棕櫚酸聯合TGF-β1 誘導脂肪性肝纖維化細胞模型

梁涵子 ， 李雨涵 ， 李家瑞 ， 李建寧 ， 宋 輝 ， 楊 怡

（1.寧夏醫科大學基礎醫學院生物化學與分子生物學系，銀川 750004； 2.寧夏醫科大學內分泌學研究所，銀川 750004； 3.寧夏醫科大學基礎醫學院細胞生物學與遺傳學系，銀川 750004）

肝纖維化是指因各種慢性肝損傷引起的肝臟內彌漫性細胞外基質（extracellular matrix，ECM）過度沉積，導致肝臟結構和肝功能異常輕度改變的病理過程。目前研究[1]認為，肝纖維化的發病機制主要是在各種損肝因素作用下，組織發生修復時ECM 合成與降解失衡。近年來，隨著生活方式的改變，肥胖患者比例大幅度上升，進而導致代謝性肝病發病率迅速增加[2-3]，脂肪性肝病進一步發展而來的脂肪性肝炎、肝纖維化等已成為肝癌進一步發展、惡化的重要環節[4]。而肝纖維化作為一種可逆性疾病，給予病因消除并經適當的治療，其纖維化是可以逐漸被吸收的[5]。由于目前對于脂肪性肝纖維化的發病機制缺乏明確的認識，從而限制了治療方式的選擇。因此，探究脂肪性肝纖維化的發病機制能夠為臨床脂肪性肝纖維化的治療提供新的理論基礎。

目前認為，肝星狀細胞仍是各種臨床和實驗性肝纖維化模型中肌成纖維細胞（MFs）的主要來源[6]。在肝纖維化疾病進展中，HSCs 發揮著重要作用，HSCs 的活化、增殖及分化是纖維化發生的中心環節[7]。因此研究多集中于以肝星狀為靶細胞，利用轉化生長因子-β1（TGF-β1）建立肝纖維化模型，從而研究肝纖維化的作用機制[8-9]。但是這種方式并不能完全模擬脂肪性纖維化，為了探究脂肪性肝纖維化的發病機制，本研究選用棕櫚酸（palmitic acid，PA）及 TGF-β1 作為誘導手段，分別給予人肝星狀細胞（LX-2）及人肝癌細胞（HepG2）不同濃度的 PA 及 TGF-β1 誘導，構建脂肪性肝纖維化細胞模型，以期為后續探究脂肪性肝纖維化疾病的分子機制及治療手段提供模型基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

LX-2 細胞購自上海中喬新舟細胞庫；HepG2細胞購自北京腫瘤細胞庫；胎牛血清購自美國Gibco 公司（10099-141）；DMEM 高糖培養基購自Hyclone 公司（SH30022）；PA（P5585）和油紅 O染液（O1391）購自美國 Sigma 公司；TGF-β1 購自PEPROTECH 公司；cDNA 反轉錄試劑盒及qRTPCR 試劑盒購自 TaKaRa 公司；α-SMA（#19245）與 CollagenⅠ（#39952）抗體購自 Cell Signaling Technology 公司，GAPDH 抗體（10494-1-AP）購自PEPROTECH 公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 LX-2 細胞、HepG2 細胞以適當密度接種于培養瓶中，使用含有10%胎牛血清，100 U·mL-1青霉素及 100 U·mL-1鏈霉素的 DMEM培養基，于37 ℃，5% CO2培養箱中進行培養。

1.2.2 主要試劑配方 ①重組人 TGF-β1：將TGF-β1 粉末用10 mmol·L-（1pH 3.0）的檸檬酸鈉試劑溶解至 0.5 mg·mL-1，再使用 0.1%BSA 溶液稀釋至終濃度為10 ng·mL-1的儲備液，分裝后于-20 ℃保存。使用時，通過DMEM 完全培養液稀釋成為 2、5、10 ng·mL-1的終濃度。②PA 工作液：0.25 g PA，加入1 mL 無水乙醇在熱水浴中助溶，用 500 mmol·L-1NaOH 調節 pH 至 7.4，用0.22 μmo·lL-1微孔濾膜除菌后分裝，-20 ℃保存。使用時，通過DMEM 完全培養液稀釋成為100、200 及 400 μmol·L-1的終濃度。

1.2.3 實驗分組 選用 100、200、400 μmol·L-1PA分別誘導LX-2 細胞及HepG2 細胞，選用 2、5、10 ng·mL-1TGF-β1 分別誘導 LX-2 細胞及 HepG2細胞，兩種誘導方式均誘導24 h。

1.2.4 MTT 實驗檢測細胞存活率 將LX-2 細胞、HepG2 細胞分別接種于96 孔板，密度為1×104/孔，分別給予不同濃度PA 及TGF-β1 誘導24 h，隨后利用MTT 檢測試劑盒檢測細胞存活率。計算細胞存活率，細胞存活率=（實驗組A 值-空白調零A 值）（/對照組A 值-空白調零A 值）×100%。

1.2.5 油紅O 染色法檢測脂滴含量 分別接種兩種細胞于6 孔板內，密度為2×105/孔，分別給予不同濃度PA 及TGF-β1 誘導24 h 后，使用預冷的PBS清洗3 次，4%多聚甲醛固定細胞10 min，每孔滴加油紅 O 染液 1 mL，室溫反應 10～15 min，65%的異丙醇快速脫色，使用蘇木素染核30 s 后用蒸餾水沖洗2~3 次，于倒置顯微鏡下進行觀察。

1.2.6 qRT-PCR 實驗檢測 α-SMA、CollagenⅠ的mRNA 表達水平 PA 及 TGF-β1 誘導兩種細胞后，采用Trizol 法提取細胞內RNA 并將其逆轉錄為cDNA，通過qRT-PCR 實驗檢測各組α-SMA 和CollagenⅠ的mRNA 表達水平。引物序列分別為β-Acting：Forward-CATGTACGTTGCTATCCAGG，Reverse-CTCCTTAATGTCACGCACGAT；α-SMA：Forward-CAGGGCTGTTTTCCCATCCAT，Reverse-G CCATGTTCTATCGGGTACTT；CollagenⅠ：Forward-CATGTACGTTGCTATCCAGGC，Reverse-CTCCTT AATGTCACGCACGAT。

1.2.7 Western blot 實驗檢測 α-SMA、Collagen Ⅰ的蛋白表達水平 分別收集經PA 及TGF-β1 誘導后的 LX-2 細胞和 HepG2 細胞，蛋白制樣后，利用10% SDS-PAGE 垂直電泳進行蛋白分離，隨后檢測α-SMA 及CollagenⅠ的蛋白表達水平，通過Image J 軟件分析條帶的灰度值，以目標蛋白灰度值與內參GAPDH 灰度值的比值評價蛋白的相對表達量。

1.3 統計學方法

結果采用SPSS 22.0 統計軟件進行分析，計量資料以均數±標準差（）表示，組間兩兩比較采用Dunnett-t 檢驗，P≤0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TGF-β1 誘導較PA 誘導細胞存活率更高

MTT 結果顯示，100、200、400 μmol·L-1PA分別誘導 HepG2 與 LX-2 細胞 24 h 后，細胞存活率出現不同程度降低（P 均＜0.01）；TGF-β1分別誘導兩組細胞24 h 后，細胞存活率在5、10 ng·mL-1TGF-β1 誘導下出現不同程度降低（P均＜0.05），見圖 1、圖 2。

2.2 PA 誘導組細胞內脂滴增多

油紅O 染色結果顯示，與對照組相比，不同濃度 PA 誘導 24 h 后，HepG2、LX-2 細胞均隨PA 濃度的增大，脂滴形成增多，具有明顯的濃度依賴性。不同濃度TGF-β1 誘導24 h 后，HepG2組細胞內未見明顯脂滴；2、5 ng·mL-1TGF-β1 誘導后 LX-2 細胞內可見少量脂滴，10 ng·mL-1TGF-β1 誘導后可見LX-2 細胞內脂滴明顯增多，見圖 3、圖 4。

圖1 MTT 分析PA 對HepG2 細胞與LX-2 細胞存活率的影響

圖2 MTT 分析TGF-β1 對HepG2 細胞與LX-2 細胞存活率的影響

圖3 油紅O 染色法顯示不同濃度PA 對HepG2、LX-2 細胞內脂滴形成的誘導效應（×400）

圖4 油紅O 染色法顯示不同濃度TGF-β1 對HepG2、LX-2 細胞內脂滴形成的誘導效應（×400）

2.3 PA 與 TGF-β1 誘導兩種細胞內 α-SMA、CollagenⅠ的mRNA 表達增加

qRT-PCR 結果顯示，200、400 μmol·L-1PA組誘導 HepG2 細胞內α-SMA、CollagenⅠmRNA相對表達水平均上調（P 均＜0.05）；200 μmol·L-1PA 誘導LX-2 細胞內CollagenⅠ mRNA 相對表達水平上調（P＜0.01），400 μmol·L-1PA 誘導LX-2細胞內α-SMA、CollagenⅠmRNA 相對表達水平均上調（P 均＜0.01）；10 ng·mL-1TGF-β1 誘導HepG2 組細胞內α-SMA、CollagenⅠmRNA 相對表達水平均上調（P 均＜0.05）；5、10 ng·mL-1TGF-β1 誘導LX-2 細胞內 α-SMA、CollagenⅠmRNA 相對表達水平均上調（P 均＜0.01），見圖 5、圖 6。

圖5 qRT-PCR 檢測不同濃度PA 誘導24 h 后α-SMA、CollagenⅠ mRNA 的相對表達水平

圖6 qRT-PCR 檢測不同濃度TGF-β1 濃度誘導后兩組細胞內α-SMA、CollagenⅠ mRNA 的相對表達水平

2.4 PA 與 TGF-β1 誘導兩種細胞內 α-SMA、CollagenⅠ蛋白表達增加

Western blot 結果顯示，200、400 μmol·L-1PA組誘導HepG2 細胞內α-SMA 及CollagenⅠ的蛋白相對表達水平均升高（P 均＜0.05）；400 μmol·L-1PA 誘導LX-2 細胞內CollagenⅠ蛋白相對表達水平升高（P＜0.01）；2、5、10 ng·mL-1TGF-β1 組誘導HepG2 細胞內α-SMA 蛋白相對表達水平均升高（P 均＜0.05），10 ng·mL-1TGF-β1 組誘導HepG2 細胞內CollagenⅠ蛋白相對表達水平升高（P＜0.05）；2 ng·mL-1TGF-β1 組誘導 LX-2 細胞內CollagenⅠ蛋白相對表達水平升高（P＜0.01），5、10 ng·mL-1TGF-β1 組誘導 LX-2 內 α-SMA及CollagenⅠ的蛋白相對表達水平均升高（P 均＜0.01），見圖 7～圖 10。

圖7 Western blot 檢測不同濃度PA 誘導HepG2 細胞24 h 后α-SMA 及Collagen Ⅰ的蛋白相對表達水平

圖8 Western blot 實驗檢測不同濃度PA 誘導LX-2 細胞24 h 后α-SMA 及Collagen Ⅰ的蛋白相對表達水平

圖9 Western blot 檢測不同濃度TGF-β1 誘導HepG2 細胞24 h 后α-SMA 及CollagenⅠ的蛋白相對表達水平

圖10 Western blot 檢測不同濃度TGF-β1 誘導LX-2 細胞24 h 后α-SMA 及Collagen Ⅰ的蛋白相對表達水平

3 討論

目前，非酒精性脂肪肝?。∟AFLD）、非酒精性脂肪性肝炎（NASH）的患病率在全球范圍內呈上升趨勢，據統計，全球24%左右的人口患有NAFLD[10]，我國成年人中NAFLD 的患病率高達15%[11]，而脂肪肝纖維化是NASH 進展為終末期肝病的重要階段，晚期肝纖維化最終可導致肝硬化和肝功能衰竭，然而目前除了肝移植外沒有其他更有效的治療策略[12]。因此，預防肝纖維化是阻止該病進展和預后的關鍵。

肝纖維化作為一種復雜的肝臟疾病，其具體發病機制尚未完全闡明，一般認為遺傳因素、環境因素、脂質代謝異常、氧化應激和脂質過氧化損傷、免疫反應損害等可能參與了其發病。脂質代謝紊亂作為重要的致病因素，對于NAFLD、NASH以及肝細胞癌的進展發揮著重要的作用[13]。肝纖維化作為肝臟疾病惡化的關鍵階段，其發生、發展中脂質代謝的變化目前尚不清楚，進而限制了由NAFLD、NASH 進展而來的肝纖維化治療方式的選擇。為了更好地研究脂肪性肝纖維發生、發展的分子機制，建立良好的研究模型非常關鍵。目前對肝纖維化模型的研究多集中于利用能夠調節細胞生長和分化的因子TGF-β1 活化肝星狀細胞，從而促進膠原基因表達，最終誘導肝纖維化細胞模型[14-15]。PA 是我們日常飲食中最充足的飽和脂肪酸，可通過氧化應激及改變線粒體膜電位等機制引起脂質沉積進而導致脂毒性[16-17]，經常用于NAFLD 細胞模型的制備。PA 處理過的肝細胞能夠增加外泌體的產生，并將肝纖維化誘導信號轉導至肝星狀細胞[18]。因此，為了探索脂肪性肝纖維化的最適細胞模型，本文選用PA 與TGF-β1 兩種誘導方式進行細胞處理，旨在模擬脂肪性肝纖維化，從而探究脂肪性肝纖維化發展的分子機制。

基于以上實驗目的，本文進行了PA 及TGF-β1 實驗作用濃度的摸索。首先通過MTT 實驗篩選對細胞毒性最小的作用濃度，結果顯示不同濃度的PA 及TGF-β1 誘導后，兩組細胞的存活率出現不同程度的下降，100 μmol·L-1PA，2、5、10 ng·mL-1TGF-β1 誘導組對 HepG2 細胞、LX-2 細胞的存活率影響較小。隨后通過油紅O 染色檢測細胞內脂滴含量的變化，篩選使得肝細胞發生脂肪性變化的作用濃度，結果顯示 200、400 μmol·L-1PA誘導后兩組細胞內均見明顯脂滴，10 ng·mL-1TGF-β1 誘導LX-2 細胞后細胞內可見明顯脂滴。此外，通過檢測纖維化標志性因子α-SMA 及CollageⅠ的mRNA 與蛋白表達水平，結果顯示400 μmol·L-1PA，5、10 ng·mL-1TGF-β1 誘導HepG2 與LX-2 后細胞內纖維化標志因子表達水平增高。隨著濃度的增加，PA 誘導后細胞存活率較低。相比較而言，TGF-β1 是一種更為安全的誘導手段。綜合以上實驗結果，200 μmol·L-1PA誘導 HepG2 細胞、10 ng·mL-1TGF-β1 誘導 LX-2 細胞與HepG2 細胞24 h 是成功構建脂肪性肝纖維化細胞模型的適宜條件。