中國荷斯坦牛HSPB8 基因與熱應激反應性狀相關性研究

張 帆，胡麗蓉，劉嘉莉，康 玲，羅漢鵬，楊明路，徐 青*，郭 剛，初 芹，黃錫霞，王雅春*

（1.新疆農業大學動物科學學院，新疆烏魯木齊 830052；2.中國農業大學動物科學技術學院，北京 100193；3.北京交通大學生命科學與生物工程研究院，北京 100044；4.北京首農畜牧發展有限公司，北京 100029；5.北京市農林科學院，北京 100089）

熱應激每年給奶牛業帶來巨大損失，已成為困擾全世界奶牛產業的難題之一。熱應激環境下，多數動物會產生熱休克反應，機體表達大量的熱休克蛋白（Heat Shock Proteins，HSPs）。熱休克蛋白種類繁多，按分子量分為小分子熱休克蛋白（sHSP）、HSP40、HSP60、HSP70、HSP90、HSP110 及泛素 7 個家族。在sHSP 家族中，HSPB8 蛋白亦稱為HSP22、H11 激酶，在氧化應激[1-2]、線粒體自噬[3-5]、細胞凋亡[5-6]、炎癥反應[7-9]中均有重要的功能。HSPB8 作為一種分子伴侶，能夠與骨形態發生蛋白（Bone Morphogenetic Protein，BMP）結合，激活PI3K/Akt 通路，抑制細胞凋亡[10-11]；與BAG3（Bcl-2-associated Anti-Apoptotic Gene 3）、HSP70、SYNPO2（Synaptopodin 2）結合，加快變性或錯誤折疊的蛋白質修復和降解[12-15]；與微管相關蛋白-2（Microtubule Associated Protein 2，MAP2）結合以維持細胞骨架完整[16-18]，保護熱應激下的細胞。此外，熱應激時機體為減少產熱會增加糖代謝，減少脂代謝，細胞的能量需求量也會增加。而HSPB8 蛋白通過阻止二硫蘇糖醇誘導的胰島素聚集和熱誘導的檸檬酸合酶聚集，使三羧酸循環正常進行，保證細胞的能量平衡[19-20]。因此，HSPB8 蛋白在細胞抗熱應激中發揮重要作用，在熱應激條件下過表達HSPB8 蛋白可以在一定程度上增加細胞的耐熱性[21-22]。

在果蠅和水牛的研究中都發現熱應激可以引起HSPB8基因表達顯著上調[19,23-24]；2018 年，Sengar 等[25]研究發現牛熱應激后表達顯著上調的1 個miRNA（btamiR-2898），在HSPB8基 因3'UTR 區域有2 個結合位點，進一步在外周血單核細胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells，PBMC）中證實了熱應激引起btamiR-2898 的過表達能夠調控目標基因的表達。Verma等[26]在沙希華牛群中發現HSPB8基因第一外顯子區g.507 G＞A 突變不同基因型個體間的耐熱性存在顯著差異，并認為該位點的AG 基因型可作為沙希華牛耐熱性選擇的遺傳標記。

本文從細胞水平研究了HSPB8基因的表達及其與中國荷斯坦牛熱應激反應性狀之間的相關性，為研究熱應激反應與奶牛重要候選基因遺傳多樣性的關系、篩選奶牛耐熱性相關遺傳標記、培育耐熱品種提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 熱應激條件下HSPB8基因的表達變化

1.1.1 細胞熱應激處理 奶牛外周血單核細胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells，PBMC）和牛腎細胞（Madin-Darbv Bovine Kidney，MDBK）為課題組保存的細胞模型[27]。細胞常規培養[27]24 h 后，實驗組42℃水浴處理1 h，對照組37℃處理1 h，每組12 個重復。

1.1.2HSPB8基因mRNA 表達分析 利用NCBI 網站檢索目標基因HSPB8和內參基因GAPDH的mRNA 序列，設計引物：HSPB8-F：TAAAATGTTGGGGGTCGGGG；HSPB8-R：TGCAATGGAGCATGACCTGT；GAPDH-F：GGCGCCAAGAGGGTCAT；GAPDH-R：AGGCATTG CTGACAATCTTGAG，進行細胞總RNA 的提取、反轉錄及定量PCR 檢測。

1.2HSPB8基因多態篩查

1.2.1 DNA 池的構建 選取70 頭無親緣關系的中國荷斯坦牛公牛，凍精樣品由北京奶牛中心提供。采用高鹽法[28]提取基因組DNA，NanoDrop 2000 檢測濃度后調整為100 ng/μL。隨機將樣品分成3 組（20、20、30 頭），根據DNA 濃度等量混合構建3 個DNA 池，4℃保存備用。

1.2.2 基因多態篩查 參考已知序列（NC_037344.1）共設計3 對引物（表1），涵蓋HSPB8基因全部編碼區、部分內含子區及上下游調控區各500 bp。

表1 HSPB8 基因多態篩查用引物信息

PCR 反應體系25 μL：DNA 池（100 ng/μL）0.5 μL，2×Taq Master Mix 12.5 μL，上下游引物（10 μmol/μL）各1 μL，ddH2O 10 μL。PCR 產物經2%瓊脂糖凝膠檢測后送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序，根據測序峰圖與參考序列比對來判定多態性。

1.3HSPB8多態性與熱應激反應性狀的關聯分析

1.3.1 熱應激反應性狀表型及估計育種值（EBVs）估計 熱應激對奶牛造成的影響與體溫升高的幅度有關[29-30]，耐熱性較好的個體體溫調節能力強，熱應激時體溫變化幅度小，應激反應小。奶牛有多種度量體溫的方法，其中直腸溫度具有穩定性高且易檢測的優點，往往被作為體溫指標的重要首選。此外，當奶牛出現熱應激反應時，會表現出呼吸頻率加快、心率加快，同時出現張嘴呼吸伴隨流涎。因此，除直腸溫度外，呼吸評分和流涎指數也往往被作為衡量熱應激反應的生理指標[31]。

2013—2017 年夏季（THI＞72），共測定北京地區12 541 頭中國荷斯坦母牛的直腸溫度、評分及流涎指數3項生理指標，方法參考文獻[31]。課題組共整理70 819 條數據（含系譜），其中1 665 頭實驗牛（基因分型）每頭含有6 條表型數據，直接使用表型值與SNP 進行關聯分析并不嚴謹。EBVs 在計算過程中去除了系統環境效應和永久環境效應對表型值的影響，使用熱應激性狀的EBVs 與基因多態性進行相關性分析相對表型值來說，結果更準確、更靈敏[32]。

采用多性狀動物模型借助DMU 軟件DMUAI 模塊[33-34]估計EBVs。系譜來自北京奶牛中心，包括1990—2017年共450 975 頭牛。模型為：

其中，Yilkpmn為直腸溫度、呼吸評分或流涎指數表型；FYMi為固定效應，在直腸溫度評估中為場年組合效應，在呼吸評分和流涎指數評估中為場年評分人的組合效應；Ml為擠奶時間（前/后）效應；Timek為測定時間（上午/下午）效應；PARITYp為胎次（1、2、3、4、5、≥6）效應；DIM為泌乳天數效應；DIM2為泌乳天數二次項；TEM為環境溫度；Am為加性遺傳效應；PEm為永久環境效應。

1.3.2 母牛DNA 的提取及基因分型 從上述有表型數據的母牛中隨機選取1 665 頭，來自北京地區9 個牧場。頸靜脈采血，肝素鈉抗凝，使用DNA 試劑盒（天根，DP318）提取基因組DNA，濃度檢測后調整至50 ng/μL備用。對篩選到的HSPB8基因的2 個SNPs，重新設計引物（表2），采用競爭性等位基因特異性PCR（Kompetitive Allele Specif ic PCR，KASP）分型[35]，由中玉金標記（北京）生物技術股份有限公司完成。

表2 SNP 位點KASP 分型用引物信息

1.3.3 統計分析 使用Haploview（version 4.2）軟件分別對HSPB8基因的SNPs 進行連鎖不平衡分析，采用SAS 9.2 軟件對直腸溫度、呼吸評分和流涎指數的EBVs 與SNP 進行單個位點和單倍型組合關聯分析，線性模型為Y=μ+G+e，其中Y表示各性狀EBVs，μ是總體均值，G為基因型效應，e為隨機殘差效。采用Bonferroni 法進行同一SNP 不同基因型的多重比較。

2 結果與分析

2.1 熱應激對HSPB8基因mRNA 表達量的影響 如圖1 所示，在PBMC 細胞中，與對照組相比，熱應激組HSPB8基因的表達量上調了2.17 倍（P＜0.01）；而在MDBK 細胞中，HSPB8基因的表達量上調更加明顯，與對照組相比差異達到了6 倍（P＜0.01）。

圖1 熱應激對HSPB8 基因表達的影響

2.2 中國荷斯坦牛HSPB8基因多態性分析 采用DNA池測序法對HSPB8基因進行多態性篩選，共檢測到2個SNPs（表3），一個位于內含子2 區域，另一個位于3'UTR 區（圖2）。

表3 中國荷斯坦牛HSPB8 基因多態位點

圖2 HSPB8 基因多態位點測序峰圖

2.3HSPB8基因SNPs 與熱應激反應性狀的相關性 基因分型結果如表4 所示，卡方檢驗表明，在中國荷斯坦牛群體 中g.58406728G＞A 和g.58406042A＞G 這2 個位點均處于Hardy-Weinberg 平衡狀態（P＞0.05）。二者均屬于中度多態標記，多態信息含量（PIC）為0.37。對g.58406728G＞A 位點而言，G 等位基因是優勢等位基因，AG 基因型為優勢基因型。而g.58406042A＞G 位點，A等位基因屬于優勢等位基因，AG 基因型為優勢基因型。

表4 基因頻率和基因型頻率的分布以及Hardy-Weinberg 平衡的卡方檢驗

分別用這2 個SNPs 位點與3 個熱應激反應性狀直腸溫度、呼吸評分和流涎指數的EBVs 進行單標記關聯分析，結果如表5 所示。可以看出，g.58406728G＞A位點與流涎指數EBVs 性狀顯著相關，其中，GG 型個體的EBVs 顯著高于AA 型和AG 型個體，分別高0.097和0.083；AA 型個體的EBVs 數值最低，但與AG 型差異不顯著。

表5 HSPB8 基因多態與直腸溫度EBVs、呼吸評分EBVs 和流涎指數EBVs 的關聯分析

g.58406042A＞G 位點分析結果顯示其與直腸溫度性狀呈顯著相關。AA 型個體的EBVs 極顯著低于GG 型；而雜合子AG 型EBVs 居中，與2 個純合子差異不顯著。

2.4HSPB8基因SNPs 連鎖不平衡分析 單倍型分析結果顯示，2 個SNPs 具有較緊密的連鎖關系，D'=0.957，r2=0.912，二者均為標簽SNP（圖3）。H1、H2 為優勢單倍型，二者頻率之和為0.978（表6）。當二者均為有利突變時，其中單倍型組合為H3H3，但是H3H3的個體數量太少，僅有4 頭牛，不具有群體代表性，會導致所估計的總體均值具有較大誤差，因此未納入后續分析中。此外，為更準確估計各單倍型組合的總體均值，本研究以個體百分比大于5%為標準，篩選出了3 種優勢單倍型組合（即H1H1、H1H2、H2H2）與表型性狀EBVs 進行關聯分析，分析結果如表7 所示。

表6 單倍型頻率

表7 單倍型組合相關性分析

圖3 HSPB8 基因2 個SNPs 連鎖不平衡估計

3 討 論

3.1 熱應激誘導HSPB8基因的表達 本研究中，牛MDBK細胞和PBMC 細胞經熱刺激處理后，HSPB8基因表達量都極顯著上調。Boardman[23]和Kirbach[36]分別對果蠅和大鼠的組織進行熱處理，均發現HSPB8基因表達顯著上調，這也與本研究結果一致。根據目前的研究顯示，HSPB8基因受熱應激誘導顯著上調可能與熱休克因子1（Heat Shock Factor 1，HSF1）過磷酸化激活有關。Vydra 等[37]使用雌激素磷酸化HSF1 發現，HSF1與HSPB8基因啟動子區域的熱休克原件（Heat Shock Elements，HSEs）結合能力增加，并導致HSPB8基因過表達。Anckar 等[38]也發現熱應激誘導HSF 過度磷酸化，增強與HSPB8基因啟動子區域HSEs 的結合。但HSF1 的激活過程十分復雜，有人認為熱休克蛋白水平和細胞蛋白損傷程度的平衡可以作為應激的敏感因子激活HSF1[39]。2006 年，Shamovsky 等[40]研究發現HSF1 可以由一種核糖核蛋白復合物激活，這種復合物中包含一類RNA 分子，這類RNA 在細胞中可能作為溫度感受器發揮作用，當溫度變化時，其構像發生變化，并最終導致HSF1 的激活[41]。

3.2 中國荷斯坦牛HSPB8基因多態與熱應激反應 本研究在中國荷斯坦牛群中發現HSPB8基因的2 個SNPs，一個位于內含子2，一個位于3'UTR 區。Nishant 等[26]在沙希瓦華牛群體中發現2 個SNPs，分別是g.507G＞A和g.881T＞C，與本研究檢測到的突變位點沒有重疊，這可能與品種的特異性有關。本研究發現HSPB8基因的多態位點與奶牛熱應激反應性狀間存在顯著的相關性。其中，位于內含子2 上的位點g.58406728G＞A 與流涎指數EBVs 顯著相關。本研究對流涎指數的評分標準包括流涎與否和口鼻干濕情況，理論上流涎指數越低代表牛越耐熱，AA 型和AG 型的EBVs 顯著低于GG 型，意味著AA 型和AG 型個體的耐熱性可能高于GG 型個體，這也意味著A 等位基因有作為耐熱育種標簽的潛力。

此外，位于3'UTR 區的位點g.58406042A＞G 則與直腸溫度EBVs 顯著相關，AA 型EBVs 值極顯著低于GG 型。直腸溫度是個體對于環境溫度變化生理調節反應的直接表現，熱應激耐受型奶牛的直腸溫度顯著低于敏感個體[9]，因此判斷AA 型個體較GG 型個體更耐熱，在育種中可以作為熱應激耐受型個體的重要參考遺傳標記。目前有研究表明位于3'UTR 上的SNP 可以通過改變miRNA 與其結合能力來影響基因的表達[42]。Sengar等[25]也發現奶牛熱應激反應狀態下表達上調的miRNA（bta-miR-2898）能夠靶向結合HSPB8基因3'UTR 區進而調控基因的表達。

本研究中檢測的2 個SNPs 位點分別與奶牛流涎指數EBVs、直腸溫度EBVs 顯著相關，這可能與直腸溫度和流涎的發生和發展具有異相性有關。當熱應激不嚴重時，奶牛主要通過皮膚出汗進行散熱，此時牛群的流涎指數可能會趨向同質，即很少出現流涎的現象。而當奶牛處于嚴重的熱應激時，皮膚出汗已無法滿足散熱需求，這時機體會采用加快呼吸頻率的方式散熱，但當呼吸頻率升高到一定程度時，會轉為喘息，且出現流涎的現象。因此，直腸溫度和流涎指數是從不同角度去評估熱應激，具有不同的生物學意義。本研究中，2 個位點與不同的生理指標具有相關性，說明二者參與不同的調控過程，在奶牛熱應激反應過程中均具有非常重要的意義。此外，這2 個位點與呼吸評分EBVs 均未有顯著的相關關系，可能與奶牛在熱應激反應時出現第二項呼吸有關。穆玉云等[43]也認為當牛體溫上升到一定程度會出現第二項呼吸，使呼吸頻率下降，而耐熱的牛呼吸頻率仍可保持著較高水平，其認為呼吸頻率作為牛的耐熱指標不完全準確。在單倍型關聯分析中，3 種單倍型組合與直腸溫度EBVs、呼吸評分EBVs、流涎指數EBVs均無顯著相關性。優勢單倍型均不為最優等位基因組合，而是GA 或者AG，這可能是導致單倍型與表型性狀EBVs 關聯不顯著的原因。

4 結 論

本研究從細胞水平和分子水平表明奶牛HSPB8基因是與荷斯坦牛熱應激反應相關的重要候選基因。奶牛MDBK 和PBMC 細胞經熱處理后，HSPB8基因表達量均極顯著上調，證明HSPB8是奶牛體內受熱應激誘導的重要基因。進一步，在中國荷斯坦牛群中檢測到HSPB8基因的2 個SNPs，與奶牛熱應激反應指標直腸溫度、呼吸評分、流涎指數估計育種值（EBVs）關聯分析結果顯示，位于3'UTR 區的g.58406042A＞G 位點和位于內含子2 上的g.58406728G＞A 位點分別與直腸溫度和流涎指數EBVs 顯著相關，2 個位點具有A 等位基因的個體比具有G 等位基因的個體更耐熱，可用于分子標記輔助育種培育耐熱中國荷斯坦牛群體。