快速測定多花黃精種子活力的TTC染色法條件研究

胡迎峰 穆帥 張家祥 黃穎 張思宇 劉慧君

摘 要：采用TTC染色法對多花黃精種子進行活力測定，通過5因素4水平正交試驗，探究浸種溫度、浸種時間、TTC溶液濃度、染色溫度及染色時間對TTC染色法測定效果的影響。結果表明：多花黃精種子TTC染色的最佳條件為：30℃的條件下水浴浸種6h，并用濃度為0.3%的TTC溶液在40℃條件下避光染色24h。

關鍵詞：多花黃精;TTC染色法;正交設計;種子活力

中圖分類號 S567.23文獻標識碼 A文章編號 1007-7731（2021）10-0031-03

Study on the Rapid Determination of Seed Vitality of Polygonatum cyrtonema Hua by TTC Staining

HU Yingfeng et al.

（Anhui Normal University College of Life Sciences， Wuhui 241000， China）

Abstract： In this paper， TTC staining was used to determine the seeds vitality of Polygonatum cyrtonema Hua. The experiment was conducted with 5 factors and 4 levels orthogonal design to investigate the effects of the seed soaking temperature， the seed soaking time， the concentration of TTC solution， the dyeing temperature and the dyeing time on TTC staining. The results showed that the best condition for TTC staining of Polygonatum cyrtonema Hua was to soak seeds in water bath for 6 hours at 30 ℃ and to avoid light staining for 24 hours with 0.3% TTC solution.

Key words： Polygonatum cyrtonema Hua; TTC method; Orthogonal design; Seed vigor

多花黃精（Polygonatum cyrtonema Hua）隸屬于天門冬科（Asparagaceae）黃精屬（Polygonatum），現廣泛分布于華東、華中以及西南等地[1]。根據中國藥典記載，其根狀莖可入藥，具有補脾潤肺、生津止渴等作用[2]。近年來，隨著多花黃精用途不斷的被開發，其市場需求和價格均在穩步上升，野生資源已無法滿足人們的需求[3]。因此，在多花黃精產業的發展過程中，人工種植已成為擴大產量的最佳途徑。其中，最重要就是選種和育種工作，而種子質量又與種子活力有密切關聯[4]。至今，有關多花黃精種子活力的研究僅見傅飛龍等的初步報道，且未提供研究的具體數據和結果[5]，對多花黃精種子活力的探究仍缺乏準確的方法和實驗數據。為此，本研究選用2，3，5-三苯基氯化四氮唑染色法（TTC染色法）對種子活力進行探究多花黃精種子活力測定的最適條件[6-10]，以期為多花黃精的育種提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 供試材料 試驗采用的多花黃精種子于2020年10月購自安徽省六安市金寨縣規模化種植基地。將種子從果實中洗出后，隨機混合，并通過水選法去除不合格種子[11]，留下下沉種子即顆粒飽滿的優質種子進行測試。

1.2 預實驗及結果 在確定正式試驗方案之前，采用未完全成熟的綠色多花黃精種子和相對激進的水浴溫度開展了一系列的預試驗。試驗發現：（1）使用未完全成熟的綠色多花黃精種子進行TTC染色時，通過多次不同條件的檢測，活力均為100%。（2）當對多花黃精種子的水浴溫度超過55℃，水浴時間超過24h，會導致種子完全失活（TTC染色法活力檢測顯示完全無活性）;而對多花黃精種子的水浴溫度低于20℃，且水浴時間少于6h，則會導致顯色現象不明顯。因此，在挑選實驗所需的種子時，需要避開綠色多花黃精種子，由于其未完全成熟，導致活性物質含量過高并無探究意義[12-13]。在設計試驗時，需要控制水浴溫度在20～55℃，控制水浴時間在6～24h。

1.3 TTC溶液的配制和浸種處理 用蒸餾水和2，3，5-氯化三苯基四氮唑粉劑配制成1.0%、0.5%、0.3%和0.1%TTC溶液[9]。將多花黃精種子分別放入加入等量蒸餾水的小燒杯中，并使種子完全浸沒，置于20℃、30℃、40℃和50℃水浴鍋內進行水浴，分別浸泡6h、12h、18h和24h，每個處理使用50粒種子[10]。

1.4 正交試驗 利用多份多花黃精種子，采取L16（45）5因素4水平正交設計（見表1），選擇影響染色效果的浸種溫度、浸種時間、TTC溶液濃度、染色溫度和染色時間5個因素為檢測指標，每個因素設置4個水平進行試驗。

1.5 染色處理 種子經水浴后取出，用吸水紙將種子表面的水分吸干，并利用手術刀將種子切割下1/3，將留有種胚的那部分放置于培養皿中[6]。按正交試驗設計方案，將等量的濃度分別為1.0%、0.5%、0.3%和0.1%的TTC溶液分別加入各個培養皿中，直至種子完全浸沒。將種子分別置于溫度為20℃、30℃、40℃和50℃的恒溫箱內，分別避光染色6h、12h、18h和24h后取出，用蒸餾水沖洗3次，觀察染色結果，凡胚被染為紅色的種子被認定為有生活力的種子[14]。

1.6 數據處理 使用SPSS 21.0對數據進行分析，以篩選TTC染色法測定多花黃精種子生活力的最佳條件。種子活力的計算公式如下：

種子活力百分數（%）=（被染色的種子數量/染色種子總數）×100

2 結果與分析

2.1 TTC染色法活力測定結果 多花黃精種子活力測定結果如表2所示。其中，本試驗中多花黃精種子活力最高的為組合5，種子活力百分數為90%，即在30℃的條件下水浴浸種6h，并用濃度為0.3%TTC溶液在40℃條件下染色24h。種子活力測定值最低的為組合16，種子活力百分數為6%，即在50℃的條件下水浴浸種24h，并用濃度為0.1%TTC溶液在40℃條件下染色12h。

2.2 極差分析 對數據進行極差分析（見表3），比較5個不同的因素對多花黃精種子活力測定結果的影響，5種因素的極差值分別為138%、74%、42%、102%和100%。由此可見，在對多花黃精種子活力測定過程中，影響因素最大的是浸種溫度，符合預試驗中水浴溫度超過55℃會導致種子完全失活的預期。其次，對種子活力的影響程度由大到小依次為染色溫度>染色時間>浸種時間>TTC濃度。其中，TTC濃度對多花黃精種子活力的測定影響最小。對由5種因素中的4個水平所對應的L1、L2、L3、L44個不同的組合進行進一步分析，選擇每個因素對應的種子活力最大值的水平來表示適合多花黃精種子活力測定的最佳條件。其中，浸種溫度對應的活力最大值為L2，最適浸種溫度即為30℃;浸種時間對應的活力最大值為L2，最適浸種時間即為12h;TTC濃度對應的活力最大值為L2，最適TTC濃度即為0.3%;染色溫度對應的活力最大值為L2，最適染色溫度即為30℃;染色時間對應的活力最大值為L4，最適浸種時間即為24h。綜上所述，多花黃精種子在30℃恒溫水浴12h后，使用濃度為0.3%的TTC溶液，在30℃條件下避光染色24h為最優組合。

3 討論

3.1 TTC法測定多花黃精種子活力的最優條件 由正交試驗結果表明，種子平均生活力百分數最高的為90%，對應處理組合5，即在30℃的條件下水浴浸種6h，并用濃度為0.3%TTC溶液在40℃條件下染色24h。而通過極差分析表明，多花黃精種子在30℃恒溫水浴12h后，使用濃度為0.3%的TTC溶液，在30℃條件下避光染色24h為最優組合。對比發現，僅在浸種時間和染色溫度上存在差異，且差異較小，處理組合5可以作為最優條件。綜上所述，多花黃精種子TTC染色的最佳條件為：在30℃的條件下水浴浸種6h，并用濃度為0.3%的TTC溶液在40℃條件下染色24h。

3.2 TTC法測定多花黃精種子活力的可行性分析 TTC染色法是一種常用于種子活力檢測的一般方法，其測定結果與種子發芽率較為接近。種子活力的高低對多花黃精在產業化育種過程中至關重要[15-16]，直接關系到企業生產過程中的沉默成本，對于企業的持續盈利能力至關重要。TTC染色法測定多花黃精種子活力僅需30h，縮短了傳統育種手段測定種子活力所需的時間和精力。因此，在生產實踐過程中，可使用TTC染色法來判斷種子的質量，進而推測種子潛在的萌發率。

參考文獻

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（責編：張宏民）