快速測(cè)定多花黃精種子活力的TTC染色法條件研究

胡迎峰 穆帥 張家祥 黃穎 張思宇 劉慧君

摘 要：采用TTC染色法對(duì)多花黃精種子進(jìn)行活力測(cè)定，通過(guò)5因素4水平正交試驗(yàn)，探究浸種溫度、浸種時(shí)間、TTC溶液濃度、染色溫度及染色時(shí)間對(duì)TTC染色法測(cè)定效果的影響。結(jié)果表明：多花黃精種子TTC染色的最佳條件為：30℃的條件下水浴浸種6h，并用濃度為0.3%的TTC溶液在40℃條件下避光染色24h。

關(guān)鍵詞：多花黃精;TTC染色法;正交設(shè)計(jì);種子活力

中圖分類(lèi)號(hào) S567.23文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A文章編號(hào) 1007-7731（2021）10-0031-03

Study on the Rapid Determination of Seed Vitality of Polygonatum cyrtonema Hua by TTC Staining

HU Yingfeng et al.

（Anhui Normal University College of Life Sciences， Wuhui 241000， China）

Abstract： In this paper， TTC staining was used to determine the seeds vitality of Polygonatum cyrtonema Hua. The experiment was conducted with 5 factors and 4 levels orthogonal design to investigate the effects of the seed soaking temperature， the seed soaking time， the concentration of TTC solution， the dyeing temperature and the dyeing time on TTC staining. The results showed that the best condition for TTC staining of Polygonatum cyrtonema Hua was to soak seeds in water bath for 6 hours at 30 ℃ and to avoid light staining for 24 hours with 0.3% TTC solution.

Key words： Polygonatum cyrtonema Hua; TTC method; Orthogonal design; Seed vigor

多花黃精（Polygonatum cyrtonema Hua）隸屬于天門(mén)冬科（Asparagaceae）黃精屬（Polygonatum），現(xiàn)廣泛分布于華東、華中以及西南等地[1]。根據(jù)中國(guó)藥典記載，其根狀莖可入藥，具有補(bǔ)脾潤(rùn)肺、生津止渴等作用[2]。近年來(lái)，隨著多花黃精用途不斷的被開(kāi)發(fā)，其市場(chǎng)需求和價(jià)格均在穩(wěn)步上升，野生資源已無(wú)法滿(mǎn)足人們的需求[3]。因此，在多花黃精產(chǎn)業(yè)的發(fā)展過(guò)程中，人工種植已成為擴(kuò)大產(chǎn)量的最佳途徑。其中，最重要就是選種和育種工作，而種子質(zhì)量又與種子活力有密切關(guān)聯(lián)[4]。至今，有關(guān)多花黃精種子活力的研究?jī)H見(jiàn)傅飛龍等的初步報(bào)道，且未提供研究的具體數(shù)據(jù)和結(jié)果[5]，對(duì)多花黃精種子活力的探究仍缺乏準(zhǔn)確的方法和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。為此，本研究選用2，3，5-三苯基氯化四氮唑染色法（TTC染色法）對(duì)種子活力進(jìn)行探究多花黃精種子活力測(cè)定的最適條件[6-10]，以期為多花黃精的育種提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 供試材料 試驗(yàn)采用的多花黃精種子于2020年10月購(gòu)自安徽省六安市金寨縣規(guī)模化種植基地。將種子從果實(shí)中洗出后，隨機(jī)混合，并通過(guò)水選法去除不合格種子[11]，留下下沉種子即顆粒飽滿(mǎn)的優(yōu)質(zhì)種子進(jìn)行測(cè)試。

1.2 預(yù)實(shí)驗(yàn)及結(jié)果 在確定正式試驗(yàn)方案之前，采用未完全成熟的綠色多花黃精種子和相對(duì)激進(jìn)的水浴溫度開(kāi)展了一系列的預(yù)試驗(yàn)。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：（1）使用未完全成熟的綠色多花黃精種子進(jìn)行TTC染色時(shí)，通過(guò)多次不同條件的檢測(cè)，活力均為100%。（2）當(dāng)對(duì)多花黃精種子的水浴溫度超過(guò)55℃，水浴時(shí)間超過(guò)24h，會(huì)導(dǎo)致種子完全失活（TTC染色法活力檢測(cè)顯示完全無(wú)活性）;而對(duì)多花黃精種子的水浴溫度低于20℃，且水浴時(shí)間少于6h，則會(huì)導(dǎo)致顯色現(xiàn)象不明顯。因此，在挑選實(shí)驗(yàn)所需的種子時(shí)，需要避開(kāi)綠色多花黃精種子，由于其未完全成熟，導(dǎo)致活性物質(zhì)含量過(guò)高并無(wú)探究意義[12-13]。在設(shè)計(jì)試驗(yàn)時(shí)，需要控制水浴溫度在20～55℃，控制水浴時(shí)間在6～24h。

1.3 TTC溶液的配制和浸種處理 用蒸餾水和2，3，5-氯化三苯基四氮唑粉劑配制成1.0%、0.5%、0.3%和0.1%TTC溶液[9]。將多花黃精種子分別放入加入等量蒸餾水的小燒杯中，并使種子完全浸沒(méi)，置于20℃、30℃、40℃和50℃水浴鍋內(nèi)進(jìn)行水浴，分別浸泡6h、12h、18h和24h，每個(gè)處理使用50粒種子[10]。

1.4 正交試驗(yàn) 利用多份多花黃精種子，采取L16（45）5因素4水平正交設(shè)計(jì)（見(jiàn)表1），選擇影響染色效果的浸種溫度、浸種時(shí)間、TTC溶液濃度、染色溫度和染色時(shí)間5個(gè)因素為檢測(cè)指標(biāo)，每個(gè)因素設(shè)置4個(gè)水平進(jìn)行試驗(yàn)。

1.5 染色處理 種子經(jīng)水浴后取出，用吸水紙將種子表面的水分吸干，并利用手術(shù)刀將種子切割下1/3，將留有種胚的那部分放置于培養(yǎng)皿中[6]。按正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，將等量的濃度分別為1.0%、0.5%、0.3%和0.1%的TTC溶液分別加入各個(gè)培養(yǎng)皿中，直至種子完全浸沒(méi)。將種子分別置于溫度為20℃、30℃、40℃和50℃的恒溫箱內(nèi)，分別避光染色6h、12h、18h和24h后取出，用蒸餾水沖洗3次，觀察染色結(jié)果，凡胚被染為紅色的種子被認(rèn)定為有生活力的種子[14]。

1.6 數(shù)據(jù)處理 使用SPSS 21.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，以篩選TTC染色法測(cè)定多花黃精種子生活力的最佳條件。種子活力的計(jì)算公式如下：

種子活力百分?jǐn)?shù)（%）=（被染色的種子數(shù)量/染色種子總數(shù)）×100

2 結(jié)果與分析

2.1 TTC染色法活力測(cè)定結(jié)果 多花黃精種子活力測(cè)定結(jié)果如表2所示。其中，本試驗(yàn)中多花黃精種子活力最高的為組合5，種子活力百分?jǐn)?shù)為90%，即在30℃的條件下水浴浸種6h，并用濃度為0.3%TTC溶液在40℃條件下染色24h。種子活力測(cè)定值最低的為組合16，種子活力百分?jǐn)?shù)為6%，即在50℃的條件下水浴浸種24h，并用濃度為0.1%TTC溶液在40℃條件下染色12h。

2.2 極差分析 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行極差分析（見(jiàn)表3），比較5個(gè)不同的因素對(duì)多花黃精種子活力測(cè)定結(jié)果的影響，5種因素的極差值分別為138%、74%、42%、102%和100%。由此可見(jiàn)，在對(duì)多花黃精種子活力測(cè)定過(guò)程中，影響因素最大的是浸種溫度，符合預(yù)試驗(yàn)中水浴溫度超過(guò)55℃會(huì)導(dǎo)致種子完全失活的預(yù)期。其次，對(duì)種子活力的影響程度由大到小依次為染色溫度>染色時(shí)間>浸種時(shí)間>TTC濃度。其中，TTC濃度對(duì)多花黃精種子活力的測(cè)定影響最小。對(duì)由5種因素中的4個(gè)水平所對(duì)應(yīng)的L1、L2、L3、L44個(gè)不同的組合進(jìn)行進(jìn)一步分析，選擇每個(gè)因素對(duì)應(yīng)的種子活力最大值的水平來(lái)表示適合多花黃精種子活力測(cè)定的最佳條件。其中，浸種溫度對(duì)應(yīng)的活力最大值為L(zhǎng)2，最適浸種溫度即為30℃;浸種時(shí)間對(duì)應(yīng)的活力最大值為L(zhǎng)2，最適浸種時(shí)間即為12h;TTC濃度對(duì)應(yīng)的活力最大值為L(zhǎng)2，最適TTC濃度即為0.3%;染色溫度對(duì)應(yīng)的活力最大值為L(zhǎng)2，最適染色溫度即為30℃;染色時(shí)間對(duì)應(yīng)的活力最大值為L(zhǎng)4，最適浸種時(shí)間即為24h。綜上所述，多花黃精種子在30℃恒溫水浴12h后，使用濃度為0.3%的TTC溶液，在30℃條件下避光染色24h為最優(yōu)組合。

3 討論

3.1 TTC法測(cè)定多花黃精種子活力的最優(yōu)條件 由正交試驗(yàn)結(jié)果表明，種子平均生活力百分?jǐn)?shù)最高的為90%，對(duì)應(yīng)處理組合5，即在30℃的條件下水浴浸種6h，并用濃度為0.3%TTC溶液在40℃條件下染色24h。而通過(guò)極差分析表明，多花黃精種子在30℃恒溫水浴12h后，使用濃度為0.3%的TTC溶液，在30℃條件下避光染色24h為最優(yōu)組合。對(duì)比發(fā)現(xiàn)，僅在浸種時(shí)間和染色溫度上存在差異，且差異較小，處理組合5可以作為最優(yōu)條件。綜上所述，多花黃精種子TTC染色的最佳條件為：在30℃的條件下水浴浸種6h，并用濃度為0.3%的TTC溶液在40℃條件下染色24h。

3.2 TTC法測(cè)定多花黃精種子活力的可行性分析 TTC染色法是一種常用于種子活力檢測(cè)的一般方法，其測(cè)定結(jié)果與種子發(fā)芽率較為接近。種子活力的高低對(duì)多花黃精在產(chǎn)業(yè)化育種過(guò)程中至關(guān)重要[15-16]，直接關(guān)系到企業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中的沉默成本，對(duì)于企業(yè)的持續(xù)盈利能力至關(guān)重要。TTC染色法測(cè)定多花黃精種子活力僅需30h，縮短了傳統(tǒng)育種手段測(cè)定種子活力所需的時(shí)間和精力。因此，在生產(chǎn)實(shí)踐過(guò)程中，可使用TTC染色法來(lái)判斷種子的質(zhì)量，進(jìn)而推測(cè)種子潛在的萌發(fā)率。

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（責(zé)編：張宏民）