COPD 大鼠高凝狀態與 HIF-1α、EPO、RBC 和 HGB 水平的相關性研究

武 杰， 張 瑞， 許 旺， 張少華， 陳麗君

（1.寧夏醫科大學，銀川 750004； 2.寧夏醫科大學顱腦疾病重點實驗室，銀川 750004； 3.寧夏醫科大學第二附屬醫院呼吸與危重癥學科，銀川 750001； 4.寧夏醫科大學第二附屬醫院病理科，銀川 750001）

最新研究顯示，我國40 歲以上人群慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）患病率為13.7%[1]。COPD 患者常伴有凝血-纖溶功能異常，導致機體處于高凝或血栓前狀態，這種病理改變使患者易發生血栓性疾病或誘發慢性阻塞性肺疾病急性加重（AECOPD），頻繁急性加重會加速疾病進展并導致患者死亡[2-5]。由此可見，COPD 具有高患病率和高病死率，已嚴重危害人類身體健康。COPD 的主要病理學表現為肺氣腫和慢性支氣管炎，隨著病情進行性加重，最終可導致通氣及換氣功能障礙，造成機體缺氧。缺氧誘導因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）是目前發現在缺氧狀態下可以發揮活性的唯一一個高度特異性核轉錄因子，缺氧下快速表達，常氧下迅速降解，與人類眾多缺氧性疾病密切相關[6]。本課題組前期研究[7]發現，COPD 患者外周靜脈血中HIF-1α 水平高于健康者，并與機體缺氧程度相關，表明 HIF-1α 與COPD 的發生有關聯。促紅細胞生成素（erythropoietin，EPO）是 HIF-1α 的下游靶基因之一，具有促進紅細胞（red blood cell，RBC）增殖、分化及成熟的生理學功能[8]。EPO 的過量表達，可引起體內 RBC 總數和血紅蛋白（hemoglobin，HGB）表達量增多，導致血液黏滯。本文通過脂多糖疊加煙熏的方法建立COPD 大鼠模型，首次探討HIF-1α、EPO、RBC、HGB 與 COPD 髙凝狀態之間的關系，以期為臨床有效預防COPD 疾病進展提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 健康SPF 級雄性SD 大鼠20只，平均體質量（200±20）g，由寧夏醫科大學實驗動物中心提供（SYXK 寧2015-0001），隨機分為COPD 組和對照組，每組各10 只，均飼養于SPF級清潔環境。

1.1.2 試劑與儀器 脂多糖（美國Sigma：L2880），紅河牌卷煙（云南省紅云紅河煙草有限公司），D-D、FIB、EPO 的 ELISA 試劑盒（上海酶聯生物科技有限公司），Total RNA 提取試劑盒（Omega：R6834-01），逆轉錄試劑盒（Takara：RR036A），QPCR 試劑盒（Takara：RR820A），引物（上海生工有限公司）；自制染毒箱（70 cm×55 cm×35 cm），煙霧發生器（美國 Buxco），小動物肺功能儀（美國 Buxco），血常規分析儀（德國 SIEMENS），全自動凝血分析儀（德國 BE-Compact），紫外可見分光光度計（美國 Thermo），酶標儀（瑞士TECAN），熒光定量PCR 儀（美國 Bio-Rad）。

1.2 方法

1.2.1 COPD 大鼠模型制備 采用脂多糖疊加煙熏法制備 COPD 大鼠模型，第 1、14 天 COPD組大鼠氣管內注入脂多糖（200 μg/次）；第 2～13、15～60 天將大鼠放入自制染毒箱被動吸煙（每天2 次，每次 75 min，兩次間隔時間>3 h，每次 9 支香煙）；第61～90 天將大鼠放入自制染毒箱內被動吸煙（每天1 次，每次50 min，每次7 支香煙）；造模共90 d，對照組大鼠不做特殊處理。

1.2.2 大鼠肺功能測定 大鼠稱重，給予2%戊巴比妥納（50 mg·kg-1）腹腔注射麻醉大鼠，于頸部正中切開氣管，插入氣管接管，放入體描箱，使用小動物肺功能儀測定肺總量（total lung capacity，TLC）、功能殘氣量（functional residual capacity，FRC）、200 ms 用力呼氣量與用力肺活量比值（FEV200/FVC）、吸氣阻力（airway resistance，RI）等參數。

1.2.3 大鼠血漿中 HIF-1α、EPO、APTT、PT、FIB、D-D 濃度檢測 麻醉大鼠，固定于解刨板，心臟采血，使用枸櫞酸鈉抗凝管收集2 mL 血液，立即4000 r·min-1離心 10 min，取上層血漿，采用 BECompact 全自動凝血分析儀檢測凝血酶原時間（prothrombin time，PT）、活化部分凝血酶原時間（activated partial thromboplastin time，APTT）表達量，采用ELISA 試劑盒按照說明書檢測HIF-1α、EPO、血漿纖維蛋白原（fibrinogen，FIB）、D 二聚體（D-dimer，D-D）表達量。

1.2.4 大鼠全血中RBC、HGB 濃度檢測 麻醉大鼠，心臟采血，使用EDTA 抗凝管收集2 mL 血液，立即顛倒混勻防止凝血，采用血常規分析儀檢測大鼠RBC、HGB 表達量。

1.2.5 大鼠肺組織取材及病理學觀察 采用空氣栓塞法處死大鼠，開胸取左側肺浸泡于10%中性福爾馬林液，固定24 h，磷酸鹽緩沖液沖洗，常規石蠟包埋連續切片，行HE 染色。取大鼠右側肺上葉置于凍存管，經液氮速凍后置于-80 ℃冰箱儲存備用。

1.2.6 大鼠肺組織中 HIF-1α、EPO mRNA 濃度測定 取凍存組織，按Total RNA Kit 試劑盒說明書提取總RNA，經紫外分光光度計測定OD260/280 在1.8～2.0。按照逆轉錄試劑盒說明書合成cDNA。使用qPCR 試劑盒測定mRNA 濃度。HIF-1α 引物序列：上游 5"-CCTTCATCGGAAACTCCA-3"，下游 5"-CTGGGGCATGGTAAAAGA-3"；EPO 引物序列參考文獻[9-10]，EPO 引物序列：上游 5"-CCCTGCTGCTTTTACTA-3"，下游 5"-ACATTTTCTGCCTCCTT-3"；內參 ACTB 引物序列：上游 5"-GAGAGGGAAATCGTGCGT-3"，下游5"-GGAGGAAGAGGATGCGG-3"。PCR 反應體系為 20 μL，TB Green Premix 10 μL，Forward Primer 0.8 μL，Reverse Primer 0.8 μL，DNA 模板 2 μL，滅菌水6.4 μL。反應條件：95 ℃預變性30 s，按下列程序循環 40 次：95 ℃變性 5 s，57 ℃退火 30 s，72 ℃延伸1 min。采用儀器自帶溶解曲線，以ACTB 作為內參，采用 2-ΔΔCt法測定 HIF-1α mRNA、EPO mRNA 相對表達量。

1.3 統計學方法

數據采用SPSS 23.0 軟件進行分析，計量資料以均數±標準差（）表示，組間比較采用t 檢驗，各參數間相關分析采用Pearson 相關性分析。P≤0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組大鼠肺功能參數比較

COPD 組大鼠 TLC、FRC、RI 均高于對照組，FEV200/FVC 低于對照組（P 均＜0.05），見表 1。

表1 兩組大鼠肺功能參數比較（）

表1 兩組大鼠肺功能參數比較（）

組別nTLC/mLFRC/mLFEV200/FVCRI/［cmH2O·（mL·s）-1］對照組 10 25.81±2.20 8.52±0.72 0.75±0.14 0.26±0.07 COPD 組 10 32.16±4.56 11.25±2.89 0.62±0.10 0.33±0.05 t 值 3.966 2.891 -2.461 2.774 P 值 0.002 0.016 0.024 0.013

2.2 兩組大鼠 HIF-1α、EPO、RBC、HGB、APTT、PT、FIB、D-D 比較

COPD 組大鼠 HIF-1α、EPO、RBC、HGB、FIB、D-D 均較對照組升高，APTT、PT 均較對照組縮短（P 均＜0.05），見表 2。

2.3 兩組大鼠肺組織病理學對比

與對照組大鼠相比，COPD 組大鼠肺組織HE 染色后表現為肺氣腫和慢性支氣管炎：肺泡明顯擴張，肺泡間隔破裂并融合成大的囊腔，支氣管壁周圍可見大量炎細胞浸潤，見圖1A、圖1B、圖 1C。

2.4 兩組大鼠肺組織中 HIF-1α mRNA、EPO mRNA 相對表達量比較

與對照組比較，COPD 組大鼠肺組織中HIF-1α mRNA 和 EPO mRNA 表達量均升高（t=2.294、4.314，P 均＜0.05），見圖 2A、圖 2B。

2.5 大鼠 HIF-1α、EPO、RBC、HGB 與 APTT、PT、FIB、D-D 的相關性分析

COPD 組大鼠血漿EPO 表達量與血漿HIF-1α、全血 RBC、全血 HGB 及血漿 D-D 表達量呈正相關（P 均＜0.05），與血漿 APTT、PT、FIB 表達量無相關性（P 均＞0.05），見表 3、表 4。COPD 組大鼠血漿 HIF-1α 表達量與血漿 FIB、D-D 表達量呈正相關（P 均＜0.05），與血漿 APTT、PT 表達量無相關性（P 均＞0.05）；COPD 組大鼠全血 RBC、HGB 表達量與血漿D-D 表達量均呈正相關（P均＜0.05），與血漿 APTT、PT、FIB 表達量均無相關性（P 均＞0.05），見表 4。

3 討論

近年來國內多采用單純煙熏或煙熏聯合脂多糖的方法建立COPD 大鼠模型，但造模時間尚無統一標準。顧延會等[11]采用滴加2 次脂多糖聯合煙熏28 d 的方法建立COPD 大鼠模型。本次造模過程中發現，造模1 個月時該組大鼠肺部未出現典型COPD 病理改變，僅有少量炎細胞浸潤，表現為細支氣管炎癥，這表明造模時間過短可能無法得到穩定或典型的COPD 大鼠模型。造模3 個月時該組大鼠肺部出現典型COPD 特征性病理改變，肺泡明顯擴張，肺泡間隔破裂并融合成大的囊腔，細支氣管管壁可見大量炎細胞浸潤，符合人類COPD 的主要病理學改變，說明造模時間越長，建立的COPD 大鼠模型越符合人類COPD 的病理改變。本文結果顯示，COPD 組大鼠TLC、FRC、RI 均高于對照組，FEV200/FVC 低于對照組，證明COPD 組大鼠存在阻塞性通氣功能障礙。由此可見，煙熏聯合脂多糖3 個月的造模方法，可成功建立符合人類COPD 病理生理改變的COPD 大鼠模型。

表 2 兩組大鼠 HIF-1α、EPO、RBC、HGB 及凝血指標變化（）

表 2 兩組大鼠 HIF-1α、EPO、RBC、HGB 及凝血指標變化（）

組別nHIF-1α/（pg·mL-1）EPO/（μg·L-1） RBC/（×1012/L）HGB/（g·L-1）APTT/sPT/sFIB/（g·L-1） D-D/（mg·L-1）對照組 10 27.10±10.27 2.66±1.30 8.67±0.49 153.10±10.29 25.47±2.44 10.25±0.70 4.94±0.93 0.51±0.13 COPD 組 10 41.97±12.82 4.56±1.43 10.02±0.53 168.30±9.17 21.55±2.23 9.20±0.27 6.34±1.11 0.64±0.14 t 值 2.862 3.110 5.870 3.488 -3.754 -4.435 3.053 2.252 P 值 0.010 0.006 ＜0.001 0.003 0.001 ＜0.001 0.007 0.037

圖1 兩組大鼠肺組織HE 染色圖片（×100）

圖2 兩組大鼠肺組織HIF-1α mRNA、EPO mRNA 相對表達量比較

表 3 EPO 與 HIF-1α、RBC、HGB 的相關性分析

表 4 HIF-1α、EPO、RBC、HGB 與凝血指標的相關性分析

在生理狀態下，血液中存在凝血系統、抗凝血系統及纖溶系統之間的動態平衡，以保證血液在循環系統中的正常流動。血液的高凝狀態是由于凝血功能亢進和（或）纖溶功能降低所致[12]。臨床上常用APTT 反映內源性凝血功能，PT 反映外源性凝血功能，APTT、PT 時間縮短通常表示機體處于高凝狀態。FIB 即凝血因子Ⅰ，可與凝血酶結合，交聯形成纖維蛋白，導致血小板及紅細胞聚集，高水平FIB 往往預示機體處于高凝狀態[13]。D-二聚體是纖維蛋白原的降解產物，其水平升高，通常反映機體處于高凝及繼發性纖溶亢進狀態[14]。本研究發現，與對照組大鼠比較，COPD 組大鼠 APTT、PT 縮短，D-D、FIB 升高，與徐祎等[15-17]研究結果一致，說明COPD 疾病可以導致機體處于高凝狀態。

本研究發現，COPD 組大鼠 HIF-1α、RBC、HGB 表達水平較對照組升高。HIF-1α 濃度升高表明機體處于缺氧狀況。本研究中COPD 組大鼠血漿及肺組織中EPO 表達水平較對照組高，說明在缺氧條件下EPO 表達量增加。相關性分析顯示，COPD 組大鼠血漿EPO 與全血 RBC、HGB及血漿HIF-1α 均呈正相關。Yu 等[18]在細胞實驗中也證明，EPO 是 HIF-1α 的下游靶基因，缺氧條件下受其調控表達量增加。COPD 缺氧導致HIF-1α 表達水平升高，從而上調下游靶基因EPO 的高表達，進一步導致RBC、HGB 濃度升高，血液黏稠度增加，而血液高黏是導致肺動脈壓升高的原因之一。因此，EPO、RBC、HGB 的改變促進了COPD 疾病的進展。

相關性分析還顯示，COPD 組大鼠血漿D-D與血漿 HIF-1α、EPO、全血 RBC 及 HGB 呈正相關，血漿 FIB 與血漿 HIF-1α 呈正相關。HIF-1α、EPO、RBC、HGB 均與凝血指標存在相關性，說明HIF-1α、EPO、RBC、HGB 表 達 量 增 加 可 能 與COPD 凝血-纖溶功能異常相關，導致機體處于高凝或血栓前狀態。可能在長期缺氧刺激下，HIF-1α-EPO 通路引起繼發性紅細胞增多，導致血液黏滯，紅細胞變形性降低并聚集成團形成血栓，促進血小板和內皮細胞的黏附和聚集，損傷血管內皮細胞，啟動血液凝血過程，從而導致COPD 高凝狀態的發生[10]。

綜上所述，脂多糖疊加煙熏3 個月造模，可成功建立符合人類COPD 病理生理改變的COPD大鼠模型。COPD 大鼠處于高凝狀態，體內HIF-1α、EPO、RBC、HGB 高表達且均與凝血指標（PT、APTT、FIB、D-D）存在相關關系，其可能參與COPD 大鼠高凝狀態的發生。