改良微量肉湯藥敏實(shí)驗(yàn)應(yīng)用效果分析

周云花 ， 趙志軍， 楊 紅 ， 康 佳 ， 蘇雅靜 ， 喬 霞 ， 于 欣

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，銀川 750004； 2.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院 寧夏病原微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，銀川 750004；3.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，銀川 750004； 4.寧夏醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系，銀川 750004）

金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌是醫(yī)院感染最常見(jiàn)的病原體，與人類(lèi)多種疾病相關(guān)，且對(duì)大多數(shù)抗生素表現(xiàn)出極高的耐藥性，由此引發(fā)感染者病死率大幅上升，給臨床抗感染治療帶來(lái)諸多問(wèn)題[1-5]。抗生素敏感性實(shí)驗(yàn)是目前公認(rèn)的針對(duì)細(xì)菌耐藥性和敏感性的檢測(cè)方法，其通過(guò)測(cè)定抗菌藥物在體外抑制病原微生物生長(zhǎng)的效力，以確定細(xì)菌對(duì)抗生素的敏感性[6]。臨床現(xiàn)有較多抗生素敏感性實(shí)驗(yàn)可用于細(xì)菌藥敏檢測(cè)，如紙片擴(kuò)散法、稀釋法、抗生素濃度法、VITEK2 全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀等，以上方法均可為臨床檢測(cè)細(xì)菌耐藥性提供有效依據(jù)，但仍存在操作煩瑣、成本高、儀器依賴(lài)性強(qiáng)等問(wèn)題，且培養(yǎng)過(guò)程需要耗費(fèi)大量時(shí)間實(shí)現(xiàn)細(xì)菌富集[7-9]，從而增加臨床耐藥菌株感染者的病死率，影響感染者的預(yù)后。

本研究設(shè)計(jì)了一種改良微量肉湯藥敏實(shí)驗(yàn)（熒光法），利用熒光二抗分別捕獲與金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌特異性結(jié)合的一抗，通過(guò)檢測(cè)細(xì)菌是否產(chǎn)生熒光來(lái)判定最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）。本文通過(guò)比較改良微量肉湯藥敏實(shí)驗(yàn)（熒光法）、VITEK2 全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀和微量肉湯稀釋法檢測(cè)金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌耐藥性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，驗(yàn)證三種方法的有效性和統(tǒng)一性，為臨床提供一種快速藥敏實(shí)驗(yàn)備選方法。

1 資料與方法

1.1 菌株與主要試劑

金黃色葡萄球菌ATCC29213、大腸埃希菌ATCC25922 購(gòu)自上海漢尼生物技術(shù)有限公司；臨床分離金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌來(lái)自寧夏醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心微生物組；LB 肉湯培養(yǎng)基購(gòu)自中國(guó)北京索萊寶科技有限公司（貨號(hào)：L1010）；MH 肉湯培養(yǎng)基購(gòu)自中國(guó)北京索萊寶科技有限公司（貨號(hào)：M8556）；苯唑西林、利奈唑胺、環(huán)丙沙星、青霉素、紅霉素、亞胺培南、頭孢曲松、哌拉西林和妥布霉素均購(gòu)自中國(guó)大連美侖生物技術(shù)有限公司；山羊抗小鼠IgGH&L（FITC）購(gòu)自英國(guó) Abcam 公司（批號(hào)：6785）；Lipid ALPS Poly-clonal Antibody（貨號(hào)：PA1-73178）、Alexa Fluor 488 Protein Labeling Ki（t貨號(hào)：A10235）、96 孔酶標(biāo)板均購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

多功能微孔板監(jiān)測(cè)儀購(gòu)自美國(guó)BioTek 公司（型號(hào)：SYNERGY2）；VITEK2 全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀購(gòu)自法國(guó)生物梅里埃股份有限公司（型號(hào)：VITEK2COMPACT60）。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)菌培養(yǎng)定量 分別挑取標(biāo)準(zhǔn)菌株金黃色葡萄球菌ATCC29213、標(biāo)準(zhǔn)菌株大腸埃希菌ATCC25922、5 株臨床分離金黃色葡萄球菌和5株臨床分離大腸埃希菌的單個(gè)菌落于LB 肉湯培養(yǎng)基中搖菌過(guò)夜（37 ℃，180 r·min-1），再分別加入生物素標(biāo)記的一抗捕獲并于0.9%生理鹽水中定量為 1×108CFU·mL-1。

1.3.2 改良微量肉湯藥敏實(shí)驗(yàn)（熒光法） 用MH肉湯培養(yǎng)基分別稀釋1.3.1 中定量的標(biāo)準(zhǔn)菌株和5 株臨床分離的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌菌懸液至 1×106CFU·mL-1。在 96 孔板第 1～10 列配制 100 μL 藥物濃度依次為 64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25 和 0.125 μg·mL-1的抗生素，再分別加入100 μL 制備好的菌懸液至終濃度為1×105CFU·mL-1，第 11 列加入 200 μL MH 肉湯培養(yǎng)基作陰性對(duì)照，第12 列加入200 μL 菌懸液作陽(yáng)性對(duì)照[10]。接種好的藥敏板置于35 ℃溫箱中培養(yǎng)4、6、8 和 10 h 后，在接種金黃色葡萄球菌的孔內(nèi)加入 5 μL 山羊抗小鼠 IgG 熒光抗體（1∶2500），在接種大腸埃希菌的孔內(nèi)加入5 μL 經(jīng)Alexa Fluor 488 Protein Labeling Kit 標(biāo)記的Lipid ALPS Polyclonal Antibody（1∶30），35 ℃溫箱繼續(xù)培養(yǎng)30 min，利用多功能微孔板監(jiān)測(cè)儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度值，并根據(jù)CLSIM100 文件判斷確定MIC，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.3 VITEK2 全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀 將標(biāo)準(zhǔn)菌株和5 株臨床分離的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌的純菌落分別制成0.5 麥?zhǔn)蠞岫鹊木鷳乙海?jīng)充填機(jī)將菌懸液注入試卡內(nèi)，封口后放入讀數(shù)器恒溫培養(yǎng)箱，根據(jù)試卡各生化反應(yīng)孔中的生長(zhǎng)變化情況，最后鑒定結(jié)果在顯示器上自動(dòng)顯示。

1.3.4 微量肉湯稀釋法 標(biāo)準(zhǔn)菌株和5 株臨床分離的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌的微量肉湯稀釋法藥敏板配制流程同1.3.2；將分別接種好的藥敏板置于35 ℃溫箱中培養(yǎng)18～22 h，通過(guò)觀察MH 肉湯培養(yǎng)基的濁度并檢測(cè)OD 值，根據(jù)CLSIM100 文件判斷確定MIC，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.5 三種抗生素敏感性實(shí)驗(yàn)的MIC、檢測(cè)周轉(zhuǎn)時(shí)間（turn-around time，TAT）結(jié)果比較 根據(jù)上述抗生素敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法比較其MIC 一致性與TAT 差異性。其中，金黃色葡萄球菌ATCC29213 和大腸埃希菌ATCC25922 是美國(guó)臨床標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)驗(yàn)室（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）和歐盟藥敏實(shí)驗(yàn)委員會(huì)（European Committeeon Antimicrobial Susceptibility Testing，EUCAST）規(guī)定的微量肉湯稀釋法藥敏實(shí)驗(yàn)中的質(zhì)控菌株，其質(zhì)控范圍在3個(gè)倍比濃度梯度以?xún)?nèi)。由于藥敏實(shí)驗(yàn)影響因素很多，所以誤差范圍定義為3 個(gè)藥物倍比濃度梯度[11-13]。因此，本文中對(duì)比VITEK2 系統(tǒng)、微量肉湯稀釋法與改良微量肉湯藥敏實(shí)驗(yàn)（熒光法）的MIC 也遵循此原則。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

資料運(yùn)用SPSS 16.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，三種抗生素敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果之間的一致性比較由Cohen’s kappa 值表示（差：k＜0.20；一般：0.21＜k＜0.40；中等：0.41＜k＜0.60；較強(qiáng)：0.61＜k＜0.80；強(qiáng)：k≥0.81）。計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多個(gè)樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)。P≤0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三種抗生素敏感性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌的MIC 結(jié)果比較

在對(duì)標(biāo)準(zhǔn)菌株金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌進(jìn)行的3 次重復(fù)對(duì)比實(shí)驗(yàn)中，三種方法對(duì)兩種菌株檢測(cè)的MIC 在3 個(gè)藥物濃度梯度以?xún)?nèi)的吻合率幾乎為100%，且均在質(zhì)控范圍內(nèi)。在對(duì)5 株臨床分離金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌進(jìn)行的3 次重復(fù)對(duì)比實(shí)驗(yàn)中，三種方法對(duì)兩種菌株檢測(cè)的MIC 在3 個(gè)藥物濃度梯度以?xún)?nèi)的吻合率也幾乎為100%。結(jié)果顯示，三種方法對(duì)標(biāo)準(zhǔn)菌株金黃色葡萄球菌（表1）、大腸埃希菌（表2）和臨床分離金黃色葡萄球菌（表3）、大腸埃希菌（表4）檢測(cè)的MIC 均未超出3 個(gè)藥物倍比濃度梯度。三種方法檢測(cè)結(jié)果的Cohen’s kappa 值為1.000，P=0.083。因此三種抗生素敏感性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌的結(jié)果高度吻合。

2.2 三種抗生素敏感性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌藥敏的TAT 結(jié)果比較

三種藥敏方法對(duì)金黃色葡萄球菌藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，VITEK2 全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀的TAT 需17 h 以上；微量肉湯稀釋法的TAT 一般需要22 h左右；與這兩種方法相比，改良微量肉湯藥敏實(shí)驗(yàn)（熒光法）TAT 縮短，僅為 8～10 h（P＜0.01），見(jiàn)圖1A。三種方法對(duì)大腸埃希菌藥敏TAT 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，改良的微量肉湯藥敏實(shí)驗(yàn)（熒光法）和VITEK2 全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀的TAT 均為10 h 左右，而微量肉湯稀釋法TAT 長(zhǎng)達(dá)22 h 左右，三種方法的TAT 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)圖1B。

表1 三種抗生素敏感性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)菌株金黃色葡萄球菌ATCC29213 的MIC（μg·mL-1）

表2 三種抗生素敏感性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)菌株大腸埃希菌ATCC25922 的MIC（μg·mL-1）

表3 三種抗生素敏感性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)臨床分離金黃色葡萄球菌的MIC（μg·mL-1）

3 討論

金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌是臨床常見(jiàn)耐藥菌株[14]，且其耐藥性與細(xì)菌感染導(dǎo)致的高發(fā)病率和高病死率密切相關(guān)。因此，快速、準(zhǔn)確發(fā)布臨床高危患者的細(xì)菌培養(yǎng)和抗生素敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對(duì)于提高患者預(yù)后及避免易感微生物抗生素的濫用至關(guān)重要[15-17]。但目前醫(yī)院常用的VITEK2 全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀成本高，不適用于基層醫(yī)療，微量肉湯稀釋法操作煩瑣，且以上兩種方法均是通過(guò)檢測(cè)菌種與抗生素孵育后濁度判定細(xì)菌對(duì)藥物的敏感性，孵育耗時(shí)長(zhǎng)，一般需要22 h 左右[7-9]。本研究設(shè)計(jì)的一種改良微量肉湯藥敏實(shí)驗(yàn)（熒光法），總時(shí)長(zhǎng)僅10 h，相對(duì)VITEK2全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀與微量肉湯稀釋法耗時(shí)較短，同時(shí)該方法利用熒光抗體分別捕獲與金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌特異性結(jié)合的抗體，通過(guò)檢測(cè)細(xì)菌是否產(chǎn)生熒光可直接、準(zhǔn)確判定MIC。因此，改良微量肉湯藥敏實(shí)驗(yàn)（熒光法）耗時(shí)短，結(jié)果判讀更客觀簡(jiǎn)便，更適用于基層醫(yī)療，可為臨床醫(yī)生提供及時(shí)的用藥方案，有效降低患者細(xì)菌感染病死率。

表4 三種抗生素敏感性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)臨床分離大腸埃希菌的MIC（μg·mL-1）

圖1 三種抗生素敏感性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)菌藥敏的TAT 比較

本文使用改良微量肉湯藥敏實(shí)驗(yàn)（熒光法）分別對(duì)金黃色葡萄球菌ATCC29213 平行進(jìn)行3次苯唑西林、利奈唑胺和環(huán)丙沙星的藥敏實(shí)驗(yàn)，對(duì)大腸埃希菌ATCC25922 平行進(jìn)行3 次慶大霉素、環(huán)丙沙星和亞胺培南的藥敏實(shí)驗(yàn)，同樣對(duì)臨床分離金黃色葡萄球菌進(jìn)行苯唑西林、利奈唑胺、青霉素、紅霉素的藥敏實(shí)驗(yàn)，對(duì)臨床分離大腸埃希菌進(jìn)行亞胺培南、頭孢曲松、哌拉西林、妥布霉素的藥敏實(shí)驗(yàn)，在沒(méi)有出現(xiàn)跳孔的情況下，通過(guò)分析細(xì)菌在含有不同抗生素的MH 肉湯中培養(yǎng)不同時(shí)間點(diǎn)后是否產(chǎn)生熒光來(lái)確定MIC。經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，利用改良微量肉湯藥敏實(shí)驗(yàn)（熒光法）檢測(cè)上述兩種菌株的MIC 與VITEK2 全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀及微量肉湯稀釋法的藥敏結(jié)果一致，且尚未發(fā)現(xiàn)超出3 個(gè)藥物倍比濃度的差異值。因此，研究認(rèn)為改良微量肉湯藥敏實(shí)驗(yàn)（熒光法）具有良好的準(zhǔn)確性，可為臨床檢測(cè)細(xì)菌耐藥性提供有力依據(jù)。

綜上所述，改良微量肉湯藥敏實(shí)驗(yàn)（熒光法）主要通過(guò)檢測(cè)是否產(chǎn)生熒光判斷細(xì)菌MIC，雖然藥敏實(shí)驗(yàn)前需手工配制藥敏板，但該方法具有結(jié)果判讀更直接客觀、耗時(shí)短等優(yōu)點(diǎn)，在臨床快速、精準(zhǔn)選擇抗生素治療方面具有較大潛力，可為臨床危重患者提供更快速、可靠的藥敏結(jié)果。改良微量肉湯藥敏實(shí)驗(yàn)（熒光法）是一種快速檢測(cè)細(xì)菌耐藥性的創(chuàng)新技術(shù)，與其他臨床常規(guī)藥敏方法的對(duì)比尚未見(jiàn)報(bào)道。后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，將通過(guò)增加實(shí)驗(yàn)重復(fù)對(duì)比次數(shù)、臨床分離菌株數(shù)進(jìn)一步優(yōu)化該實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)流程，使其能夠作為常規(guī)藥敏檢測(cè)方法廣泛應(yīng)用于臨床。