煤炭標準物質GBW11104 對人肺腺癌A549 細胞的毒性作用

史新琛 ， 徐海明 ，2， 郝艷星 ， 張映馳 ， 張鵬舉 ，2， 田大年 ，2

（1.寧夏醫科大學公共衛生與管理學院，銀川 750004； 2.寧夏回族自治區環境因素與慢性病控制重點實驗室，銀川 750004）

一直以來，長期接觸煤塵導致的煤工塵肺是我國最主要的法定職業病之一[1]。關于塵肺的發病機制學說眾多，目前趨向于綜合作用學說[2]。早期的研究[3-5]表明，煤工塵肺患者及煤工塵肺實驗動物模型生物樣本中（如外周血血清、肺泡灌洗液等）存在氧化應激失衡及炎性反應等現象。在參與炎癥反應的諸多信號通路中，膽堿能抗炎通路是一條與神經免疫機制相關的抗炎通路，通過分泌乙酰膽堿（ACh），抑制炎性因子釋放，快速而直接地調節全身性炎性反應。一方面，ACh 是中樞神經系統中關鍵的神經遞質。另一方面，很多非神經細胞也可以合成ACh 并以自分泌和旁分泌的方式釋放至細胞外液，作用于ACh 受體，參與調節細胞增殖、分化等生理學過程，該系統稱為非神經元型膽堿能系統[6]。

課題組前期研究[7]表明，非神經元型膽堿能系統關鍵分子乙酰膽堿酯酶（AChE）在煤工塵肺患者外周血血清中降低。研究[8-10]表明，非神經元型膽堿能系統與上皮-間質轉化（EMT）密切相關。本研究擬采用人肺腺癌A549 細胞為靶細胞，同時探討煤炭標準物質對胞內氧化應激平衡、炎性細胞因子及非神經元型膽堿能系統關鍵分子AChE 活性和ACh 受體的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞

人肺腺癌A549 細胞為來源于2 型肺泡上皮細胞的細胞株，用含10%小牛血清和1%青鏈霉素的DMEM 培養液于37 ℃、5%二氧化碳條件下培養，用0.125%胰蛋白酶（含0.01% EDTA）消化傳代，2～3 d 傳代 1 次。

1.2 煤塵

煤塵標準物質GBW11104 購自國家標準物質中心，粒徑＜5 μm（圖 1），硫含量 1.29%，灰分27.35%，揮發分7.94%，碳64.59%，不含二氧化硅。將坩堝用雙蒸水清洗干凈，置于含30%硝酸的液體中浸泡24 h，取出坩堝，用蒸餾水沖洗坩堝，待其自然晾干。將煤塵置于坩堝中，放于馬弗爐中，300 ℃烘烤4 h，待恢復至常溫，取出坩堝，將煤塵放于15 mL 潔凈的離心管中。隨后，將煤塵加入完全培養基中，配制成1 mg·L-1濃度的煤塵毒物，現用現配，使用前梯度稀釋成相應濃度。

圖1 煤塵標準物質GBW11104 電鏡表征圖（×10000）

1.3 細胞染毒

將細胞懸液密度調整為8.0×104個/mL，接種于 96 孔板中（100 μL/孔）。設置空白組、對照組及 50、100、200、400、600 μg·mL-1暴露組。圍繞實驗孔的外圍孔中加1×PBS 溶液，用于維持濕潤條件。空白組只加入100 μL 的完全培養基，不接種細胞。待細胞生長24 h 后，吸走培養基，空白組和對照組每孔加100 μL 的完全培養基，各個暴露組加入相應濃度的煤炭標準物質工作液，染毒時長為24 h。暴露結束后，在空白孔、對照孔及暴露孔內均加 10 μL 的 CCK8 溶液，37 ℃孵育1 h，用酶標儀測定各孔的光密度值，測定波長為450 nm。校正吸光度值（OD）為扣除空白孔OD 值之后的數值。

1.4 細胞上清液及裂解液收集

將細胞懸液密度調整為2×105個/mL，接種于 6 孔板中（2 mL/孔）。根據 CCK-8 實驗結果，選擇對細胞活力無影響的劑量為暴露濃度，暴露時長為24 h。暴露結束后，將上清液收集至離心管，用于測定白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）的表達水平。隨后，加入預冷PBS 輕洗2 次，使用細胞刮刀刮取細胞并轉移至離心管中，加入100 μL濃度為 0.4 mmol·L-1的低鹽裂解液（含 0.5 mol·L-1的芐脒鹽酸鹽），劇烈振蕩30 s，冰上靜置4 min，重復上述操作 5 次。4 ℃低溫離心（12000 r·min-1）后，收集上清液用于測定超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）及AChE 表達水平。

1.5 生化測定

使用考馬斯亮藍染色法測定樣品中的總蛋白；通過比色法測定SOD（南京建成生物工程研究所）及MDA（北京華英生物技術研究所）水平；采用ELISA 法測定IL-6 水平（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司）；通過改良Ellman 法測定AChE 的活性。根據各試劑盒的線性測定范圍確定合適的稀釋倍數。

1.6 基因表達水平的測定

使用一步法提取總RNA，逆轉錄合成cDNA第一條鏈，熒光定量PCR 法檢測CHRNA9（Gen－Bank No. NM_017581.4）mRNA 逆轉錄合成第一條cDNA 鏈的拷貝數，CHRNA9 上游引物序列為5’-CAGAGACGGCAGATGGAAA-3’，下游引物序列為 5’-CCACTGGACGAAGAGCATTAGAA-3’，管家基因 β-actin（GenBank No. NM_001101.5）上游引物序列為5’-GACTACCTCATGAAGATCCTCACC-3’，下游引物序列為 5’-TCTCCTTAATGTCACGCACGATT-3’，使用 2-△△CT法分析數據。

1.7 統計學方法

數據運用SPSS 22.0 軟件進行統計分析。正態分布的資料采用均數±標準差（）描述，組間比較采用單因素方差分析，組內兩兩比較采用LSD 法。非正態分布數據使用中位數（四分位數間距）［M（Q）］描述，兩組組間比較采用 Mann-Whitney U 檢驗的方法，多組組間比較采用Kruskal-Wallis H 檢驗的方法。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 煤炭標準物質GBW11104 暴露對人肺腺癌A549 細胞活性的影響

煤炭標準物質GBW11104 刺激A549 細胞24 h 后，測定細胞的存活率。結果表明，50、100、200 μg·mL-1煤炭標準物質刺激細胞 24 h 后，對細胞存活率均無影響（P 均＞0.05），見表1。在后續的暴露實驗中選擇這3 個劑量進一步研究煤炭標準物質暴露對A549 細胞的損傷效應。

表1 煤炭標準物質GBW11104 刺激人肺腺癌A549細胞 24 h 后對細胞活性的影響（）

表1 煤炭標準物質GBW11104 刺激人肺腺癌A549細胞 24 h 后對細胞活性的影響（）

注：有相同字母視為組間差異無統計學意義，無相同字母視為組間差異有統計學意義。

煤炭標準物質濃度/（μg·mL-1）n24 h 0 9 1.23±0.12a 50 9 1.03±0.19a 100 9 0.99±0.20a 200 9 0.90±0.16a 400 9 0.81±0.02bc 600 9 0.72±0.14c

2.2 煤炭標準物質GBW11104 刺激下對A549細胞中SOD、MDA 及IL-6 表達水平的影響

GBW11104 暴露可以導致細胞內SOD 活性發生不同程度的變化。與對照組相比，100 μg·mL-1暴露組 SOD 活性降低了 15.4%（P＜0.05）。 暴露后各劑量組MDA 水平差異均無統計學意義（P均＞0.05）。與對照組相比，100、200 μg·mL-1暴露劑量下IL-6 水平分別升高了74.5%和77.9%（P均＜0.05），見表 2。

表2 煤炭標準物質GBW11104 刺激人肺腺癌A549 細胞24 h 后對 SOD、MDA 及 IL-6 水平的影響（）

表2 煤炭標準物質GBW11104 刺激人肺腺癌A549 細胞24 h 后對 SOD、MDA 及 IL-6 水平的影響（）

注：有相同字母視為組間差異無統計學意義，無相同字母視為組間差異有統計學意義。

IL-6/（pg·μL-1）0 3 10.31±0.86a 44.97±2.06a 6.05±1.46b 50 3 9.49±1.21ab 45.57±2.71a 6.85±1.57b 100 3 8.72±0.94b 47.77±7.10a 10.56±3.55a 200 3 9.40±1.65ab 49.23±4.10a 10.76±1.66a煤炭標準物質/（μg·mL-1） nSOD/（U·mg prot-1）MDA/（pmol·mgprot-1）

2.3 煤炭標準物質GBW11104 刺激人肺腺癌A549細胞24 h 后對AChE 活性的影響

GBW11104 暴露可以導致細胞內AChE 活性發生不同程度的變化。與對照組相比，100 μg·mL-1暴露組 AChE 活性降低了 12.2%（P＜0.05），見圖2。

圖2 煤炭標準物質GBW11104 刺激人肺腺癌A549 細胞 24 h 后對 AChE 活性的影響（）

2.4 煤炭標準物質GBW11104 刺激對A549 細胞中的AChE 受體CHRNA9 mRNA 的表達水平

GBW11104 暴露與A549 細胞中非神經元型膽堿能系統關鍵分子ACh 受體CHRNA9 mRNA表達水平的劑量-反應關系呈倒U 形曲線。50、100、200 μg·mL-1暴露劑量下細胞內CHRNA9 mRNA 表達水平分別相當于對照組的231%、167%和 71%（P 均＜0.05），見圖 3。

圖3 煤炭標準物質GBW11104 刺激人肺腺癌A549 細胞 24 h 后對 CHRNA9 mRNA 表達水平的影響（）

3 討論

在塵肺發生、發展過程中，機體氧化和抗氧化平衡被打破是關鍵事件之一。SOD 是機體重要的清除自由基的物質，機體開始接觸粉塵時會產生大量的自由基，SOD 表達水平應激增高用以清除自由基。隨著接觸時間的延長，SOD 被逐漸消耗，其含量也降低。MDA 是生物膜的多不飽和脂肪酸過氧化分解的終產物，它通過交聯核酸等大分子物質使組織老化，其含量可以作為機體生物膜受損傷程度的定量指標之一[3，11-12]。在本研究中，盡管煤炭標準物質瞬時刺激并未影響A549 細胞中MDA 表達水平，但卻導致SOD 水平下降。提示煤炭標準物質暴露從一定程度上影響了A549細胞內的氧化和抗氧化平衡。

IL-6 是由巨噬細胞和成纖維細胞等多種細胞分泌的一種細胞因子，在塵肺的發生、發展中發揮抗炎、促炎、致纖維化等多種作用[12-13]。課題組前期研究[7]表明，與對照人群相比，煤工塵肺人群血清中IL-6 水平升高。Meta 分析結果[14]表明，IL-6 基因-174C/G 位點多態性與塵肺易感性之間無相關性，-634C/G 位點多態性與塵肺易感性之間有相關性，-634C/G 位點CC 基因型是塵肺的易感基因型。本研究中，GBW11104 刺激A549細胞24 h 后，上清液中IL-6 的表達量逐漸升高。這一結果提示，外源性煤炭標準物質可以誘導A549 的炎性反應。

ACh 除了作為一種神經遞質在神經細胞中傳遞信息外，也可被非神經細胞合成并以自分泌和旁分泌的方式釋放至細胞外液，作用于ACh受體，參與調節細胞增殖、分化等基本的生物學活動，此被稱為非神經元型膽堿能系統[15]。值得注意的是，肺泡上皮細胞也可合成和分泌ACh，同時表達ACh 受體。研究[8]表明，外源性的ACh受體激動劑（如卡巴膽堿）作用于ACh 受體能促進A549 細胞的上皮-間質轉化過程（EMT）。本研究中，煤炭標準物質暴露引起A549 細胞中AChE活性下降，同時可以影響CHRNA9 mRNA 的表達水平。上述結果提示，煤炭標準物質暴露可能通過影響非神經元型膽堿能系統關鍵分子AChE及ACh 受體的水平，進而影響A549 細胞的EMT過程。因此，下一步應該重點關注煤炭標準物質對A549 細胞EMT 結局的影響。

綜上，煤炭標準物質GBW11104 暴露對人肺腺癌A549 細胞有一定的毒性作用，具體表現為影響中氧化和抗氧化平衡、導致炎性反應、影響非神經元型膽堿能系統關鍵分子AChE 及ACh受體的水平。