熱暴露對大鼠胸主動脈內皮細胞鐘基因BMAL1 和細胞周期蛋白的影響

張瀚文 ， 耿 瑤 ， 常笑語 ， 穆 樂 ， 楊春麗 ， 武曉敏 ， 李光華 ，

（1.寧夏醫科大學基礎醫學院生理學系，銀川 750004； 2.寧夏醫科大學護理學院，銀川 750004；3.寧夏醫科大學公共衛生與管理學院，銀川 750004）

應激是機體在各種內外環境因素及社會、心理因素刺激后所做出的一系列非特異性生理反應的總和。長時間處于高溫環境，可引起全身的非特異性適應反應，從而引起各種病理生理學變化。熱應激可導致大鼠小腸發生病理性損傷、晝夜節律相關基因mRNA 表達異常，可誘導細胞凋亡并導致血管損傷，影響心血管功能[1]。許多重要的細胞周期基因，如 p53、p21、wee1、c-myc、cyclind1 等都是鐘控基因，其表達受鐘基因調控，具有晝夜節律性。細胞周期正常有序的運轉過程受到許多細胞周期基因和其產物的調控，這些調控因子構成了一個復雜且有序的分子網絡，監管著細胞周期進程有序運轉，以確保細胞增殖和凋亡的平衡。當這些細胞周期的調節因子發生異常和改變時，導致細胞周期紊亂，繼而使細胞增殖和凋亡平衡失控最終導致疾病的發生[2-6]。生物鐘和細胞周期之間存在緊密的雙向相位耦合[7]。研究[8-9]表明，鐘基因在人類口腔黏膜和皮膚中的表達與特定的細胞周期時相有關，CyclinB1 基因Cnnb1 的峰值表達與BMAL1 鐘基因的峰值一致，而PER1 的轉錄與P53 mRNA 水平的峰值在G1 晚期一致。為探討長時間熱暴露對動物晝夜節律及細胞周期潛在的影響，本文對大鼠熱暴露后胸主動脈和內皮細胞晝夜節律相關基因 BMAL1 和細胞周期蛋白 CDK1、CDK4、CDK6、CyclinB1 表達進行研究，進一步探討此現象發生的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、細胞、試劑及儀器

選用健康雄性SD 大鼠20 只，體質量180～220 g。所有大鼠每日自由進食［動物及飼料均由寧夏醫科大學實驗動物中心提供，倫理號：寧醫大倫理第 2020-326 號；許可證號：SCXK（寧）2015-0001］，并給予充足的純凈水飲用，分籠飼養，每籠5 只，光照明暗周期為12 h/12 h，即每天6:00～18:00 為暗，18:00～次日 6:00 為明，環境溫度（24±0.1）℃。體外實驗，選用大鼠胸主動脈內皮細胞株（RTAEC），購自上海賽齊生物工程有限公司，置于37 ℃、5%CO2的培養箱中，進行常規細胞培養。

WB 一抗：BMAL1（貨號：DF10308-200；美國Affinity Biosciences 公司），CyclinB1（貨號：#4138；Cell Signaling Technology 公司），CDK1（貨號：bs-0542R；北京博奧森生物技術有限公司），CDK4（貨號：11026-1-AP）、CDK6（貨號：14052-1-AP）均購自美國 Proteintech Group 公司，WB二抗：辣根酶標記山羊抗小鼠IgG（貨號：ZB-2305）、β-Actin（貨號：TA-09）均購自北京中杉金橋生物技術有限公司，Goat Anti-rabbit IgG/HRP（貨號：bs-0259G-HRP；北京博奧森生物技術有限公司）、BCA 蛋白含量檢測試劑盒、全蛋白提取試劑盒（KeyGEN BioTECH），光學顯微鏡（日本奧林巴斯公司），人工氣候艙、酶標儀、4 ℃離心機、超凈工作臺、37℃二氧化碳細胞培養箱（美國賽默飛世爾科技有限公司），電泳儀、電泳槽（美國Bio-Rad 公司），震蕩混懸器（江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司），-80 ℃冰箱、-150 ℃超低溫冰箱（美國-紐艾爾公司），化學發光成像儀（美國通用電氣公司），細胞培養瓶（美國 Corning 公司）。

1.2 實驗動物的分組和干預方法

將20 只SD 大鼠，隨機分為正常對照組和熱暴露組各10 只，環境溫度為24 ℃，適應性飼養1 周；開始模型制備；正常對照組，大鼠飼養在24 ℃溫度環境中；熱暴露組大鼠飼養在32 ℃溫度環境中；兩組飼養環境相對濕度均為（32±4.3）%，干預過程中，每3 d 進行1 次體質量測量并記錄，持續時間為14 d。兩組大鼠分別干預14 d 后，在取材前夜禁食，自由飲水；取材前對大鼠進行稱重，戊巴比妥鈉配制成1%生理鹽水溶液腹腔注射對大鼠進行麻醉，給藥容積一般為5～10 mg·kg-1，麻醉完成后，將大鼠固定于解剖臺上，暴露大鼠的整個胸部和腹部，修剪去腹部毛發，75%乙醇消毒。從劍突向上剪開皮膚至頜下，向兩側鈍性分開皮膚與皮下組織，暴露胸廓及頸淺肌層；沿正中剪開胸廓、胸膜，避免損傷胸腺的胸腔器官。暴露心臟，分離其他器官組織，沿著心臟主動脈弓在大鼠胸腔后壁脊柱側分離胸主動脈，用止血鉗夾住胸主動脈上下端，眼科剪剪取胸主動脈，置于生理鹽水反復涮洗去除血管中的血液，剪成數段分別進行組織固定及凍存，以備后續實驗使用。

1.3 大鼠胸主動脈內皮細胞的培養和處理

復蘇胸主動脈內皮細胞株，待其穩定生長，進入對數生長期，對細胞進行干預；對照組置37 ℃、5%CO2的培養箱中，熱暴露組置 40 ℃、5%CO2的培養箱中，用含10%新生牛血清以及青鏈霉素各100 U·mL-1的 DMEM 培養液培養 24 h。

1.4 HE 染色觀察熱暴露大鼠胸主動脈血管形態結構變化

取新鮮的大鼠胸主動脈血管浸泡在4%的多聚甲醛液中固定24 h，自來水沖洗2 h，70%乙醇中過夜。次日，從75%乙醇撈出組織包埋盒，分別經過80%、90%、95%乙醇2 h、無水乙醇Ⅰ30 min、無水乙醇Ⅱ30 min 依次進行組織脫水。組織包埋盒從無水乙醇中取出，去掉多余乙醇，放入盛有新鮮二甲苯的容器Ⅰ和Ⅱ中各30 min。浸蠟、包埋、切片、脫蠟、脫水、蘇木素溶液中進行細胞核的染色、0.5%分化液中（成分：75%乙醇和濃鹽酸）分化、伊紅染色、滴加中性樹脂，封片進行后續拍片觀察。

1.5 免疫組織化學染色檢測熱暴露大鼠胸主動脈BMAL1 蛋白表達

將制成蠟塊的大鼠胸主動脈血管進行組織切片，將組織切片迅速放入二甲苯Ⅰ和Ⅱ脫去組織中的蠟，脫水，高溫抗原修復，37 ℃溫箱內孵育15 min；用PBS 清洗；滴加正常用山羊血清放入濕盒內，37 ℃溫箱封閉1 h。滴加一抗置于濕盒內，4 ℃過夜，37 ℃復溫 1～2 h，PBS 清洗；甩干滴加反應增強液，37 ℃孵育20 min；PBS 清洗，滴加相應二抗，37 ℃孵育 1 h；PBS 清洗 3 次，進行DAB 顯色，去離子水中清洗3～5 min，滴加蘇木素染色液中染核2 min；去離子水中清洗，置于0.5%分化液中（成分：75%乙醇和濃鹽酸）分化5 s，變色即撈出，放入水中清洗，清洗結束后依次經50%、75%、80%、90%、95%乙醇、無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ各30 s；最后轉入二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ各2～3 min；加一滴中性樹脂于組織中心，蓋上與載玻片相配套的蓋玻片，趕盡多余氣泡，放于室溫下晾干，進行后續拍片觀察，用Image J軟件對目的蛋白表達陽性細胞數進行統計。

1.6 Western blot 檢測熱暴露大鼠胸主動脈血管組織和胸主動脈內皮細胞BMAL1 及細胞周期蛋白 CDK1、CDK4、CDK6、CyclinB1 的表達

將制備的組織和細胞從－80 ℃冰箱取出，放冰上備用，提前配制組織和細胞裂解液，放置冰上預冷，組織蛋白提取需要提前用液氮將研缽預冷，將組織置于研缽中，研磨成組織粉末，并轉移至離心管中，根據組織重量大小，加入組織裂解液，充分震蕩混勻，離心，收集蛋白；細胞蛋白的提取則省去液氮研磨步驟，直接將配制好的細胞蛋白裂解液根據細胞數加入細胞，充分振蕩混勻，離心并收集蛋白，然后采用BCA 法進行組織和細胞蛋白含量的測定。最后將蛋白變性后經10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉移至PVDF 膜上，用含 5%脫脂奶粉的 TBST（Tris-Hcl 20 mmol·L-1，NaCl 137 mmol·L-1含 0.1% Tween-20）封閉 1 h，用特異性Western blot 目的蛋白一抗4 ℃孵育過夜，TBST 洗滌3 次，每次5 min，相應的二抗孵育1 h，TBST 洗滌 3 次，每次 5 min，配制超敏發光液：將超敏發光液試劑盒中的A 液和B 液按1∶1比例配制，每張膜200 μL 的用量按照實際情況配制；發光；用Image J 軟件進行目的條帶灰度值分析，GraPhPad Prism6 軟件進行統計分析并作圖。

1.7 統計學方法

運用SPSS 22.0 統計學軟件和GraPhPad Prism6軟件對數據進行分析。滿足正態分布的計量資料以均數±標準差（）表示，組間比較采用 t 檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，檢驗水準取 α=0.05。

2 結果

2.1 熱暴露對大鼠體質量的影響

隨著時間的變化，兩組大鼠的體質量均呈上升的趨勢，相同時間點兩組大鼠體質量的差異均無統計學意義（P 均＞0.05），見表 1。

表1 熱暴露對大鼠體質量的影響（，g）

表1 熱暴露對大鼠體質量的影響（，g）

組別 n 第3 天 第6 天 第9 天 第12 天 第15 天正常對照組 10 310.26±6.34 313.32±7.69 319.34±7.04 325.07±9.43 333.14±7.69熱暴露組 10 315.03±7.76 317.63±6.72 318.29±8.73 320.14±8.06 323.61±8.23 t 值 1.505 1.335 0.296 1.257 2.676 P 值 0.1496 0.1986 0.7706 0.2249 0.0154

2.2 熱暴露對大鼠胸主動脈血管形態結構的影響

大鼠胸主動脈血管HE 染色結果顯示：正常對照組大鼠胸主動脈血管管壁完整，彈性纖維排列整齊；熱暴露組大鼠胸主動脈血管內皮細胞明顯缺失，彈性纖維排列紊亂，斷裂，不規則，見圖1。

圖1 熱暴露對大鼠胸主動脈血管形態結構的影響（HE×40）

2.3 免疫組織化學檢測熱暴露大鼠胸主動脈BMAL1 蛋白的表達情況

棕色顆粒為目的蛋白的表達，顏色越深代表目的蛋白表達越高，顆粒越多表明目的蛋白表達陽性細胞數目越多。與正常對照組比較，熱暴露組BMAL1 蛋白表達升高，陽性細胞數目增多（P＜0.001），見圖 2、圖 3。

圖2 熱暴露對大鼠胸主動脈血管BMAL1 蛋白表達的影響（IHC×40）

圖3 兩組大鼠胸主動脈血管BMAL1 蛋白表達情況

2.4 Western blot 檢測熱暴露大鼠胸主動脈血管BMAL1 及細胞周期蛋白 CDK1、CDK4、CDK6、CyclinB1 的表達情況

與對照組比較，熱暴露組大鼠胸主動脈血管BMAL1、CDK1、CyclinB1 蛋白表達均升高（P 均＜0.05），見圖 4。

2.5 Western blot 檢測大鼠胸主動脈內皮細胞BMAL1 及細胞周期蛋白 CDK1、CDK4、CDK6、CyclinB1 的表達

與對照組比較，熱暴露組大鼠胸主動脈血管組織 BMAL1、CDK1、CyclinB1 蛋白表達均升高（P均＜0.01），見圖 5。

3 討論

課題組前期研究[10]表明，熱應激可以使胸主動脈血管對去甲腎上腺素（NE）的收縮反應性發生變化，因不同時間熱暴露引起的這種血管反應性的變化，推測這種變化可能和鐘基因的調控機制相關，血管的收縮反應改變可能與內皮功能改變相關，其作用機制尚未明確。晝夜節律鐘是以24 h 周期組織細胞功能的自主計時機制。在哺乳動物中，主要的晝夜節律振蕩由轉錄-翻譯反饋環組成[11-13]。BMAL1 是核心鐘基因的關鍵元件，也是缺失后導致哺乳動物所有節律完全消失的惟一時鐘基因。鐘基因形成轉錄-翻譯反饋環，維持晝夜節律[13]。晝夜節律的紊亂可影響各種行為和生理功能增加各種疾病的風險，當這些晝夜節律振蕩器的功能被年齡環境或基因突變所擾亂時，細胞功能的時間協調性就失去了，這就降低了機體的健康和適應能力，引起代謝綜合征和心血管疾病等。血管內皮細胞（VECs）是位于心、血管和淋巴管內表面的單層扁平上皮，具有多種生理功能。生物鐘功能障礙可引起內皮功能障礙，內皮功能障礙是導致心血管疾病的關鍵環節，心血管系統又受到晝夜節律分子成分的影響。

圖4 大鼠胸主動脈血管BMAL1 及細胞周期蛋白CDK1、CDK4、CDK6、CyclinB1 的表達情況

圖5 大鼠胸主動脈內皮細胞BMAL1 及細胞周期蛋白CDK1、CDK4、CDK6、CyclinB1 的表達情況

細胞周期表現為一個振蕩器，細胞周期蛋白的循環表達以順序和單向的方式調節細胞周期進程[14]。細胞周期蛋白在細胞周期的特定階段產生，并與其各自組成性表達的細胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）結合。細胞周期蛋白-CDK 復合物（Cyclin/CDK）的激酶活性在細胞周期的特定時間觸發各種事件[15]。各種Cyclin/CDK 復合物的數量和活性的振蕩對細胞周期進程至關重要。本研究結果顯示，熱暴露組胸主動脈血管內皮細胞明顯缺失，彈性纖維紊亂、斷裂；熱暴露組大鼠胸主動脈血管BMAL1 陽性表達增多；體內實驗中，熱暴露組大鼠胸主動脈血管中BMAL1、CyclinB1、CDK1 蛋白表達升高；體外實驗，熱暴露組大鼠胸主動脈內皮細胞中 BMAL1、CyclinB1、CDK1 蛋白表達升高。由此推測，熱暴露可使鐘基因表達水平發生改變，也可以影響細胞周期蛋白的表達，且周期蛋白表達變化比較明顯，其中主要是調控G2/M 期的CyclinB1、CDK1。提示熱暴露可以引起大鼠胸主動脈內皮損傷及組織結構紊亂；大鼠胸主動脈及大鼠胸主動脈內皮細胞鐘基因BMAL1 和細胞周期蛋白表達變化，其主要影響了G2/M 期主要蛋白的表達，對G1/S 期蛋白表達無影響，且在體內外實驗結果呈現一致，提示熱暴露可以改變鐘基因的表達水平，從而影響周期蛋白表達水平，可能通過影響了鐘基因表達及G2/M 期蛋白表達來影響胸主動脈及內皮細胞的功能。

綜上，熱暴露可以引起大鼠胸主動脈內皮結構改變；大鼠胸主動脈內皮細胞鐘基因BMAL1和細胞周期蛋白CyclinB1、CDK1 表達上調，提示熱暴露可以改變鐘基因與細胞周期蛋白的表達水平，此變化可能是通過影響G2/M 期蛋白表達來實現的。