紙片協同試驗用于腸桿菌科細菌碳青霉烯酶檢測的價值

張逸 朱錢迎 張青 陳霜 夏菲 戴其鋒 錢定良

碳青霉烯酶是指可以水解碳青霉烯類抗菌藥物如美羅培南（MEM）和亞胺培南的一類β-內酰氨酶，它包括Ambler分子結構分類的A、B、D三類酶。其中A類酶、D類酶為絲氨酸酶，B類酶為金屬酶，A類酶的活性可以被硼酸類化合物所抑制；B類酶分布廣泛，活性可被乙二胺四乙酸鈉（EDTA）所抑制；D類酶主要為OXA型碳青霉烯酶[1]，其活性不被酶抑制劑和EDTA抑制。近年來，耐碳青霉烯類腸桿菌科細菌（carbapenem-resistant Enterobacteriaceae，CRE）遍布全球，由于逐年升高的檢出率和高歸因死亡率，已構成了重大的公共衛生威脅[2]。CRE對碳青霉烯類藥物的耐藥機制分為兩類：一為產碳青霉烯酶，二為一些非產酶的機制，產碳青霉烯酶是CRE最常見的耐藥機制，且已有文獻證實產碳青霉烯酶腸桿菌科細菌（carbapenemase-producing Enterobacteriaceae，CPE）比非產碳霉烯酶腸桿菌科細菌毒性大、預后差、易傳播且病死率高[3]，因此，臨床需要一種快速、準確的方法來檢測碳青霉烯酶并區分類型而指導臨床用藥。本研究參考2017年歐洲藥敏試驗委員會（EUCAST）推薦的碳青霉烯酶表型檢測試驗，以PCR耐藥基因序列分析為金標準，評估紙片協同試驗用于CPE檢測的價值。

1 材料和方法

1.1 菌株來源 收集2015年1月至2018年12月瑞安市人民醫院從各種臨床標本中分離非重復送檢的可疑CPE共75株，其中肺炎克雷伯菌51株，大腸埃希菌17株，陰溝腸桿菌3株，霍氏腸桿菌1株，產氣腸桿菌1株，產酸克雷伯菌1株，布氏檸檬酸桿菌1株；來自血液24株（32.0%），尿液20株（26.7%），痰液12株（16.0%），其他無菌體液胸腹水、膽汁、分泌物等19株（25.3%）。來自男性患者54株（占72.0%），女性患者21株（占28.0%），患者平均年齡64歲。同時選取非CPE 10株作為陰性對照組。

1.2 主要試劑與儀器 Vitek 2 Compact全自動微生物鑒定藥敏儀、Vitek-MS及其配套板卡購自法國生物梅里埃公司；PCR擴增儀、凝膠成像儀和電泳儀購自美國Bio-Rad公司；PCR擴增試劑盒購自上海生工生物有限公司；2×Taq Master Mix及DNA marker購自上海生工生物有限公司；50×TAE、瓊脂糖、GoldViewTM核酸染料購自上海賽百威基因技術有限公司；苯基硼酸（PBA）購自美國Sigma公司；氯唑西林購自上海撫生實業有限公司；EDTA購自上海生工生物有限公司；MEM紙片（10 μg）、哌拉西林-他唑巴坦（TZP）紙片（110 μg）購自英國Oxid公司；替莫西林紙片（30 μg）購自意大利Liofilchem公司；哥倫比亞血瓊脂平板、M-H培養基購自廣州迪景微生物科技有限公司；引物由上海生工生物有限公司合成。

1.3 方法

1.3.1 菌株篩選、鑒定及藥敏 將收集到的菌株進行MEM、TZP紙片擴散法，藥敏結果參照CLSI2017年標準。根據EUCAST指南，MEM抑菌圈直徑＜28 mm（除外25～27 mm且TZP敏感或中介）為可疑CPE（流程見圖1）。所有篩選出的CPE菌株均采用法國梅里埃公司ViteK MS質譜儀進行菌株鑒定并采用Vitek2 Compact微生物分析儀進行藥敏試驗。藥敏試驗所用質控菌株為大腸埃希菌ATCC25922，由中國疾病預防控制中心提供。

圖1 CPE檢測流程圖（1：沒有協同，也可能是菌株體內存在幾種碳青霉烯酶，此時需要分子方法；2：MBL為B類金屬酶；3：替莫西林高水平耐藥是MIC＞128 mg/L，或抑菌圈≤10 mm。這是OXA-48的表型標志；4：R代表耐藥；5：S代表敏感）

1.3.2 碳青霉烯酶耐藥基因的檢測 35℃培養24 h復蘇待測菌株，用煮沸法提取細菌基因組DNA待用。采用PCR擴增法擴增碳青霉烯酶基因（blaKPC、blaVIM、blaIMP、blaNDM-1、blaOXA-48）、ESBL 基因 （blaCTXM-1、blaCTX-M-9）、AmpC 酶基因（blaDHA、blaEBC）。所用引物序列及退火溫度見表1。PCR擴增產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統成像并記錄。

表1 耐藥基因PCR引物

1.3.3 碳青霉烯酶表型確認試驗

1.3.3.1 抑制劑紙片的制備 用打孔器制作直徑6 mm的圓形濾紙，分裝、高壓滅菌備用。取PBA 60 mg溶解于1.5 ml的二甲基亞砜中，加入1.5 ml蒸餾水，配成20 mg/ml的溶液[4]；取氯唑西林75 mg溶解于1 ml蒸餾水中，配成75 mg/ml的溶液[5]；稱取3.72 g EDTA-Na2加入200 ml的干凈燒杯中，加入75 ml蒸餾水，邊攪拌邊用氫氧化鈉調pH至8.0，定容至1 000 ml，配成濃度為0.1 mmol/L的溶液[6]，配置完成后，均高壓滅菌后備用。將20 mg/ml PBA、75 mg/ml氯唑西林、0.1 mmol/L EDTA各取10 μl分別滴加于空白紙片制成抑制劑紙片，干燥30、60 min內使用。

1.3.3.2 紙片協同試驗 根據CLSI指南進行紙片藥敏試驗，挑取血平皿上35℃培養18～24 h的待測菌落，用無菌生理鹽水制備成0.5麥氏濁度的菌懸液；將菌懸液均勻涂布于MH瓊脂平皿上，靜置10 min待干燥；每個接種受試菌的MH平板平均分成兩部分，其中一部分貼上MEM紙片，在MEM紙片左右兩側貼上PBA、氯唑西林紙片，與MEM紙片距離均為1～2 cm，另一部分MEM紙片周邊貼EDTA紙片，與MEM紙片距離為1～2 cm；當結果顯示PBA和EDTA協同試驗均無協同作用時，再進行替莫西林紙片擴散法。MEM抑菌圈靠近抑制劑紙片一側明顯擴大者為陽性，協同試驗的結果判讀標準見表2。

表2 PBA、氯唑西林、EDTA協同試驗和替莫西林紙片擴散結果判定

1.4 統計學處理 采用SPSS 22.0統計軟件。以PCR結果為金標準，計算PBA協同試驗、EDTA協同試驗檢測碳青霉烯酶的靈敏度、特異度、準確度、陽性預測值和陰性預測值，分別與基因檢測結果進行Kappa一致性檢驗分析：Kappa值＞0.75，說明兩種方法診斷結果一致性較好；Kappa值在0.4～0.75，說明一致性一般；Kappa值＜0.4，說明一致性較差。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 菌株藥敏試驗結果 可疑CPE對大部分β-內酰胺類藥物呈高度耐藥，耐藥率接近100.0%，對阿米卡星的耐藥率為48.0%。不同菌屬中CPE菌株對不同抗菌藥物的耐藥率見表3。10株非CPE中大腸埃希菌8株，陰溝腸肝菌2株，對亞胺培南均敏感，對厄他培南的耐藥率為30.0%。

表3 75株可疑CPE對抗菌藥物的耐藥率（%）

2.2 耐藥基因的檢測結果 75株可疑CPE經PCR擴增，共檢出66株產碳青霉烯酶（其中產KPC 46株，產NDM-1 18株，產IMP 1株，產VIM 1株，無產OXA-48基因型），6株產超廣譜 β-內酰胺酶（ESBLs）（CTX-M-1 1株，CTX-M-1+CTX-M-1 2株，CTX-M-9 3株），3株未檢測出基因。部分電泳結果見圖2-3；10株非CPE均未檢出碳青霉烯酶耐藥基因。

圖2 NDM-1和KPC基因部分電泳圖（M為分子量標準，7、14分別為NDM-1和KPC基因的陽性對照，6、13分別為NDM-1和KPC基因的陰性對照）

圖3 VIM和IMP基因部分電泳圖（M為分子量標準，7、14分別為VIM和IMP基因的陽性對照，6、13分別為VIM和IMP基因的陰性對照）

2.3 紙片協同試驗檢測結果 依據上述方法中介紹的判定依據，紙片協同試驗部分結果見圖4，性能評價見表4～6。PBA協同試驗陽性菌株有48株，氯唑西林協同均陰性，結合PCR的結果有1株陰溝腸桿菌和1株大腸埃希菌未檢測出耐藥基因，結果顯示假陽性。對KPC碳青霉烯酶的檢測，PBA協同試驗靈敏度為100.0%（46/46），特異度為93.1%（27/29），準確度為97.3%（73/75），陽性預測值為 95.8%（46/48），陰性預測值為100.0%（27/27），Kappa值為 0.943（P＜0.001），提示與基因檢測結果一致性高。對于B類碳青霉烯酶的檢測，EDTA協同試驗陽性菌株有20株，PCR結果也為20株，靈敏度和特異度均為100.0%，準確度為100.0%，陽性預測值為100.0%，陰性預測值為100.0%，Kappa值為1（P＜0.001），與基因檢測結果一致性較好。10株非CPE中，紙片協同試驗均陰性。

表4 PBA協同試驗檢測腸桿菌科KPC型碳青霉烯酶（株）

表5 EDTA協同試驗檢測腸肝菌科MBL（株）

表6 紙片協同試驗用于CPE檢測的整體性能評價

圖4 紙片協同試驗表型結果（a：產NDM-1型大腸埃希菌；b：產KPC型肺炎克雷伯菌；c：產CTX-M型大腸埃希菌）

3 討論

自1993年首次在陰溝腸桿菌科細菌中發現由染色體編碼的NmcA碳青霉烯酶以來，CRE在世界范圍內廣泛出現，其主要機制是產碳青霉烯酶，這種酶現多由質粒介導，容易在細菌間傳播[7]。CPE的流行傳播給臨床治療和感染控制帶來極大的挑戰，故快速準確檢測CPE對有效控制感染、預防產酶菌株傳播有重要的價值。基于PCR檢測方法成本高，操作復雜及需要專業的儀器和技術人員，更重要的是，該法無法檢測出新的碳青霉烯酶基因，故臨床應用受到限制。本研究采用碳青霉烯酶表型檢測方法，該法操作簡便、成本低且能夠有效地區分不同類型的碳青霉烯酶，可以更好地指導臨床對抗菌藥物的選擇，對臨床治療和感染控制具有重大意義。

PBA和氨基苯硼酸（APBA）協同試驗均能檢測出產A類碳青霉烯酶腸桿菌科細菌，但有研究表明PBA對產KPC等A類酶的檢測性能要優于APBA[8]。本研究使用200 μg PBA進行PBA協同試驗，可檢測出所有產KPC腸肝菌科細菌，靈敏度達100.0%，有2株分離菌株出現假陽性結果，可能與試驗只擴增了KPC基因，并未對其他A類碳青霉烯酶如GES、IMI、SIM等進行研究有關。此外PBA協同試驗在產AmpC合并孔蛋白缺失菌株中也能出現陽性，有研究表明，使用氯唑西林（AmpC酶抑制劑）可區分兩者[7-9]。

對于產MBL（即B類金屬酶）腸肝菌科細菌，EDTA協同試驗靈敏度和特異度均達到100.0%，這與Teethaisong等[10]研究結果一致。Giske等[11]研究發現吡啶二羧酸對產MBL肺炎克雷伯菌的檢測特異度要高于EDTA，靈敏度相似，本研究中EDTA協同試驗特異度達100.0%，但本研究的陽性例數不多，在今后還將繼續研究。此外，有研究報道紙片協同試驗對于檢測同時存在KPC和MBL的菌株，結果會出現假陰性，只有在紙片上同時滴加PBA和EDTA時才出現陽性結果[12]，但由于本研究收集的菌株均為單個產KPC或MBL，所以對該結論還有待進一步研究。

有研究報道替莫西林抑菌圈直徑≤10 mm且MEM與EDTA或PBA無協同作用可檢測出所有產OXA-48腸桿菌科細菌，靈敏度和特異度均達100.0%[10，13]。本研究所收集的75株腸桿菌科細菌均未檢測到OXA-48，主要是因為這類碳青霉烯酶在國內非常罕見，迄今為止，中國所報道OXA陽性的CRE不到50株[14-15]。故無法對該方法進行評價。

協同試驗與目前微生物實驗室常用的改良Hodge試驗相比，特異度更高，研究指出改良Hodge試驗對高產Ampc酶或CTX-M類型ESBL的腸肝菌科細菌容易產生假陽性[15-17]；與Carba NP、mCIM及MALDI-TOF質譜分析法相比，靈敏度和特異度相差不大。但目前沒有可用的表型檢測方法被證明是完全具有靈敏度和特異度[18]，要根據每個實驗室的流行病學情況和可用資源選擇合適的方法。

綜上所述，PBA和EDTA協同試驗對于檢測產A類和B類碳青霉烯酶腸桿菌科細菌來說是一種方便、經濟、準確的表型確認試驗，并且操作簡便、成本低，適合在臨床微生物學實驗室、醫院感染管理科及疾病預防控制中心等單位普及應用。