秋季東北地區奶牛舍內環境中微生物氣溶膠分布規律比較研究

李 晏，孫宏起，劉 明，李佃場，郭振東*，劉靜波*

（1.西南科技大學生命科學與工程學院，四川綿陽 621010；2.軍事醫學科學院軍事獸醫研究所，吉林長春 130122；3.中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所，動物營養學國家重點實驗室，北京 100193；4.青島市即墨區畜牧業發展服務中心，山東青島 266200）

當前我國集約化的高密度畜禽飼養模式使得畜禽舍內氣溶膠濃度升高，環境中病原微生物濃度增加，給相關從業人員和動物本身帶來健康風險[1-3]。陳冠希等[4]研究表明，豬舍空氣顆粒物處理的小鼠肺部發生了明顯的病理性損傷和嚴重的炎癥反應。劉傳德[5]研究發現，微生物氣溶膠的粒徑越小越易進入動物的呼吸系統從而引發疾病。前人研究表明奶牛舍內氣溶膠濃度隨季節變化而變化，且早晚存在一定的差異性[6]。奶牛舍內微生物氣溶膠中總細菌濃度白天均高于夜晚，春季均高于夏季[7-8]。Wolinsky[9]研究表明，雞舍內氣溶膠中氣載需氧菌含量增高能夠影響動物免疫力，但奶牛舍內氣載需氧菌含量增高對于奶牛免疫力的具體影響目前尚不明確。在空間上，由于通風結構及重力的影響，同一養殖場內不同位置、不同高度的氣溶膠濃度和微生物分布組成也可能存在一定的差異[10]。本研究通過在吉林地區一家奶牛養殖場奶牛舍內不同位置、不同高度開展秋季連續4 個月的監測采樣，比較秋季奶牛舍內氣溶膠顆粒濃度在同一位置不同高度的差異，分析秋季奶牛舍內氣載需氧菌含量在同一位置不同時間的差異及分布規律，為進一步評估奶牛飼養環境、減少疾病傳播提供數據參考和理論依據。

1 材料與方法

1.1 監測奶牛舍基本情況 試驗于吉林長春某奶牛養殖場選擇1 個成年奶牛舍，奶牛舍內選取5 個采樣點（圖1）。奶牛舍為半封閉拴系式，舍內基本無采暖措施，僅靠夜晚封閉牛舍保溫，采用雙坡屋頂結構，舍內采光為自然采光和人工照明相結合的方式，斜向風扇通風與自然通風相結合，舍長80 m、寬10 m、高5 m（圖2）。舍內飼養成年奶牛90 頭，奶牛自由采食，每天擠奶3 次，3 次投料、2 次整理臥床，清糞方式為鏟車清糞，每日1 次。在11 月和12 月，為實現保暖而在奶牛舍內鋪設墊料，砂土作為臥床主要墊料。

圖1 奶牛養殖場內采樣點分布圖

圖2 奶牛養殖場截面圖

1.2 奶牛舍空氣樣品采集方法 于2016 年9—12 月在奶牛舍內5 個采樣點分別距地面 0.5、1.0、1.5 m 處采用激光粒子計數器（9306-V2 型號；提賽環科儀器貿易有限公司）監測氣溶膠顆粒物粒徑大小和濃度，截取粒徑范圍分別為0.3～0.5、0.5～1.0、1.0～3.0、3.0～5.0、5.0～10 μm和＞10 μm；采用安德森6 級微生物氣溶膠采樣器采集空氣樣品進行需氧菌含量測定，截取粒徑范圍如表1 所示。

表1 安德森6 級采樣器技術參數

1.3 氣溶膠顆粒物濃度測定 采用激光粒子計數器監測奶牛舍內不同采樣點及不同高度（0.5、1.0、1.5 m）處的氣溶膠粒徑分布及濃度，每個高度重復5 次，單次20 s，每次使用前將數據歸零重置，測得0.94 L 空氣中的氣溶膠顆粒物粒徑大小及數量。同時記錄奶牛舍環境衛生情況，使用TSI 溫濕度風速儀9545-A 測量采樣時的溫度、濕度、風速。

1.4 氣溶膠中需氧菌數量測定 在2016 年9—12 月，使用哥倫比亞血瓊脂培養基為安德森6 級采樣器（美國Tisch Environmental Inc 有限公司）中的采樣介質，于每月10 號在奶牛舍內采樣點距離地面1.0 m 處進行樣品采集工作，確保周遭無工作人員活動，每個點重復采樣3 次，時間為3 min，空氣流量為28.3 L/min。將已吸附氣溶膠樣品的培養基，6 個一組做好標記。將所有培養基統一收集起來，放入恒溫培養箱中倒置培養1～2 d后，統計培養基上的菌落數量。通過ANDERSON 校正表進行校正從而計算出氣載需氧菌菌落數量的校正總和。根據采樣器的采樣流量（28.3 L/min）和采樣時間計算出奶牛舍內環境中氣載需氧菌濃度。

1.5 統計分析 奶牛舍內環境中的氣載需氧菌濃度按公式計算：

其中，C表示氣載需氧菌濃度（CFU/m3）；t表示采樣時間（min）；F表示采樣器的采樣流量（為28.3 L/min）；N1～N6為安德森六級采樣器上每層校正后的氣載需氧菌菌落數量。

當微生物氣溶膠粒子粒徑小于5.0 μm 時，易進入人體呼吸道，可計算吸入的氣載需氧菌濃度的百分比，計算公式：

其中，P表示可吸入氣載需氧菌濃度的百分比；N1～N6表示安德森六級采樣器上每層校正后的氣載需氧菌菌落數量。

使用SAS 軟件和Graphpad Prism 5.0 對數據進行統計學分析并作圖，以P＜0.05 作為差異顯著性判斷標準。

2 結果與分析

2.1 秋季奶牛舍內氣溶膠顆粒物濃度分布規律 舍內環境狀況如表2 所示。從圖3 可以看出，秋季奶牛舍內氣溶膠顆粒物濃度與各采樣點距離地面高度（＜1.5 m）無直接關系。9 月奶牛舍內點5 和點2 在距離地面0.5 m處的氣溶膠顆粒物濃度為最高和最低，每升空氣中的氣溶膠粒子數量分別為1.96×105個和1.410 27×105個；10 月奶牛舍內點2 和點5 在距離地面1.0 m 處氣溶膠顆粒物濃度最高和最低，每升空氣中的氣溶膠粒子數量分別為1.31×105個和1.00×105個；11 月奶牛舍內點4 在距離地面1.5 m 處氣溶膠顆粒物濃度最高，其點3 在距地面0.5 m 處的氣溶膠顆粒物濃度最低，每升空氣中的氣溶膠粒子數量分別為2.53×105個和1.75×105個；12 月奶牛舍內點4 在距地面1.0 m 處的氣溶膠顆粒物濃度最高，其點1 在距地面0.5 m 處的氣溶膠粒子濃度最低，每升空氣中的氣溶膠粒子數量分別為2.65×105個和2.19 ×105個。同一個月內其余各點之間氣溶膠顆粒物濃度差異不顯著。所以在9—12 月中奶牛舍內氣溶膠粒子濃度與采樣點距離地面高度（＜1.5 m）無直接關系（配對樣品T 檢驗，相關系數（P＞0.05）。

表2 舍內環境狀況

從圖4 可以得出，在不區分高度的情況下，4 個月中，10 月奶牛舍內各點的氣溶膠粒子濃度最低，12 月時最高，相當于10 月各點濃度的2 倍。從表2 中可得，12 月奶牛舍內溫度和衛生狀況較10 月大幅下降，濕度顯著上升，通風條件變差。11 月與12 月間氣溶膠粒子濃度差異顯著，其余各月之間氣溶膠粒子濃度差異極顯著。從圖3-B 至3-D 中可以看出，10 月奶牛舍內P5 處氣溶膠粒子濃度最低，12 月P3 處的氣溶膠粒子濃度最高。秋季奶牛舍氣溶膠粒子濃度隨時間變化，氣溫降低和濕度升高而升高。

圖3 秋季不同月份奶牛舍內不同采樣點及采樣高度的氣溶膠顆粒物濃度

圖4 秋季不同月份氣溶膠粒子濃度

如圖5 所示，奶牛舍內氣溶膠粒子濃度隨著粒子粒徑的增大而降低。選取奶牛舍內氣溶膠粒子濃度差異最大的10 月與12 月進行對比，兩者均在氣溶膠粒子粒徑為0.3～0.5 μm 時濃度最高，而在粒徑＞10.0 μm 的氣溶膠粒子濃度最低，兩者之間差異極顯著（圖5 和圖6）。當粒徑在3.0～5.0 μm 和5.0～10.0 μm 時，10 月與12 月奶牛舍內氣溶膠粒子濃度大致相等。

圖5 10 月與12 月不同粒徑范圍內的氣溶膠粒子濃度趨勢

圖6 10 月不同粒徑的氣溶膠顆粒物濃度百分比

2.2 秋季奶牛舍內氣溶膠中需氧菌豐度的影響 從圖7可以看出，奶牛舍內氣溶膠中氣載需氧菌濃度隨月份增加呈先降低后升高的變化趨勢。在4 個月中，點1 處采集的氣溶膠中氣載需氧菌濃度明顯高于其他各點，9 月時最高為1.36×104CFU/m3，點3 處則明顯低于其他各點，10 月最低為0.84×104CFU/m3。從表3 中可以看出，在相同體積的空氣中，粒徑＜1 μm 時測得舍內氣溶膠粒子數最高，粒徑＞10 μm 時氣溶膠粒子數最低。從圖8-A 可以看出，采集到的各組氣溶膠中氣載需氧菌菌落數量由高至低。氣載需氧菌菌落數量在總菌落數中占比最大為22.23%，位于第4 級，最小為7.38%，位于第6 級。

表3 采樣點1 處84.9 L 空氣中氣 溶膠粒子數與菌落數量

圖7 氣載需氧菌濃度隨月份變化趨勢圖

從圖8-B 可以看出，在可培養細菌中，生長于粒徑＜5.0 μm 的微生物氣溶膠上的細菌豐度明顯高于生長于粒徑＞5.0 μm 的細菌豐度。粒徑＜5.0 μm 的微生物氣溶膠更易隨空氣進入呼吸道，在動物和人身體的不同部位沉積。以每分鐘吸入微生物的CFU 表示，根據人的吸氣量（6.94×10-3m3/min），飼養人員在牛舍內每小時可吸入2.45×103～3.60×103CFU 空氣細菌。

圖8 不同氣溶膠粒徑氣載需氧菌菌落數量百分比

3 討 論

本研究中隨月份改變，氣溫降低，奶牛舍內環境濕度增加和衛生狀況變差，氣溶膠粒子濃度升高，這與高玉紅等[11]的研究結果一致。本研究中奶牛舍內氣溶膠粒子濃度差異最大的為10 月與12 月，12 月由秋季向冬季轉變，奶牛舍門窗關閉，封閉程度較高，奶牛舍內墊料增加，10 月舍內平均風速為0.06 m/s，而12 月為0.02 m/s，通風性能相對較差，從而引起舍內氣載微生物數量和氣溶膠粒子濃度增加，這與單春花等[12]的研究結果相似。高玉紅等[13]研究顯示，不同建筑類型和不同時間段牛舍內微生物數量均表現出顯著性差異；Islam 等[14]研究表明，奶牛舍內外的溫度和氣流強度會影響微生物氣溶膠的傳播，Kristina 等[15]研究顯示，奶牛舍內順風處與逆風處的空氣中真菌濃度差異顯著。本研究選取同一生長階段的奶牛，奶牛舍建造采用雙坡屋頂結構，半封閉栓系式，較大程度限制了奶牛的活動范圍，舍內環境較為陰暗避光，機械通風與自然通風相結合，舍中央細菌濃度相對于4 個角落更高。本研究結果顯示，奶牛舍內氣溶膠粒子濃度與距離地面高度（＞1.5 m）無直接關系，由于試驗高度限制于當時飼養環境高度和時間條件，此結論有待進一步研究論證。單春花等[12]研究發現，不同季節散養式奶牛舍內氣載需氧菌總數達到1 804～ 4 944 CFU/m3，與空氣中PM10 濃度之間存在顯著的線性正相關關系，而本研究結果顯示秋季奶牛舍內氣溶膠中粒徑＞10.0 μm 的粒子濃度在10 月最低，12 月最高，舍內氣載需氧菌濃度呈先上升后下降的趨勢。這可能是因為研究所選擇的奶牛舍飼養條件不同，栓系式奶牛舍細菌密度一般顯著高于散養式奶牛舍[16]；而且取樣時間不同，本研究取樣時間跨度更小，奶牛舍內氣溶膠顆粒粒徑范圍更廣，溫度變化更小。因此本研究發現奶牛舍氣溶膠菌落總數隨環境溫度的降低而下降，這與單春花等[12]研究結果一致。本試驗結果顯示奶牛舍內可吸入細菌豐度相較于非可吸入細菌差異極顯著，劉敬博等[17]使用培養計數法測得奶牛舍內氣載微生物（細菌和真菌）含量的平均值為2.09×105 CFU/m3，同時使用DAPI 染色計數法測得奶牛舍內氣載微生物含量的平均值分別為8.36×106CFU/m3，2 種方法差異極顯著。本試驗中僅使用安德森6 級微生物采樣器和培養基進行可培養細菌的檢測，統計得出氣載需氧菌的百分比含量，測得奶牛舍內秋季氣載需氧菌含量最高為1.36×104CFU/m3，低于我國《畜禽場環境質量標準》（NY/T 388-1999）所規定的牛舍氣載需氧菌含量2.0×104CFU/m3的標準，同時低于段會勇等[18]檢測的牛舍中氣載需氧菌的濃度8.90×104～4.19×105CFU/m3，可能與所測動物生長階段相關[19]，本研究未使用DAPI 染色計數法測定微生物總含量，容易低估空氣中生物氣溶膠總量[20]。然而奶牛舍內氣溶膠中的可吸入細菌容易造成多種呼吸道傳染病，同時可降低長期處于此環境中的技術人員和動物的免疫力，對飼養人員生命健康有著嚴重威脅[21]。因此，在養殖過程中需重視對微生物氣溶膠濃度的監測，未來應建立完整的畜禽舍致病微生物采集和分析標準，同時投入對生物凈化劑和吸附劑的研究，促進環境友好型生態養殖。

4 結 論

本研究結果顯示，當奶牛舍內的采樣點距離地面高度＜1.5 m 時，氣溶膠顆粒物濃度與高度無直接關系；秋季的4 個月中奶牛舍內氣溶膠濃度變化趨勢相同；隨氣溫的降低和相對濕度的增加，氣溶膠粒子濃度增加；奶牛舍內氣溶膠粒子濃度隨著粒子粒徑的增大而降低；秋季奶牛舍內微生物氣溶膠中可吸入細菌豐度高于非可吸入細菌，奶牛舍內氣載需氧菌濃度隨月份增加，舍內溫度降低及墊料增加而呈先降低后上升的變化趨勢，環境因素對奶牛舍內微生物氣溶膠濃度變化具有明顯影響。