漳州市薌城區(qū)新華都超市;本文所用無水乙醇、乙酸、濃鹽酸(37%)、濃氨水(28%)、檸檬酸、磷酸二氫鈉、水楊酸、VC(抗壞血酸)等試劑 均為AR級，西隴科學(xué)股份有限公司。

MultiSkan Go全波長酶標(biāo)儀 美國賽默飛世爾有限公司;FW 100高速萬能粉碎機 天津市泰斯特儀器有限公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;NICOLET IS 10傅里葉紫外分光光度計 美國賽默飛世爾有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 黑果枸杞花色苷的提取 將適量干燥黑果枸杞放于粉碎機中粉碎，隨后過40目篩以得到顆粒適當(dāng)?shù)蔫坭椒勰瑢⑵渲糜陉幇蹈稍锏牡蜏丨h(huán)境中保存。將同等體積的無水乙醇和2%乙酸溶液均勻混合作為提取劑，將其與黑果枸杞粉末按20∶1 mL/g加入提取瓶混合均勻，隨后將其用超聲振蕩0.5 h，接著將浸提液放于50℃水浴鍋中浸提3 h后取出進行抽濾，得到色素粗提液［8－9］。將色素粗提液放在50℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中蒸發(fā)濃縮，最終得到花色苷濃縮液，將其保存在密封試劑瓶且放于黑暗低溫環(huán)境中，備用。

1.2.2 花色苷含量測定 總花色苷含量采用pH示差法測定［10］。分別測定黑果枸杞花色苷在p H1.0鹽酸－檸檬酸標(biāo)準(zhǔn)緩沖液和p H4.5檸檬酸－磷酸氫二鈉標(biāo)準(zhǔn)緩沖液中于紫外分光光度計400～800 nm范圍內(nèi)掃描情況，可知相應(yīng)的最大吸收波長和最大吸收波長處的吸光度值A(chǔ)max。總花色苷含量(以矢車菊素－3－葡萄糖苷計)用以下公式計算:

式中，吸光度值:A:(A523nm－A700nm)pH1.0－(A540nm－A700nm)pH4.5;MW:矢車菊－3－葡萄糖的分子質(zhì)量(449.2 g/mol);DF:稀釋因子(V/Wt=10);ε:摩爾消光系數(shù)(26900 L·mol－1·cm－1)，L:光路長度(0.51995 cm)。

1.2.3 黑果枸杞花色苷對p H的響應(yīng)測試 分別配制pH1.0～p H13.0的標(biāo)準(zhǔn)pH緩沖液備用;每次取1 mL花色苷溶液分別加入13支10 mL的容量瓶中，取上述pH1.0～pH13.0的緩沖液定容至10 mL，混合均勻后將其放于全波長酶標(biāo)儀中作全波長掃描。測定黑果枸杞花色苷提取物的吸光度及pH敏感性。

1.2.4 黑果枸杞花色苷的智能指示

1.2.4.1 黑果枸杞花色苷對揮發(fā)氨的響應(yīng)試驗 配制濃度分別為0.297、0.371、0.495、0.742、1.484 mol/L濃度的氨水溶液;取25 mL花色苷溶于100 mL容量瓶，用水定容，混合均勻備用;依次取上述花色苷溶液5 mL分別加入五個康威式擴散皿內(nèi)室中，再分別取已配制的各濃度氨水5 mL加入擴散皿外室，將其放于通風(fēng)櫥中反應(yīng)1 h，在此期間每隔10 min將其進行全波長掃描。分析黑果枸杞花色苷溶液隨著時間延長對揮發(fā)氨的響應(yīng)。

1.2.4.2 黑果枸杞花色苷對肉類新鮮程度的響應(yīng)試驗 稱取25 g豬肉和25 g牛肉，將其剁碎成肉末狀后分別放于康威式擴散皿外室中，取25 mL花色苷濃縮液，用水定容至100 mL，向上述擴散皿內(nèi)室中分別加入5 mL花色苷稀釋液，做三組平行，存放于常溫下干燥通風(fēng)環(huán)境，每天相同時間放于紫外分光光度計中測定其吸光度，連續(xù)測5 d判定黑果枸杞花色苷對不同新鮮程度的肉類食品的響應(yīng)。

1.2.5 羥基自由基清除率測定 參照高亮等［11］的方法作了適當(dāng)變動，采用水楊酸法測定花色苷濃縮液羥基自由基清除能力，分別配制2 mmol/L的FeSO4溶液和H2O2溶液、100 mg/L的VC溶液;用無水乙醇作溶劑配制2 mmol/L水楊酸溶液;取10 mL花色苷濃縮液，定容至100 mL;分別取3 mL FeSO4溶液和水楊酸乙醇溶液依次加入到20支10 mL離心管中，混合均勻;分別取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8和2.0 mL的VC溶液和0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8和2.0 mL的花色苷濃縮液加入到上述離心管中，將離心管置于37℃水浴中加熱0.5 h，進行全波長掃描，測定各個吸光度。羥基自由基清除率計算公式為:

式中，Y:羥基自由基清除能力，%;Ai:加入樣品后的吸光度;A0:樣品本身的吸光度值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本研究中涉及的實驗內(nèi)容均重復(fù)3次并采用SPSS Statistics 22.0計算標(biāo)準(zhǔn)差;所有分析圖運用Origin 2017和Adobe Photoshop CC2019進行繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑果枸杞花色苷濃縮液中花色苷的含量

圖1反映了在波長400～800 nm范圍內(nèi)，黑果枸杞花色苷溶液pH=1和pH=4.5時的光譜情況。實驗采用pH示差法測定黑果枸杞濃縮液中總花色苷的含量，由圖1可知，黑果枸杞花色苷在p H=1時，在523和700 nm處分別有最大吸光度1.020和最小吸光度0.012，當(dāng)pH=4.5時在540和700 nm處有最大吸光度0.120和最小吸光度0.021，將數(shù)據(jù)代入1.2.2公式中可得，此次實驗中黑果枸杞花色苷濃縮液中花色苷含量為291.93 mg/L。

2.2 黑果枸杞花色苷顏色對pH的響應(yīng)

圖1 黑果枸杞花色苷在pH1.0和pH4.5時可見光區(qū)全波段光譜圖Fig.1 Full－band spectra of anthocyanins from Lycium barbarum at pH1.0 and pH4.5

圖2 反映了不同p H下黑果枸杞花色苷顏色的變化(左)和可見光區(qū)全波段光譜圖的情況(右)，以此探究其pH敏感性。由圖2(左)可知，在p H1.0～pH13.0變化范圍內(nèi)，隨著p H的增大，黑果枸杞花色苷顏色從紫粉色最終變?yōu)辄S色。在pH1.0～p H4.0范圍內(nèi)，其顏色由粉紫色逐漸變淡為無色;在p H5.0～pH8.0范圍內(nèi)，顏色由無色逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榫G色;在p H9.0～p H13.0范圍內(nèi)，暗黃色逐漸變亮。由圖2(右)可知，在pH1.0～p H4.0范圍內(nèi)，p H1.0時花色苷的最大吸收波長為522 nm，當(dāng)p H逐漸增大到4.0時，其最大吸收波長向533 nm方向移動，同時，其最大吸收峰不斷減小;在p H5.0～pH8.0范圍內(nèi)，其最大吸收峰所處波長發(fā)生紅移，由533 nm到619 nm，pH8.0時出現(xiàn)最大吸收峰，此時對應(yīng)波長在619 nm附近。花色苷顏色之所以在不同的pH中呈現(xiàn)出顏色明顯差別，是因為在不同的p H環(huán)境中，具有不同的化學(xué)結(jié)構(gòu)［12］。在pH1.0～pH4.0間，強酸性環(huán)境使花色苷主要以黃烊鹽離子的形式存在，隨著酸性減弱，其結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化為假堿、查耳酮［13］，其最大吸收峰不斷減小，粉色隨之消失直到成無色狀態(tài)［14］;p H5.0～p H8.0間，花色苷結(jié)構(gòu)逐漸變成醌式堿［15］，引起黃烊鹽離子濃度和溶液光澤一同降低，各個pH對應(yīng)的最大吸收峰明顯增大，溶液顏色呈現(xiàn)綠色［16］;在pH9.0～p H13.0間，隨著堿性增強，花色苷結(jié)構(gòu)繼續(xù)發(fā)生某些化學(xué)轉(zhuǎn)變［17］，溶液顏色實現(xiàn)從淺綠色、黃綠色、棕黃色、鮮黃色的轉(zhuǎn)變。以上結(jié)果皆表明，花色苷溶液能夠在不同p H中發(fā)生顯著的顏色反應(yīng)，有較強的pH敏感性。

圖2 不同pH下黑果枸杞花色苷的顏色和可見光區(qū)全波段光譜圖Fig.2 The color of anthocyanin and its full band spectrum in visible region of Lycium barbarum under different pH values

圖3 不同濃度氨水揮發(fā)下黑果枸杞花色苷70 min內(nèi)可見光區(qū)全波段光譜圖Fig.3 The full band spectrum of anthocyanin in visible light region in 70 minutes under different ammonia concentration volatilization

2.3 黑果枸杞花色苷的智能指示

揮發(fā)性鹽基氮是指由于細(xì)菌及有關(guān)酶的影響，動物食品在變腐敗過程中，因為蛋白質(zhì)分解產(chǎn)生的氨以及胺類等堿性含氮物質(zhì)［18］。因而，能夠通過揮發(fā)性鹽基氮的含量判斷動物性食品的新鮮程度。本實驗在常溫常壓條件下進行，用豬肉、牛肉兩種生活中常見肉類為樣品，氨氣為腐敗特征氣體［19］，用以模擬肉類食品在新鮮程度發(fā)生改變時含氮化合物的揮發(fā)，實驗反映了黑果枸杞花色苷對氨氣、肉類樣品不同新鮮程度的顏色響應(yīng)及其靈敏度情況。以此判定是否能夠用黑果枸杞花色苷來即時檢測食品的新鮮程度。

2.3.1 黑果枸杞花色苷對揮發(fā)氨的響應(yīng)測試 圖3反映了在70 min內(nèi)每間隔10 min在不同濃度氨水下，黑果枸杞花色苷的可見光區(qū)全波段圖譜掃描。由圖3可知，隨著時間延長，花色苷溶液吸收峰不斷減小，且氨水濃度越大變化越快，在30 min時，氨水濃度為0.297、0.371、0.495、0.742 mol/L所對應(yīng)花色苷溶液最大吸光值分別為0.36、0.26、0.19、0.17;當(dāng)氨水濃度為1.484 mol/L時，在20 min處，其最大吸收峰已完全消失;隨著時間推移，花色苷溶液出現(xiàn)最大吸收波長紅移情況，從585 nm向603 nm遷移。初始狀態(tài)下，溶液呈紫色，對應(yīng)吸收峰最強。隨著反應(yīng)進行，溶液中氨氣濃度升高，顏色發(fā)生明顯變化，實現(xiàn)從粉色到黃綠色最終為黃色的轉(zhuǎn)變，吸收峰變?nèi)跚易畲笪詹ㄩL發(fā)生紅移的現(xiàn)象。這些現(xiàn)象發(fā)生的原因是，樣品酸性強度高時，花色苷分子結(jié)構(gòu)主要以黃烊鹽離子的形式存在［20］，隨著NH3濃度增大，溶液堿性增強，花色苷結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化為藍(lán)色醌式堿，此時黃烊鹽離子的濃度及色澤強度降低［21］，導(dǎo)致最大吸收峰減小，最大吸收波長紅移，顏色呈黃綠色［22］;反應(yīng)達(dá)一定程度時，花色苷結(jié)構(gòu)極其不穩(wěn)定最終被分解，吸收峰隨之消失，顏色變黃［23］。以上結(jié)果說明，花色苷溶液能夠和氨水反應(yīng)，當(dāng)反應(yīng)時間相同時，氨水濃度越大，花色苷對NH3的響應(yīng)速度越快，能夠根據(jù)花色苷溶液的顏色變化判斷食品腐敗氣體的產(chǎn)生且靈敏性較好。

2.3.2 黑果枸杞花色苷對肉類腐敗氣味的響應(yīng)測試 圖4反映了黑果枸杞花色苷溶液連續(xù)5 d放于存有豬肉和牛肉的密閉環(huán)境中，其吸光值的變化。由圖4可知，花色苷于豬肉和牛肉環(huán)境中變化情況幾乎一致，隨著時間推移，花色苷溶液最大吸收峰逐漸變小，同時，也伴隨著花色苷顏色的改變。第3 d時，其最大吸收波長發(fā)生紅移，從第1、2 d時525 nm遷移到538 nm，其吸收峰繼續(xù)變小，此時，花色苷顏色已轉(zhuǎn)化成黃綠色，到第4 d吸收峰開始消失，顏色向黃色轉(zhuǎn)變。原因是隨著時間的延長，豬肉和牛肉新鮮度不斷下降，肉質(zhì)逐漸腐敗，蛋白質(zhì)發(fā)生變性［24］，此時，伴隨著氨以及胺類等堿性含氮物質(zhì)的產(chǎn)生，這直接導(dǎo)致花色苷的紅色烊陽離子結(jié)構(gòu)減少且向著無色的假堿、查耳酮轉(zhuǎn)變［25］。在第3 d及以后，因豬肉和牛肉腐敗程度加深，含氮物質(zhì)揮發(fā)量達(dá)一定限度，花色苷結(jié)構(gòu)被破壞［26］，溶液顏色變黃。以上表明，肉類食品新鮮程度可以通過觀察黑果枸杞花色苷顏色的變化，這對食品質(zhì)量優(yōu)劣起到一定的指示作用。

2.4 黑果枸杞花色苷的羥基自由基清除能力

圖4不同新鮮度豬肉(A)與牛肉(B)對黑果枸杞花色苷的影響Fig.4 Effects of pork(A)and beef(B)with different freshness on anthocyanins of Lycium barbarum

圖5 反映不同VC和花色苷添加量對羥基自由基的清除能力。Hochestein等［27］研究結(jié)果顯示，羥基自由基作為生物體系生成的一種極具反映性的自由基，其在自由基病理學(xué)方面擁有強烈損傷性，它可能使細(xì)胞壞死或發(fā)生突變［28］。因此，能夠通過羥基自由基的清除率來探究某些物質(zhì)的抗氧化能力強弱［29］。

實驗以相同體積的VC溶液為對照品。由圖5可知，在實驗濃度范圍內(nèi)，花色苷和VC溶液對羥基自由基均具有一定的清除能力，當(dāng)花色苷含量為0.95 mg/L時，羥基自由基清除率為2.4%;當(dāng)花色苷含量到7.30 mg/L時，其清除率達(dá)64.3%。對于VC，當(dāng)其濃度為16.68 mg/L時，其清除率達(dá)100%。由圖5可知，VC和黑果枸杞花色苷對應(yīng)羥基自由基清除率的IC50分別為10.19和5.54 mg/L，由此可得，黑果枸杞花色苷的羥基自由基清除能力強于VC。原因是黑果枸杞花色苷中釋放出的H能夠較好地和·OH結(jié)合，生成相對穩(wěn)定的自由基，從而消滅介質(zhì)中存在的大量有害自由基［30］。以上結(jié)果說明，黑果枸杞花色苷具有較強的羥基自由基清除能力，且清除能力隨含量呈正相關(guān)穩(wěn)步升高，說明具有良好抗氧化性能。

3 結(jié)論

本實驗將乙醇作為浸提液提取黑果枸杞花色苷濃縮液，測定了濃縮液中花色苷含量、不同p H響應(yīng)、氨氣及肉類腐敗氣體響應(yīng)、羥基自由基清除率。結(jié)果表明，黑果枸杞提取液中花色苷含量較高，為291.93 mg/L;花色苷pH敏感性較強，在p H1.0～pH13.0環(huán)境中，其顏色發(fā)生顯著變化，從紫粉色到無色再到綠色最終變?yōu)辄S色，其最大吸收波長發(fā)生紅移，從522 nm到533 nm再到619 nm;花色苷對肉類食品新鮮程度有良好的指示性，對氨氣響應(yīng)較為靈敏，且其反映速率隨濃度增大而加快，花色苷溶液顏色從紫紅色轉(zhuǎn)變青黃色最終變?yōu)辄S色，肉類食品腐敗程度加深時，最大吸收峰逐漸減弱，波長在525～538 nm范圍內(nèi)變化;花色苷具備良好的抗氧化性能，花色苷IC50比VC小4.65 mg/L，清除氫基自由基效果明顯，隨著花色苷濃度的增大，其羥基自由基清除率呈穩(wěn)定上升趨勢。

圖5 不同濃度黑果枸杞花色苷(A)和VC(B)溶液的羥基自由基清除率Fig.5 Hydroxyl radical scavenging rates of Lycium barbarum anthocyanin(A)and VC(B)solutions with different concentrations