溫浸法提取黑米中原花青素工藝的研究

◎ 閆高穎，張必榮，曹文娟，張 敏，熊悅清

（陜西天谷生物科技集團有限公司，陜西 西安 710065）

黑米是稻米中的珍貴品種，營養豐富，具有一定的保健作用。《本草綱目》記載，黑米具有滋陰補腎、健脾暖肝、明目活血的功效，又有“補血米”“長壽米”“神仙米”的美稱。黑米含有人體所必需的氨基酸、不飽和脂肪酸、維生素C及鈣、鐵、鋅等礦物營養元素，還含有具藥用價值的黑米原花青素[1-2]。

原花青素（Proanthocyanidind，PC）是植物界中廣泛存在的一大類多酚類化合物，是目前國際上公認的清除人體內自由基有效的天然抗氧化劑，具有清除人體內自由基、抗氧化活性、抗致突變活性等生理作用。近年來，從植物中提取的原花青素作為功能性因子廣泛應用于保健食品加工中，而原花青素基本結構單元的組成模式是其保健功能發揮的物質基礎。

近年來由于原料價格上漲使原花青素生產成本大幅增加，失去了市場競爭中的價格優勢，本項目通過查閱大量文獻[3-7]，發現原花青素的含量對溫度以及酸度比較敏感，因此以原花青素的抗氧化研究為突破口，針對原有的提取工藝進行優化，考察了提取環境對原花青素提取率的影響，提出一套新的工藝，以降低生產成本。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑米：市售；甲醇、乙醇、正丁醇、鹽酸和硫酸亞鐵銨溶液均為國產分析純；原花青素標品購自天津市尖峰天然產物研究開發有限公司。

1.2 儀器與設備

SP22100UV型紫外-可見分光光度計，上海光譜儀器有限公司生產；RE252AA旋轉蒸發器，上海亞榮生化儀器廠生產；DK29821型電熱恒溫水浴鍋，天津市泰斯特儀器有限公司生產；DF204電熱鼓風干燥箱，北京西城區醫療器械二廠生產；JAC-600超聲波中藥處理機，山東濟寧超聲電器有限公司生產。

1.3 黑米原花青素的提取

用粉碎機將干燥的黑米粉碎，精確稱取10.0 g黑米粉末于200 mL容量瓶中，加入所需的60%酸化乙醇溶劑，在60 ℃下經水浴提取1 h。然后減壓過濾，得到原花青素類物質提取液，提取液低溫烘干以備檢測。

1.4 黑米原花青素的測定

精密稱取樣品100 mg于50 mL容量瓶中，加入甲醇溶解定容。精密吸取2 mL于50 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，即為供試液。精密吸取該供試液1 mL于10 mL具塞試管中，加入2%NH4Fe（SO4）2·12H2O的2 mol·L-1鹽酸水溶液0.2 mL，酸性正丁醇溶液6 mL，擰緊密封蓋，搖勻，擰松密封蓋。置95 ℃水浴中加熱反應60 min，取出，在冰水浴中快速冷卻，即得待測樣品溶液。以標準樣品代替樣品，按樣品溶液制備方法，處理即得標準品溶液。以甲醇代替樣品供試液，按樣品溶液處理，即得空白溶液。在546 nm處以樣品空白溶液作為空白，測定標準品溶液和樣品溶液吸收度。

樣品原花青素含量按式（1）計算。

式（1）中，C為原花青素含量（%）；As、A為標準樣品、樣品吸收值；Ws、W為標準樣品、樣品稱樣量（mg）；S為標準樣品含量（%）。

1.5 單因素實驗

1.5.1 提取料液比的確定

用粉碎機將干燥的黑米粉碎。精確稱取10.0 g黑米粉末5份分別于200 mL圓底燒瓶中，加入料液比為1∶10、1∶12、1∶14、1∶16和1∶18的60%醇溶液，60 ℃溫浸提取2次，然后減壓過濾，得到原花青素類物質提取液，低溫烘干以備檢測。計算原花青素的含量，確定最佳提取溶劑濃度。

1.5.2 提取時間的確定

取10.0 g黑米粉末10份，加入60%醇溶液中，提取在料液比為1∶16條件下，溫浸提取的時間為1 h、1.5 h、2 h、2.5 h和3 h，60 ℃提取2次，計算原花青素的含量，確定最佳提取時間。

1.5.3 提取溫度的確定

取10.0 g黑米粉末各5份，加入60%醇溶液，料液比為1∶10，每次溫浸提取1 h，提取2次，在提取溫度為50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃和90 ℃條件下，計算原花青素的含量，確定最佳提取溫度。

1.5.4 提取溶劑加酸量的確定

取10.0 g黑米粉末5份，加入60%酸化乙醇溶液，料液比為1∶16，每次溫浸提取1 h，提取2次，在鹽酸體積分數為0、0.1%、0.2%、0.3%和0.4%條件下，計算原花青素的含量，確定最佳鹽酸加量。

1.6 正交實驗設計

根據溫浸提取單因素的實驗結果，選取提取溫度（A）、鹽酸體積分數（B）、提取時間（C）為主要因素，每個因素各選取3個水平，設計正交實驗，確定最佳提取工藝。溫浸提取正交實驗水平因素見表1。

表1 正交實驗水平因素表

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果分析

2.1.1 提取料液比對原花青素含量的影響

從圖1可知，料液比為1∶16時，提取液中的原花青素含量最高，為25.36 mg·g-1，因此選擇1∶16作為溫浸提取的最佳料液比。

2.1.2 提取時間對原花青素含量的影響

從圖2可知，提取2 h的醇提取液中原花青素的含量最高，為40.69 mg·g-1，選擇提取時間為2 h作為提取的最佳提取時間。

2.1.3 提取溫度對原花青素含量的影響

從圖3可知，提取溫度為70 ℃時，提取液中原花青素的含量最高，為39.82 mg·g-1，因此選擇提取溫度為70 ℃作為溫浸提取的最佳提取溫度。

圖1 提取料液比對原花青素含量的影響圖

圖2 提取時間對原花青素含量的影響圖

圖3 提取溫度對原花青素含量的影響圖

2.1.4 提取溶劑加酸量對原花青素含量的影響

從圖4可知，鹽酸體積分數為0.2%的提取液中原花青素的含量最高，為34.26 mg·g-1，選擇鹽酸加量為0.2%的提取條件作為最佳提取加酸量。

圖4 提取溶劑加酸量對原花青素含量的影響圖

2.2 正交實驗結果分析

按照表1的正交實驗水平因素安排，進行溫浸提取實驗，實驗結果如表2所示，方差分析如表3所示。

表2 正交實驗結果表

表3 方差分析結果表

由表3可知，采用溫浸提取法提取黑米原花青素，以原花青素含量為主要考察指標，各因素對原花青素提取工藝影響的大小為A＞C＞B，即提取溫度＞提取時間＞鹽酸體積分數，其中提取溫度對原花青素的提取率影響最大。在實驗范圍內，最佳的溫浸提取條件是提取時間為2 h，料液比為1∶16，0.1%鹽酸-60%醇，溫度60 ℃，故需要對正交結果進行驗證。

2.3 驗證實驗

通過單因素實驗和正交實驗，選擇最佳提取工藝，并在此條件下進行兩組驗證實驗，驗證實驗結果如表4所示。驗證實驗條件：①提取時間2 h，料液比為1∶16，0.1%鹽酸-60%醇，提取溫度為60 ℃。②提取溫度60 ℃、料液比為1∶16鹽酸體積分數0、提取時間2 h。

表4 驗證實驗結果表

3 結論

溫浸提取的最佳工藝為：提取溶劑為0.1%鹽酸-60%醇，提取料液比1∶16，提取溫度為60℃，提取2次，每次2 h。按此工藝進行中試放大實驗，實驗結果表明，該工藝下的平均產品回收率為149.3%，提取物的平均含量為32.1mg·g-1，相比于傳統工藝，新工藝提取法所得結果比老工藝提取法所得產品收率更高，該提取工藝穩定，可用于大批量生產。