黃體生成素干預(yù)大鼠卵巢顆粒細(xì)胞的蛋白質(zhì)組學(xué)分析

董玉婷， 陳泰任， 葉曉鋒， 黑常春， 蔡玉芳， 孔 斌， 趙承軍， 常 青

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖與組織胚胎學(xué)系，生育力保持教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，銀川 750004； 2.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院腫瘤醫(yī)院，銀川 750004）

卵巢顆粒細(xì)胞（granulosa cells，GCs）是唯一與卵母細(xì)胞緊密相互作用的體細(xì)胞，廣泛參與原始卵泡募集、優(yōu)勢(shì)卵泡選擇、甾體激素分泌和卵泡閉鎖等過程，在卵泡發(fā)育和轉(zhuǎn)歸過程中發(fā)揮重要作用[1-2]。卵泡發(fā)育中晚期，卵巢顆粒細(xì)胞出現(xiàn)黃體生成素受體（luteinizing hormone receptor，LHR）。LHR屬G蛋白偶聯(lián)受體，黃體生成素（luteinizing hormone，LH）和 LHR 的結(jié)合，激活卵巢顆粒細(xì)胞 cAMP/PKA、PLC/PKC、ERK1/2 等信號(hào)通路，誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞中表皮生長(zhǎng)因子樣配體（epidermal growth factor-like ligands，EGF-Ls）、孕激素受體（progesterone receptor，PGR）、前列腺素 E2（prostaglandin E2，PGE2）及活性氧（reactive oxygen species，ROS）等多種分子表達(dá)，參與卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的重啟動(dòng)、卵丘細(xì)胞的擴(kuò)散、卵泡破裂、排卵和顆粒細(xì)胞黃體化等過程[3-4]，LH 或LHR 基因敲除使卵泡發(fā)育停滯在竇卵泡階段[5]，不發(fā)生排卵從而導(dǎo)致不孕[6]；高表達(dá)LH 或LHR 則導(dǎo)致顆粒細(xì)胞腫瘤的發(fā)生[7]。LH 對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞具有多方面的影響，因此全面了解LH 對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞的作用非常必要。

近年來，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)為卵巢相關(guān)研究提供了技術(shù)支持，如通過比較多囊卵巢綜合征（polycystic ovarian syndrome，PCOS）患者與非PCOS患者血清蛋白表達(dá)水平的差異，有助于潛在血清標(biāo)記物的發(fā)現(xiàn)[8]。本實(shí)驗(yàn)采用非標(biāo)記定量（labelfree quantification，LFQ）蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析標(biāo)本蛋白組分，對(duì)經(jīng)LH 干預(yù)的原代培養(yǎng)的卵巢顆粒細(xì)胞進(jìn)行蛋白表達(dá)譜的分析，以期發(fā)現(xiàn)LH 影響哪些顆粒細(xì)胞內(nèi)在的生物學(xué)過程和細(xì)胞信號(hào)通路，并對(duì)發(fā)現(xiàn)的部分差異表達(dá)蛋白進(jìn)行了驗(yàn)證，為后續(xù)的深入研究提供線索。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 21～25 d 的雌性 SD 大鼠（SPF級(jí)）由寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供［動(dòng)物合格證號(hào): SCXK（寧）2019-0001］。本實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局和中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)發(fā)布的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理審查指南》進(jìn)行。

1.1.2 主要試劑 LH 購(gòu)自 Sigma 公司；孕馬血清（pregnant mare serum gonadotropin，PMSG）購(gòu)自Prospec-Tany 公司；DMEM/F-12 培養(yǎng)基、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）和青鏈霉素均購(gòu)自BI公司；兔抗Pard3 多克隆抗體購(gòu)自Abcam 公司；兔抗Mark3 多克隆抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology（CST）公司；兔抗卵泡刺激素受體（follicle stimulating hormone receptor，F(xiàn)SHR）、Gstp1 及 Nqo1多克隆抗體及兔抗β-Actin 抗體均購(gòu)自武漢愛博泰克（Abclonal）生物科技有限公司。

1.1.3 分析軟件 利用生物信息學(xué)手段分析經(jīng)液相色譜-質(zhì)譜得到的蛋白質(zhì)，分析使用的工具及其網(wǎng)址見表1。

表1 生物信息學(xué)分析軟件

1.2 方法

1.2.1 大鼠原代卵巢顆粒細(xì)胞體外培養(yǎng)及鑒定 大鼠原代卵巢顆粒細(xì)胞提取借鑒Zhang 等[9]的提取方法，取3 周齡的SD 雌性大鼠腹腔注射PMSG（10 IU/只）36 h 后，用頸椎脫臼法處死，剖取雙側(cè)卵巢，采用機(jī)械分離方法釋放卵巢顆粒細(xì)胞，分離出的顆粒細(xì)胞按 7×105個(gè)/mL 接種到培養(yǎng)皿/瓶中置于37 ℃，5%CO2條件下，用含1%青鏈霉素和10%胎牛血清的DMEM/F-12 培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h 后以HE 染色觀察細(xì)胞形態(tài)，用FSHR 細(xì)胞免疫熒光染色鑒定所提取的顆粒細(xì)胞的純度，細(xì)胞純度=陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量/計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)×100%，純度到達(dá)90%以上進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 蛋白提取及重復(fù)樣品一致性檢驗(yàn) 將原代培養(yǎng)的顆粒細(xì)胞分為L(zhǎng)H 組和對(duì)照組，其中LH組培養(yǎng)48 h 后，在培養(yǎng)基中加入0.3 IU·mL-1LH，干預(yù)3 h[10]，對(duì)照組用無(wú)菌PBS 代替。每組樣品經(jīng)超聲裂解，離心后取上清，使用BCA 試劑盒進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定。采用Pearson 相關(guān)性和主成分分析（PCA）方法評(píng)估重復(fù)樣本一致性。

1.2.3 液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS）分析 提取出的蛋白酶解成肽段后經(jīng)超高效液相系統(tǒng)（NanoE－lute）分離、Capillary 離子源電離后，進(jìn) tims-TOF Pro質(zhì)譜，在質(zhì)荷比100～1700 范圍內(nèi)掃描二級(jí)質(zhì)譜。

1.2.4 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索 二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)與數(shù)據(jù)庫(kù)質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行匹配分析，得到蛋白鑒定原始結(jié)果。

1.2.5 生物信息學(xué)分析 用非標(biāo)定量計(jì)算方法計(jì)算蛋白在每個(gè)樣本中的非標(biāo)記定量強(qiáng)度（LFQ intensity），得到每個(gè)樣本的相對(duì)定量值。通過重復(fù)樣本的相對(duì)定量值得到每個(gè)樣本的平均值，將兩組各樣本之間平均值的比值作為最終的差異表達(dá)量?；谠紨?shù)據(jù)P 值和差異表達(dá)量篩選差異蛋白，利用GO 注釋按照細(xì)胞成分、分子功能或生理進(jìn)程對(duì)差異蛋白進(jìn)行分類。同時(shí)，使用KEGG 標(biāo)注工具KASS 對(duì)蛋白通路進(jìn)行注釋，KEGG mapper 將差異蛋白匹配到數(shù)據(jù)庫(kù)中相應(yīng)的KEGG 通路。

1.2.6 Western blot 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 各組蛋白濃度測(cè)定后，調(diào)整為同一濃度，經(jīng)SDS-PAGE 凝膠電泳初步分離后，轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上，封閉后目的蛋白與其對(duì)應(yīng)一抗（兔抗Pard3、兔抗Mark3、兔抗Gstp1、兔抗Nqo1 和兔抗β-Actin 稀釋濃度均為1∶1000）進(jìn)行孵育，4 ℃過夜。清洗后 PVDF 膜在室溫下孵育第二抗體（山羊抗兔1∶5000）1 h，洗膜后用AI600 成像儀曝光后用圖像分析軟件（Image J 1.8.0.112）進(jìn)行灰度值的分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3 次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

1.3.1 差異蛋白篩選 將各個(gè)樣本的相對(duì)定量值取log（2使數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布），采用t 檢驗(yàn)計(jì)算P值，當(dāng) P≤0.05 時(shí)，以表達(dá)變化倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）變化＞1.5 作為顯著上調(diào)的閾值，＜0.67 作為顯著下調(diào)的閾值。

1.3.2 生物信息學(xué)分析 利用Fisher 精確雙端檢驗(yàn)方法檢測(cè)差異表達(dá)蛋白對(duì)所有鑒定蛋白的富集，P≤0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此時(shí)該差異蛋白被認(rèn)為是顯著富集。

1.3.3 Western blot 結(jié)果分析 數(shù)據(jù)采用 SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，組間比較采用t 檢驗(yàn)，P≤0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 原代大鼠卵巢顆粒細(xì)胞鑒定及蛋白樣品一致性檢驗(yàn)

大鼠卵巢顆粒細(xì)胞體外培養(yǎng)24 h 后貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞呈星型或梭型（圖1A）；48 h 后，細(xì)胞呈單層生長(zhǎng)，偽足相互伸展（圖1B）；HE 染色顯示大鼠卵泡顆粒細(xì)胞細(xì)胞核清晰，細(xì)胞邊界分明、形態(tài)結(jié)構(gòu)完整（圖1C）。FHSR 免疫熒光染色后，鏡下可見FSHR 表達(dá)在細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，呈現(xiàn)綠色細(xì)小顆粒，本實(shí)驗(yàn)得到的細(xì)胞純度鑒定結(jié)果為（92.95±3.4）%，細(xì)胞純度達(dá)到后續(xù)實(shí)驗(yàn)的要求（圖2）。蛋白定量主成分分析結(jié)果顯示，重復(fù)樣本之間的聚集程度定量重復(fù)性良好，且兩組間差異較大（圖3A），樣本間 Pearson 相關(guān)系數(shù)接近1，表明樣本重復(fù)性良好（圖3B）。

圖1 大鼠卵泡顆粒細(xì)胞的原代培養(yǎng)及形態(tài)觀察

圖2 原代大鼠卵巢顆粒細(xì)胞FHSR 免疫熒光鑒定

圖3 重復(fù)實(shí)驗(yàn)樣本一致性檢驗(yàn)

2.2 差異表達(dá)蛋白的篩選

與對(duì)照組比較，LH 組差異表達(dá)蛋白57 個(gè)，上調(diào)蛋白25 個(gè)，包括核糖體蛋白、組蛋白以及 Pard3 等（表 2）；下調(diào)蛋白 32 個(gè)，包括 Crk、Gstp1 和 Nqo1 等蛋白（表 3）。

2.3 差異表達(dá)蛋白的GO 分析

57 個(gè)差異表達(dá)蛋白中54 個(gè)的GO 標(biāo)記可用，GO 二級(jí)注釋顯示，在分子功能（molecular function）層面，大部分差異蛋白具有結(jié)合活性與催化活性（圖4）。功能富集分析顯示，大部分差異蛋白在酶調(diào)節(jié)相關(guān)功能上有顯著的富集趨勢(shì)（圖5）。

2.4 KEGG 通路富集

分析差異表達(dá)蛋白在某一通路上是否過出現(xiàn)（over-presentation）即為差異表達(dá)蛋白的通路富集分析。本次實(shí)驗(yàn)部分差異蛋白富集的信號(hào)通路包括過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferator-activated receptors，PPAR）信號(hào)通路、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activatedprotein kinase，MAPK）信號(hào)通路、Hippo 信號(hào)通路、胰島素信號(hào)通路及癌癥相關(guān)信號(hào)通路等（圖6）。存在于這些信號(hào)通路上的差異表達(dá)蛋白的具體信息見表4。

表2 LH 組與對(duì)照組間表達(dá)上調(diào)差異蛋白（n=3）

表3 LH 組與對(duì)照組間表達(dá)下調(diào)差異蛋白（n=3）

續(xù)表

圖4 差異表達(dá)蛋白在GO 二級(jí)分類中統(tǒng)計(jì)分布圖

圖5 差異表達(dá)蛋白在GO 功能分類中富集分布?xì)馀輬D

2.5 Western blot 驗(yàn)證差異蛋白表達(dá)

以上蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果表明，與對(duì)照組比較，LH 組中 Pard3 和 Mark3 表達(dá)上調(diào)，Gstp1 和Nqo1 表達(dá)下調(diào)。Western blot 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖7。

圖6 部分差異表達(dá)蛋白富集的信號(hào)通路

表4 部分差異蛋白富集的信號(hào)通路具體信息

3 討論

卵泡發(fā)育過程中，LH 對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞的調(diào)控作用至關(guān)重要。在穩(wěn)定可靠的大鼠卵巢原代顆粒細(xì)胞培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，本研究通過蛋白質(zhì)組學(xué)方法發(fā)現(xiàn)，LH 干預(yù)顆粒細(xì)胞后差異表達(dá)蛋白共有57 個(gè)，其中25個(gè)表達(dá)上調(diào)，32 個(gè)表達(dá)下調(diào)。多個(gè)核糖體蛋白表達(dá)增高，說明LH 可促進(jìn)顆粒細(xì)胞蛋白質(zhì)合成功能。同時(shí)發(fā)現(xiàn)數(shù)個(gè)組蛋白和細(xì)胞增殖的相關(guān)分子表達(dá)上調(diào)，說明LH 可促進(jìn)DNA的復(fù)制和細(xì)胞增殖。表達(dá)下調(diào)的蛋白涉及能量代謝、離子轉(zhuǎn)運(yùn)、蛋白質(zhì)降解等過程，這一結(jié)果說明，LH 對(duì)顆粒細(xì)胞相關(guān)功能具有抑制作用。

GO 注釋及功能富集分析顯示，大部分差異蛋白的功能與細(xì)胞結(jié)合、酶催化能力和分子功能調(diào)節(jié)有關(guān)，說明LH 作用于顆粒細(xì)胞，通過相關(guān)分子功能的調(diào)節(jié)，可改變顆粒細(xì)胞間相互結(jié)合的方式以及激素的合成能力。KEGG 通路富集結(jié)果顯示，差異表達(dá)的蛋白質(zhì)參與多個(gè)細(xì)胞信號(hào)通路，包括胰島素信號(hào)通路、Hippo 信號(hào)通路和MAPK信號(hào)通路等。研究[11]表明，小鼠卵巢顆粒細(xì)胞產(chǎn)生胰島素抵抗能夠抑制MAPK 信號(hào)通路，下調(diào)細(xì)胞色素 P450c17α（cytochrome P450，family 17，subfamily A，polypeptide 1，CYP17A1）的表達(dá)，降低孕酮的產(chǎn)生。Hippo 信號(hào)通路在排卵過程中調(diào)控卵巢顆粒細(xì)胞增殖和分化[12]，這些信號(hào)通路在調(diào)節(jié)顆粒細(xì)胞功能和卵泡發(fā)育中發(fā)揮重要的作用。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)了數(shù)個(gè)在卵巢研究中較少涉及的信號(hào)通路，如 PPARs、Rap1 和 Chemokine 等信號(hào)通路，為深入研究LH 對(duì)顆粒細(xì)胞的作用提供了有價(jià)值的線索。

圖7 LH 對(duì)大鼠卵巢顆粒細(xì)胞Pard3、Mark3、Gstp1 以及Nqo1 蛋白表達(dá)影響

在本研究驗(yàn)證的4 個(gè)差異表達(dá)的蛋白中，Pard3 是一種細(xì)胞極性蛋白，在維持細(xì)胞間緊密連接的同時(shí)也控制著細(xì)胞的新陳代謝與增殖[13]。結(jié)合KEGG 結(jié)果，Pard3 參與 Hippo 信號(hào)通路的調(diào)節(jié)。研究[14]發(fā)現(xiàn)，Pard3 會(huì)導(dǎo)致Hippo 信號(hào)通路主要效應(yīng)分子TAZ 去磷酸化，觸發(fā)細(xì)胞接觸和細(xì)胞極性信號(hào)，從而促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)。這一結(jié)果提示，LH 可通過上調(diào)顆粒細(xì)胞Pard3 的表達(dá)，增強(qiáng)顆粒細(xì)胞極性；另一差異表達(dá)上調(diào)蛋白Mark3 也被證實(shí)與細(xì)胞極性相關(guān)，并參與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)和Ras 信號(hào)傳導(dǎo)[15-16]。有研究[17]發(fā)現(xiàn)，Mark3 通過抑制Mst1/2 活性來抑制 Hippo 信號(hào)通路，提示LH可通過上調(diào)Mark3 的表達(dá)抑制Hippo 信號(hào)通路繼而產(chǎn)生促卵泡生長(zhǎng)效應(yīng)。下調(diào)蛋白Gstp1 和Nqo1 被認(rèn)為是抗氧化標(biāo)記物，Gstp1 和Nqo1 可減少活性氧的形成，從而抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)[18-19]。過高的氧化應(yīng)激反應(yīng)會(huì)引起卵巢顆粒細(xì)胞損傷[20]，進(jìn)而誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞凋亡導(dǎo)致卵泡閉鎖[21]。本研究驗(yàn)證的4 個(gè)差異表達(dá)蛋白，為進(jìn)一步從顆粒細(xì)胞極性、增殖和氧化應(yīng)激角度深入研究LH的作用提供了基礎(chǔ)。

綜上，LH 作用于顆粒細(xì)胞，可影響細(xì)胞極性、蛋白合成及能量代謝等多個(gè)相關(guān)蛋白表達(dá)，涉及MAPK、Hippo 及胰島素等多條信號(hào)通路，提示LH 通過影響顆粒細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、激素合成能力和抗氧化能力等對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞功能發(fā)揮重要作用。