枸杞多糖對脂多糖誘導人視網膜色素上皮細胞凋亡的影響

閆 梅 ， 馬 倩 ， 馬雅玲 ，， 劉 媛 ， 蔣 璐

（1.寧夏醫科大學，銀川 750004； 2.寧夏醫科大學總醫院眼科，銀川 750004）

年齡相關性黃斑變性（age-related macular degeneration，AMD）是累及視網膜神經上皮層、色素上皮層、Bruch 膜及脈絡膜毛細血管層的退行性病變，涉及氧化應激、光損傷、炎癥、遺傳基因等多種致病因素[1]。視網膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）位于神經視網膜與脈絡膜之間，功能包括參與構成血-視網膜屏障、調節代謝物質的轉運、吞噬感光細胞外節段、調節局部炎性反應、參與黃斑的免疫防御、保護視網膜免受過度光照等[2]。炎癥、氧化應激等刺激可造成RPE 炎性反應損傷，導致RPE 吞噬功能下降，未消化的碎片持續存于胞漿，久之溢出并沉積于Bruch 膜和基底膜之間形成玻璃膜疣，導致萎縮性AMD，再進展造成Bruch 膜破壞，新生血管出現，形成滲出性 AMD[1，3]。有學者[4-7]研究發現，許多中藥及藥物存在抗炎的功效，例如姜黃素、七葉皂苷、漢黃苓素，血管緊張素轉換酶激動劑等，并均采用脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導建立AMD 的細胞炎性反應模型 。

枸杞多糖（lycium barbarum polysaccharide，LBP）具有明確的抗炎、抗凋亡的作用，它可通過核因子-kB（nuclear factor-kB，NF-kB）通路調節炎癥及凋亡，也能夠通過抗凋亡機制發揮抗腫瘤作用[8-10]。本課題組前期研究[11-13]證實了LBP 對氧化應激造成視網膜神經節細胞的凋亡具有抑制作用。本實驗以研究RPE 炎性反應為目標，應用LPS 誘導人視網膜色素上皮細胞-19（adult retinal pigment epithelial cells-19，ARPE-19）建立炎性反應模型，觀察LBP 對細胞炎性反應及相關細胞凋亡的影響，探討RPE 炎性反應機制，以期為AMD 的藥物治療及預防提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 ARPE-19 細胞株（中科院上海細胞庫）、LBP（寧夏沃福百瑞）、LPS（美國 Sigma）、胎牛血清（美國 Gibco）、DMEM-F12 培養基（美國Hyclone）、CCK-8 細胞增殖及毒性檢測試劑盒（上海貝博）、Annexin V-FITC 凋亡檢測試劑盒（上海貝博）、RT-PCR 逆轉錄試劑盒（Invitrogen）、SYBR Green qPCR Master Mix （DBI Bioscience）、總 RNA 提取試劑盒（北京天根）、引物（上海生工）、全蛋白提取試劑盒（凱基生物）、BCA 蛋白定量試劑盒（凱基生物）、化學發光高敏檢測試劑盒（凱基生物）、人白細胞介素（interleukin，IL）-6、IL-1β 及單核細胞趨化蛋白-1（monocyte chemotactic protein-1，MCP-1）的ELISA試劑盒（酶免，CAT：0049H2、0181H2、0081H2）、兔源多克隆抗體 Bax、Bcl-2（BIOSS，CAT：0127R、0032R）、鼠源單克隆抗體β-Actin（中杉金橋，CAT：TA-09）、羊抗兔 HRP 標記 IgG 抗體（Affinity，CAT：#S0001）、羊抗鼠 HRP 標記 IgG 抗體（索萊寶，CAT：SE131）。

1.1.2 儀器 Infinite M200 Pro 酶標儀（瑞士TECAN）、PowerPac 200 電泳儀、IQ5 RT-PCR 儀及ChemiDocTouch 化學發光成像系統（均購自美國 Bio-Rad）。

1.2 方法

1.2.1 ARPE-19 細胞培養 細胞于 37 ℃、5%CO2條件中培養，待細胞生長約為85%時使用0.25%含乙二胺四乙酸（EDTA）的胰蛋白酶進行消化，1200 r·min-1離心 5 min，1∶3 傳代，加入完全培養基（10%胎牛血清，1%青鏈霉素混合液，89%DMEM-F12 培養基）接種于 T25 培養瓶中，2 d 換液 1 次，穩定傳代后取 2～4 代用于實驗。同時，細胞密度為85%時進行消化離心，加入凍存液，含10%二甲基亞砜（DMSO）、90%胎牛血清（FBS），重懸，放入-80 ℃冰箱凍存，次日投入液氮長期保存。

1.2.2 實驗分組及處理 根據LBP 的不同濃度將細胞隨機分為空白組，模型組，0.1、0.5、1 mg·mL-1LBP 組。所有分組加藥前均使用不含血清的培養基饑餓24 h。空白組使用完全培養基培養，與其余組同時換液；模型組給予含10 μg·mL-1LPS的完全培養基刺激24 h；LBP 組分別給予含有0.1、0.5、1 mg·mL-1的 LBP 完全培養基培養 24 h后，再以同樣造模方式給予10 μg·mL-1LPS 刺激24 h。

1.2.3 CCK-8 觀察細胞活力情況 按CCK-8 試劑盒步驟細胞以濃度為5×103/mL-1接種于96 孔板中，培養24 h。設置對照孔、無細胞空白孔及實驗孔，給予不同濃度 LBP 及 10 μg·mL-1LPS 后再培養24、48 和72 h。檢測時加入10%CCK-8，37 ℃培養箱中避光孵育2 h，酶標儀450 nm 檢測OD 值。

1.2.4 流式細胞儀觀察細胞凋亡 使用6 孔板培養細胞，待密度至85%時按試劑盒步驟進行處理。使用不含 EDTA 的胰酶消化，300×g，4 ℃離心5 min 收集細胞，再用預冷PBS 洗滌細胞兩遍，吸取400 μL Annexin V 結合液重懸細胞，濃度為1×106/mL-1，再重懸加入 5 μL Annexin V-FITC 染色液，混勻后避光條件下，4 ℃孵育15 min。再加入10 μL PI 染色液，4 ℃避光孵育 5 min，1 h 內流式細胞儀進行檢測。

1.2.5 RT-PCR 檢測細胞內凋亡相關因子的mRNA 表達量 上述各組細胞接受處理并收集后按照天根總RNA 提取試劑盒步驟過柱提取，提取后測定RNA 濃度，每組取等量RNA 參照Invitrogen 逆轉錄試劑盒步驟，進行逆轉錄合成為cDNA，-80 ℃保存。使用DBI SYBR Green qPCR Master Mix 試劑盒，按照步驟以cDNA 為模板進行實時熒光定量PCR 擴增。Bcl-2 引物序列：F為 GACTTCGCCGAGATGTCCAG；R 為 GAACTCAAAGAAGGCCACAATC。Bax 引物序列：F 為CGAACTGGACAGTAACATGGAG；R 為 CAGTTTG CTGGCAAAGTAGAAA。GAPDH 引物序列：F 為CAGGAGGCATTGCTGATGAT；R 為 GAAGGCTG GGGCTCATTT。反應體系為20 μL。采用試劑盒中標準三步法進行RT-PCR 擴增，反應條件為：預變性為 95 ℃時 2 min；PCR 反應為 95 ℃時10 s，50～60 ℃時 30～34 s，72 ℃時 30 s，共 40 個循環；熔解曲線為55～98 ℃時84 個循環。得出Ct值，以GAPDH 為內參，使用相對定量法，計算2-△△Ct值。

1.2.6 Western blot 檢測相關因子蛋白表達水平 各組細胞接受處理后，根據全蛋白提取試劑盒步驟，冷PBS 洗滌細胞2 次，加入提前配制的裂解液并刮出細胞，收集放置冰上，間隔4 min震蕩 1 次，每次持續1 min，循環 5 次，離心機12000 r·min-1，4 ℃離心 20 min 取上清液，依照試劑盒步驟進行蛋白定量。剩余按體積比加入上樣緩沖液，放入100 ℃水中變性10 min 備用。配制10%SDS-凝膠，取30 μg 蛋白上樣，加入電泳液，連接電泳儀調整電壓為60 V 進行電泳，至玻璃板底部后打開切膠進行轉膜（PVDF 膜、濕轉、220 mA、60 min）。拿出后5%脫脂奶粉封閉4 h，洗膜（0.1%PBST5 min，重復 3 次）后一抗封閉過夜，第二天洗膜后二抗孵育2 h，再洗膜，取出并于表面滴加超敏化學發光液進行曝光。使用Image J 軟件進行條帶灰度值分析，Bcl-2、Bax 分別與相應β-Actin 比值進行計算。

1.2.7 ELISA 檢測細胞上清液炎癥因子的表達水平 各組細胞給予處理后，無菌管收集上清液，2500 r·min-1離心 20 min，放入-80 ℃備用。按試劑盒步驟同時設置空白孔、標準品孔、樣品孔，標準品孔各加入不同濃度標準品50 μL。各樣品稀釋5 倍后每孔加入50 μL，空白孔不加樣品，再加入酶標試劑100 μL，封板后37 ℃溫箱孵育1 h。取出后棄液、甩干、洗滌。每次洗滌30 s，反復5 次，拍干。然后每孔避光加入顯色劑A 50 μL、B 50 μL，振蕩混勻，37 ℃避光顯色 15 min，取出每孔加入終止液50 μL 終止反應，15 min 內放入酶標儀，設置450 nm 波長檢測各孔OD 值。通過標準曲線公式計算并乘以稀釋倍數得出終濃度。

1.3 統計學方法

采用SPSS 23.0 統計學軟件對數據進行分析，GraphPad Prism 7 作圖。符合正態性、方差齊性的計量資料以均數±標準差（）表示，CCK-8結果分析采用兩因素方差分析，其他實驗結果多組之間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 LSD-t 檢驗。P≤0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 LBP 對 LPS 誘導后 ARPE-19 細胞密度及形態的影響

各組細胞培養24 h 后使用倒置熒光顯微鏡明場觀察細胞形態，正常生長的ARPE-19 細胞呈卵圓形、三角形，細胞密度增高后呈鋪路石樣外觀。與空白組相比，LPS 誘導后細胞密度降低，部分細胞呈現出長梭形，部分收縮變圓。而LBP處理組細胞隨著LBP 濃度升高其密度及形態趨于正常，見圖1。

2.2 LBP 對 LPS 誘導后 ARPE-19 細胞活力及增殖的影響

CCK-8 結果顯示，與空白組相比，模型組ARPE-19 細胞活力隨時間延長而下降，各濃度LBP組細胞活力隨著LBP 濃度和時間的延長而升高（F交互=31.35，F時間=935.5，F濃度=85.85，P 均＜0.01）。其中，各時間點 0.1 mg·mL-1組與 1 mg·mL-1組比較差異有統計學意義（P 均＜0.05），見圖 2。

2.3 LBP 對LPS 誘導后 ARPE-19 細胞凋亡率的影響

流式細胞儀檢測結果表明，各組細胞凋亡率差異有統計學意義（F=37.960，P＜0.05）。模型組細胞凋亡率較空白組升高，不同濃度LBP 組細胞凋亡率均較模型組下降（P 均＜0.05），1 mg·mL-1LBP 組細胞凋亡率較 0.1 mg·mL-1LBP 組降低（P＜0.05），見圖 3。

圖1 倒置熒光顯微鏡觀察各組細胞密度及形態的變化（×100）

圖2 CCK-8 檢測LBP 對LPS 誘導后ARPE-19 的細胞活力及增殖的影響

圖3 不同濃度LBP 對LPS 誘導后ARPE-19 凋亡率的影響

2.4 LBP 對 LPS 誘導后 ARPE-19 細胞內凋亡相關因子mRNA 表達量的影響

RT-PCR 結果顯示，各組 Bcl-2、Bax mRNA表達量差異均有統計學意義（F=19.616、39.801；P均＜0.01）。與空白組比較，模型組Bcl-2 表達量降低、Bax 表達量升高（P 均＜0.01）；與模型組比較，各濃度 LBP 組 Bcl-2 均上調、Bax 均下調（P 均＜0.01）；0.1 mg·mL-1LBP 組與 1 mg·mL-1LBP 組比較差異有統計學意義（P＜0.05），見圖 4。

2.5 LBP 對 LPS 誘導后 ARPE-19 細胞內凋亡相關因子蛋白表達量的影響

圖4 不同濃度LBP 對LPS 誘導后ARPE-19 中Bcl-2、Bax 的mRNA 相對表達量的影響

Western blot 結果顯示，各組 Bcl-2、Bax 蛋白相對表達量差異均有統計學意義（F=24.811、39.110，P 均＜0.01）。模型組較空白組的 Bcl-2 表達量降低、Bax 升高（P 均＜0.05）；與模型組相比，0.1、0.5、1 mg·mL-1LBP 組的 Bcl-2 表達量均增加，Bax 表達量均減少（P 均＜0.01）；1 mg·mL-1LBP 組 Bax 表達量比 0.1 mg·mL-1組減少（P＜0.05），見圖 5。

2.6 LBP 對 LPS 誘導 ARPE-19 外分泌炎癥因子的影響

ELISA 結果顯示，各組 IL-6、IL-1β 及 MCP-1蛋白表達量差異均具有統計學意義（F=650.978、14.332、54.249，P 均＜0.05）。與空白組相比，模型組上清液內 IL-6、IL-1β 及 MCP-1 蛋白表達量均升高；與模型組相比，各濃度LBP 組IL-6、IL-1β 及 MCP-1 蛋白表達量均降低（P 均＜0.05）。1 mg·mL-1LBP 組的各因子濃度較 0.1 mg·mL-1LBP 組均降低（P 均＜0.05），見圖 6。

3 討論

LBP 是中藥枸杞中的主要活性成分，能夠通過不同的炎性通路抑制多種細胞中炎癥因子的生成以及細胞凋亡的發生。首先，LBP 能夠通過抑制細胞炎癥減少凋亡的發生。Li 等[14]用LBP 預處理通過激活絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated brotein kinase，MAPK）炎性通路逆轉凋亡因子Caspase-3 的表達，達到抗人角質形成細胞凋亡的目的。Zhao 等[15]發現LBP 通過抑制炎性通路NF-kB 和p38 MAPK 的激活降低海馬神經元中炎性因子腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor，TNF-α）、IL-1β、IL-6、IL-10 的水平，同時減弱神經元細胞中的線粒體凋亡途徑，抑制了小鼠腦缺血損傷造成的細胞凋亡。再者，AMD 的炎癥機制病理過程為RPE 受到外界刺激后活化，產生多種炎癥因子MCP-1、IL-8 等，細胞內活化的細胞因子及生長因子異常造成凋亡基因的異常，導致RPE 細胞凋亡[16]。并且，近年有關炎癥與細胞凋亡的研究中也表明，炎癥時細胞內炎性小體形成，Caspase-8 可被激活，導致細胞凋亡[17]。Celkova等[18]也在AMD 患者的眼中發現RPE 的細胞程序性死亡及 NLRP3 炎性體、IL-18、Caspase-1 及IL-1β 的升高，以及NLRP3 炎性體相關通路的激活。研究[19]發現，滲出性AMD 患者房水中炎癥因子IL-6、MCP-1 的蛋白水平高于正常人，MCP-1參與AMD 中炎性反應的調控及脈絡膜新生血管的形成，所以本實驗研究選擇檢測LBP 對AMD的細胞炎癥模型中RPE 細胞凋亡線粒體途徑標志性凋亡因子Bcl-2、Bax 的影響，以及細胞外分泌炎癥因子IL-6、IL-1β、MCP-1 的變化，用以判斷LBP 是否可能通過減少炎癥因子的形成降低RPE 炎性反應，從而抑制炎性反應相關的RPE 細胞凋亡。

圖5 不同濃度LBP 對LPS 誘導后ARPE-19 中Bcl-2、Bax 的蛋白相對表達量的影響

圖6 不同濃度LBP 對LPS 誘導后ARPE-19 上清液中炎癥因子的影響

由于LPS 作為AMD 炎性細胞模型中的細胞凋亡刺激物被研究者廣泛采用[20-21]。故本實驗選用了LPS 誘導ARPE-19 造成AMD 體外炎癥模型。為判斷RPE 的炎性反應，本研究檢測了LBP對LPS 誘導ARPE-19 后細胞上清液中炎癥因子IL-6、IL-1β、MCP-1 蛋白濃度的變化，以明確LBP 對ARPE-19 外分泌炎癥因子的影響。結果表明，LPS 造成細胞上清中炎癥因子含量的升高，而在使用不同濃度LBP 進行預處理后，炎癥因子 IL-6、IL-1β、MCP-1 濃度下降，證實 LBP 對LPS 誘導的ARPE-19 炎性反應具有抑制作用。

針對細胞凋亡，本實驗進行了三個方面的觀察。首先，LPS 可造成ARPE-19 細胞活力以及細胞增殖的下降，同時CCK-8 結果顯示，在給予LBP預處理后，受LPS 刺激影響的ARPE-19 細胞活力及增殖能力明顯被逆轉，并且隨LBP 濃度的升高保護作用明顯增強，在本研究中1.0 mg·mL-1的LBP 作用最強。LBP 對細胞活力以及細胞增殖的保護作用，側面驗證了LBP 能夠抑制細胞增殖周期內LPS 誘導炎性損傷所致ARPE-19 的減少，拮抗炎性反應相關的RPE 細胞凋亡。

其次，為明確LBP 的抗凋亡作用是否存于出現炎性反應的RPE 細胞中，本研究觀察LBP 對LPS 誘導后ARPE-19 的細胞凋亡率的影響。發現經 LPS 誘導ARPE-19 細胞凋亡率上升，而LBP 預處理后細胞凋亡率下降，1 mg·mL-1LBP處理后細胞凋亡率從19%左右降低到8%左右，并隨LBP 濃度升高而下降，表明LBP 具有抑制炎性反應相關的RPE 細胞凋亡的作用。

最后，通過對凋亡蛋白的研究也證實了LBP抗凋亡的作用。在細胞凋亡的研究進展中，已明確細胞凋亡的線粒體途徑與細胞應激及發育狀態密切相關[22]。細胞在應激損傷的狀態下，能夠改變Bcl-2 蛋白家族的功能，從而破壞線粒體外膜的完整性，且Bcl-2 蛋白家族中三種效應蛋白Bax、Bak 和Bok 直接引起線粒體外膜通透性的增加，將線粒體膜間隙的蛋白質釋放到胞漿中，而其中活性Bax 和Bak 被抗凋亡蛋白Bcl-2 抑制[22]。故本研究選擇觀察Bcl-2、Bax 這兩種線粒體途徑標志性因子的表達。實驗發現，在ARPE-19 細胞中，LPS 刺激引起細胞凋亡率升高，也能誘導抗凋亡蛋白Bcl-2 的表達量降低、凋亡效應蛋白Bax 的表達量升高。各濃度LBP 作用顯示其在減少炎癥因子外分泌的同時，使Bcl-2 及Bax的表達逆轉，并隨LBP 濃度升高而增強。由此證實LPS 存在誘導RPE 炎性反應及細胞凋亡的作用，以及LBP 具有降低RPE 炎性反應及細胞凋亡的能力，還表明抑制細胞凋亡途徑可能通過線粒體途徑進行，但凋亡途徑問題還需進一步研究明確。

綜上所述，LBP 對 LPS 誘導的 ARPE-19 炎性損傷具有保護作用，可通過減少分泌炎癥因子IL-6、IL-1β 及 MCP-1 以及逆轉 RPE 細胞內Bcl-2、Bax 的轉錄和翻譯過程，從而抑制炎性反應相關的RPE 細胞凋亡。