CHI3L1 與MMP9 在子宮內(nèi)膜異位癥大鼠內(nèi)膜中的表達(dá)及意義

王 芳 ， 楊玉娥 ， 李茹月 ， 祖逸崢 ， 陳 華 ， 哈春芳，3

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，銀川 750004； 2.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院婦科，銀川 750004；3.寧夏醫(yī)科大學(xué)生育力保持重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，銀川 750004）

子宮內(nèi)膜異位癥（endometriosis，EMs）是一種慢性炎癥性激素依賴性婦科良性疾病，其病理特征是指子宮腔外具有生長(zhǎng)能力的子宮內(nèi)膜腺體和間質(zhì)的生長(zhǎng)存活并形成異位囊腫，臨床上常以慢性盆腔疼痛、痛經(jīng)和不孕為主要癥狀，影響約6%～10%的育齡期女性[1-2]。EMs 雖為一種良性疾病，但其異位內(nèi)膜卻具有增殖、遷移、侵襲和復(fù)發(fā)等惡性生物學(xué)功能[3]。目前其發(fā)病機(jī)制尚不清楚。幾丁質(zhì)酶3 樣蛋白1（CHI3L1）作為一種新型的炎癥標(biāo)記物，主要由巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞等分泌，參與調(diào)節(jié)急慢性炎性反應(yīng)、細(xì)胞增殖、侵襲、凋亡等多種病理生理過程[4-6]。研究[7]報(bào)道，CHI3L1 蛋白在多種慢性炎癥性疾病及惡性腫瘤中表達(dá)升高，且其高表達(dá)與疾病的不良預(yù)后和促炎/促癌因子誘導(dǎo)腫瘤增殖侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP9）是基質(zhì)金屬蛋白酶家族中的重要一員，可通過參與異位細(xì)胞的黏附和細(xì)胞外基質(zhì)的降解，繼而增強(qiáng)異位細(xì)胞穿透細(xì)胞基底膜的能力，是促使EMs 形成的關(guān)鍵基因[8-9]。本研究建立EMs 大鼠模型，應(yīng)用免疫組織化學(xué)及Western blot 檢測(cè)EMs 大鼠內(nèi)膜組織中CHI3L1、MMP9 的表達(dá)，探討CHI3L1、MMP9 在 EMs 發(fā)生、發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取8 周齡SPF 級(jí)健康性成熟雌性未孕 SD 大鼠 20 只，體質(zhì)量（200±20）g，均由寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，自然光照下常規(guī)飼養(yǎng)，每籠3 只。本研究已獲得寧夏醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)所用試劑 兔多克隆抗體CHI3L1（ab180569）和兔多克隆抗體 MMP9（ab760003）均購(gòu)自于英國(guó)Abcam 公司，BCA 蛋白提取試劑盒和蛋白檢測(cè)試劑盒購(gòu)自凱基公司。免疫組化檢測(cè)試劑盒和DAB 顯色試劑盒均購(gòu)自北京中杉金橋公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物模型的建立 參照文獻(xiàn)及課題組前期造模方法[10]，采用自體移植法誘導(dǎo)建立EMs 大鼠模型，常規(guī)適應(yīng)性喂養(yǎng)大鼠1 周，手術(shù)前2 d給予戊酸雌二醇0.5 mg·kg-1灌胃，使大鼠處于同一動(dòng)情周期。造模方法：以1%戊巴比妥鈉（35 mg·kg-1）腹腔麻醉，腹部備皮、碘伏消毒腹部皮膚，于尿道口上方約1 cm 處正中開腹，切口約2 cm，逐層剪開肌肉、腹膜進(jìn)腹，找到雙角子宮，提起左側(cè)子宮，分別在距離卵巢及宮角分叉約1 cm 處結(jié)扎，剪下左側(cè)子宮放入生理鹽水中，分離漿膜層和肌層，將子宮內(nèi)膜剪成5 mm×5 mm 大小4 塊，內(nèi)膜面貼腹壁，用6-0 可吸收線四角縫合固定于左右側(cè)腹壁血管豐富處，對(duì)照組只開關(guān)腹，不進(jìn)行內(nèi)膜移植。注射用青霉素1.6×105IU·kg-1腹腔注射，逐層間斷縫合腹壁切口關(guān)腹，等待大鼠自然蘇醒。術(shù)后連續(xù) 3 d 肌注青霉素（1.6×105IU·kg-1）預(yù)防感染。造模4 周后二次開腹，肉眼大體觀察移植物生長(zhǎng)情況。造模成功標(biāo)準(zhǔn)：見移植物呈透明或者半透明囊狀增大，內(nèi)含淡黃色清亮或咖啡色樣液體，表面及周圍可見血管形成。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組及標(biāo)本收集處理 隨機(jī)選取10只大鼠作為對(duì)照組（只開關(guān)腹，不進(jìn)行內(nèi)膜移植），選取建模成功的10 只大鼠作為EMs 組。分別取EMs 組在位內(nèi)膜組織、異位內(nèi)膜組織及對(duì)照組大鼠子宮內(nèi)膜組織，然后將組織修剪成約0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm 大小的組織塊，一部分經(jīng)4%多聚甲醛固定48 h 后制成石蠟切片。一部分置于液氮罐中冷卻后轉(zhuǎn)至-80 ℃冰箱備用，后續(xù)行Western blot 檢測(cè)。

1.2.3 組織病理學(xué)觀察 取EMs 大鼠在位、異位內(nèi)膜組織及對(duì)照組大鼠子宮內(nèi)膜組織，經(jīng)4%多聚甲醛固定48 h 后制成石蠟切片（5 μm）、石蠟切片脫蠟復(fù)水（依次入二甲苯Ⅰ-二甲苯Ⅱ-無水乙醇Ⅰ-無水乙醇Ⅱ-90%酒精-80%酒精-70%酒精）、自來水洗凈殘余酒精。蘇木素染色，自來水洗，分化液分化數(shù)秒，自來水洗，返藍(lán)液返藍(lán)，流水沖洗。伊紅染色，脫水封片（切片依次放入80%酒精-90%酒精-無水乙醇Ⅰ-無水乙醇Ⅱ-二甲苯Ⅰ-二甲苯Ⅱ透明，中性樹膠封片），顯微鏡下觀察組織病理學(xué)變化。

1.2.4 免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)CHI3L1 和MMP9表達(dá)情況 組織切片進(jìn)行烤片、脫蠟至水、檸檬酸抗原修復(fù)，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，血清封閉，滴加一抗兔多克隆抗體CHI3L1、MMP9（英國(guó)Abcam 公司），滴加山羊抗兔二抗（北京中杉金橋公司），DAB 顯色（北京中杉金橋公司），蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，梯度酒精脫水，中性樹膠封片后顯微鏡觀察，采用Image J 圖像分析軟件進(jìn)行分析，分別計(jì)算積分光密度（IOD）值與陽性面積，并計(jì)算出平均光密度值，以此數(shù)據(jù)作為CHI3L1 及MMP9 蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.5 Western blot 蛋白印跡法檢測(cè)CHI3L1 蛋白表達(dá) 取EMs 大鼠在位、異位內(nèi)膜組織及對(duì)照組在位內(nèi)膜組織提取總蛋白，根據(jù)BCA 檢測(cè)提取試劑盒（凱基公司）說明測(cè)定蛋白濃度。每孔加入蛋白樣品20 μg，電泳至溴酚藍(lán)剛跑出即可終止。PVDF 膜轉(zhuǎn)膜2 h，5%的脫脂牛奶室溫封閉2 h，TBST 稀釋一抗 CHI3L1（ab180569，Abcam）、β-actin（AF7018，Affnity），4 ℃搖床孵育過夜。室溫孵育1 h，TBST 漂洗 3 次，加山羊抗兔二抗（1∶10000），室溫孵育、TBST 漂洗3 次。加適量 ECL增強(qiáng)液于PVDF 膜，采用BIO-RAD 成像儀顯影曝光，采用Image J 軟件對(duì)目的條帶進(jìn)行分析，以β-actin 為內(nèi)參，根據(jù)曝光結(jié)果計(jì)算光密度比值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，三組均數(shù)比較采用單因素方差分析，方差齊時(shí)兩兩比較采用SNK-q 法。采用Pearson 相關(guān)分析法分析二者相關(guān)性。P≤0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EMs 大鼠模型鑒定及組織學(xué)改變

采用自體移植法建立EMs 大鼠模型，建模4周后二次開腹，可見：移植物囊狀增大，形成透明或者半透明，內(nèi)含淡黃色清亮或咖啡色液體，表面及周圍或可見血管形成（見圖1）；與對(duì)照組相比，EMs 異位內(nèi)膜組織見腺體、間質(zhì)或上皮細(xì)胞生長(zhǎng)，即為建模成功（見圖2）。

2.2 免疫組化染色檢測(cè)CHI3L1、MMP9 在各組大鼠內(nèi)膜組織中的表達(dá)

免疫組化結(jié)果顯示：CHI3L1 主要表達(dá)于子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞和腺體的胞漿中，胞核內(nèi)少量表達(dá)。對(duì)照組間質(zhì)胞漿中少量表達(dá)（見圖3）。MMP9 主要表達(dá)于子宮內(nèi)膜腺體的胞漿中，子宮內(nèi)膜腺上皮及胞核內(nèi)少量表達(dá)。對(duì)照組間質(zhì)胞漿中少量表達(dá)（見圖4）。CHI3L1 在各組間的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=36.337，P＜0.05）。與對(duì)照組相比，CHI3L1 在EMs 組異位內(nèi)膜和在位內(nèi)膜中的表達(dá)升高，且EMs 組異位內(nèi)膜表達(dá)水平高于在位內(nèi)膜（P 均＜0.05）。MMP9 在各組間的表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=14.42，P＜0.05）。與對(duì)照組相比，MMP9 在EMs 組異位內(nèi)膜和在位內(nèi)膜中的表達(dá)均升高，且EMs 組異位內(nèi)膜表達(dá)水平高于在位內(nèi)膜（P 均＜0.05），見表 1。

圖1 EMs 大鼠建模及異位病灶大體肉眼觀表現(xiàn)

圖2 EMs 模型大鼠組織病理學(xué)變化（HE×40）

圖3 各組內(nèi)膜組織中CHI3L1 免疫組化染色圖（×40）

圖4 各組內(nèi)膜組織中MMP9 免疫組化染色圖（×40）

表1 各組內(nèi)膜中CHI3L1、MMP9 蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較（）

表1 各組內(nèi)膜中CHI3L1、MMP9 蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較（）

與對(duì)照組比較△P＜0.05；與 EMs 組在位內(nèi)膜比較▲P＜0.05。

組別 n CHI3L1 MMP9對(duì)照組 10 0.3773±0.0464 0.4441±0.0407 EMs 組在位內(nèi)膜 10 0.4350±0.0143△ 0.5566±0.0212△異位內(nèi)膜 10 0.5261±0.0425▲ 0.6283±0.0690▲F 值 36.337 14.420 P 值 ＜0.05 ＜0.05

2.3 Western blot 檢測(cè)各組內(nèi)膜組織中CHI3L1蛋白表達(dá)水平

Western blot 結(jié)果顯示：與對(duì)照組（0.4900±0.1510）相比，EMs 組在位內(nèi)膜 CHI3L1 蛋白表達(dá)水平（0.7700±0.0889）升高，且 EMs 組異位內(nèi)膜CHI3L1 蛋白表達(dá)水平（0.9000±0.1082）高于在位內(nèi)膜（P 均＜0.05），見圖 5。

圖5 各組內(nèi)膜組織中CHI3L1 蛋白表達(dá)情況

2.4 CHI3L1 與MMP9 蛋白表達(dá)水平的相關(guān)性分析

Pearson 相關(guān)分析結(jié)果顯示：EMs 組異位內(nèi)膜和在位內(nèi)膜中，CHI3L1 蛋白表達(dá)水平與MMP9蛋白表達(dá)水平呈正相關(guān)（r異位內(nèi)膜=0.663，r在位內(nèi)膜=0.695，P 均＜0.05）。

3 討論

EMs 是一種較復(fù)雜、難治性婦科炎癥性疾病，主要好發(fā)于卵巢、直腸子宮陷凹、膀胱子宮陷凹等部位。近年來，EMs 發(fā)病率呈逐年增長(zhǎng)趨勢(shì)，影響全球數(shù)百萬女性的健康和生活質(zhì)量[11]。EMs在組織學(xué)上雖屬于良性病變，但其異位內(nèi)膜的種植卻涉及增殖、黏附、細(xì)胞外基質(zhì)降解和遷移侵襲等多步驟過程。盡管Sampson 提出的經(jīng)血逆流種植學(xué)說早已被廣泛接受，但只有20%的經(jīng)血逆流婦女才發(fā)生EMs 現(xiàn)象，這表明其他額外的因素與EMs 的形成有關(guān)。手術(shù)結(jié)合藥物治療仍是目前主要的治療方式，但手術(shù)和藥物鞏固治療后的高復(fù)發(fā)率仍使得EMs 的治療具有挑戰(zhàn)性[12]。因此，尋找新的生物學(xué)標(biāo)記物對(duì)EMs 的診斷和治療具有重要意義。

CHI3L1 是1993 年首次發(fā)現(xiàn)的人類1 號(hào)染色體q31-32 編碼的一種分泌型糖蛋白，其在人體被稱為YKL-40，而在小鼠體內(nèi)被稱為BRP-39。該蛋白屬于進(jìn)化上保守的18-糖基水解酶基因家族，其包括具有強(qiáng)結(jié)合酶活性的殼多糖酶（Cs）和缺乏降解酶活性的殼多糖酶樣蛋白（CLPs），CHI3L1 屬于后者[13]。研究[14-16]表明，CHI3L1 作為一種新型的炎癥標(biāo)記物，可以由多種細(xì)胞分化產(chǎn)生，其在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、骨肉瘤、直腸癌、乳腺癌、卵巢癌、宮頸癌等實(shí)體腫瘤患者中均表達(dá)升高，提示其可能參與了疾病的進(jìn)程。Libreros 等[17]研究發(fā)現(xiàn)，CHI3L1 蛋白在多種慢性炎癥性疾病及惡性腫瘤中表達(dá)升高，且其高表達(dá)與腫瘤增殖、遷移侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。CHI3L1 可能通過如下途徑發(fā)揮其生物功能：（1）促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)因子樣作用和抑制凋亡：CHI3L1 可能通過對(duì) ERK1/2 和PI3K 的磷酸化，來啟動(dòng)MAPK 和PI3K 信號(hào)通路，繼而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的黏附和遷移侵襲，抑制細(xì)胞凋亡[18-19]。（2）調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)的降解：CHI3L1還可能通過抑制 p38、JNK 磷酸化抵御IL-1β、TNF-α 誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)，抑制基質(zhì)降解限制炎癥因子的分解代謝，調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附侵襲能力，在疾病進(jìn)程中發(fā)揮重要的作用[20]。本研究結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，CHI3L1 在EMs 在位內(nèi)膜組及異位內(nèi)膜組中的表達(dá)升高，且異位內(nèi)膜組表達(dá)高于在位內(nèi)膜組，提示其可能是子宮內(nèi)膜異位癥疾病發(fā)生、發(fā)展中的關(guān)鍵基因，但CHI3L1 在EMs 中如何發(fā)揮調(diào)控作用尚不清楚。

MMPs 是一組依賴于鋅離子的內(nèi)膜酶，其中MMP9 是這一家族中分子量最大的酶，主要定位于人類染色體20q12-13。生理情況下，人類多種正常細(xì)胞中都可以檢測(cè)到極少量無活性的MMP9 存在，而病理狀態(tài)下則處于過度激活狀態(tài)。目前發(fā)現(xiàn)許多因素對(duì)于細(xì)胞外基質(zhì)的降解和子宮內(nèi)膜組織異位種植都很重要，尤其是MMPs。有文獻(xiàn)報(bào)道[21-22]，MMP9 在降解細(xì)胞外基質(zhì)、破壞基底膜完整性，調(diào)節(jié)異位細(xì)胞黏附、侵襲，促進(jìn)異位內(nèi)膜種植等生物學(xué)功能方面發(fā)揮重要作用，提示其可能是由于EMs 患者體內(nèi)高雌激素水平使得上游ERK/MAPK 通路異常激活而表達(dá)失衡，繼而增強(qiáng)異位細(xì)胞浸潤(rùn)基底膜的能力。Yilmaz 等[23]在EMs 患者中發(fā)現(xiàn)MMP9 異常活化，推測(cè)MMP9的高表達(dá)可能為異位內(nèi)膜細(xì)胞的侵襲和種植提供了有利條件，從而揭示MMP9 表達(dá)失衡是促進(jìn)EMs 進(jìn)展的重要機(jī)制之一。本研究免疫組化結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，MMP9 在EMs 模型大鼠內(nèi)膜組織中的表達(dá)明顯增強(qiáng)，且異位內(nèi)膜中的表達(dá)高于在位內(nèi)膜，提示MMP9 參與并在EMs 的發(fā)病過程中起著重要的作用。這與Choi 等[24]在EMs動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)MMP9 被過度激活，而抑制MMP9 的表達(dá)可抑制EMs 模型小鼠子宮內(nèi)膜病變的生長(zhǎng)結(jié)果類似。

腫瘤學(xué)研究表明，CHI3L1 通過與腫瘤細(xì)胞膜上的IL-13Ra2 受體相互作用，通過IL-13Ra2鏈激活細(xì)胞外調(diào)節(jié)信號(hào)激酶-絲裂原活化蛋白激酶（ERK-MAPK）途徑，進(jìn)而誘導(dǎo)侵襲相關(guān)基因（MMPS）的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[20]。本實(shí)驗(yàn)采用自體移植法建立EMs 大鼠模型，HE 染色鑒定模型成功后，分為EMs 組在位內(nèi)膜、EMs 組異位內(nèi)膜和對(duì)照組，免疫組化結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，EMs 組在位內(nèi)膜和異位內(nèi)膜中CHI3L1及MMP9 蛋白的表達(dá)升高，CHI3L1 蛋白與MMP9蛋白表達(dá)在EMs 組在位內(nèi)膜和異位內(nèi)膜中均呈正相關(guān)，說明二者在EMs 的發(fā)病過程中相輔相成，即存在EMs 局部微環(huán)境中的CHI3L1 可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)的降解，增強(qiáng)異位內(nèi)膜細(xì)胞的侵襲能力，從而促進(jìn)了EMs 病灶的發(fā)生、發(fā)展。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果從蛋白水平證實(shí)CHI3L1 及MMP9 在EMs 大鼠內(nèi)膜組織中的表達(dá)增高且呈正相關(guān)，提示 CHI3L1、MMP9 與 EMs 的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切，其具體作用機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。