miR-20a-5p 調節VEGF 通路在氧誘導視網膜病變小鼠模型中的作用機制

黃潤英,范智利,肖吉群,鄭 巍,蔡 強

(宜賓市第二人民醫院兒科, 四川宜賓 644000)

病理性新生血管增生造成的早產兒眼部疾病,已成為當今發展中國家和發達國家兒童失明的主要原因, 氧誘導視網膜病變( oxygen-induced retinopathy, OIR)小鼠模型是目前與新生血管增生較為類似模型,且最常見[1];及早治療可有效改善視功能, 目前抗血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)治療已具有滿意效果[2],合適的抗VEGF 是治療的關鍵。 多種促血管微小RNA(microRNA, miRNA)和抗血管miRNA 共同調控血管新生,引起 VEGF 異常表達[3]。 miR-20a-5p 是miR-17-92 家族成員之一,抑制 miR-17、miR-20 可增加血管生成[4],miR-20a-5p 表達水平影響炎癥反應、細胞增殖、細胞凋亡、組織修復、細胞外基質重塑、血管新生以及惡性病變等多種病理機制[5],且在第37 屆圣安東尼奧乳腺癌研討會上已作為抗VEGF 因子用于治療乳腺癌[6],但是否可用于OIR 治療尚不清楚。 因此,建立 OIR 模型,觀察miR-20a-5p 對OIR 小鼠的影響并初步探討其機制,為OIR 靶向治療提供一定參考。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

健康無特定病原體動物(specific pathogen free,SPF)級 96 只 C57BL/6J Nifdc 新生小鼠 7 日齡,體重(5.2±0.5)g,購自北京維通利華實驗動物技術有限公司[SCXK(京)-20180045],雌雄不限。 所有動物在宜賓市第二人民醫院動物飼養中心動物飼養[SYXK(京)-2019-0105],并經本院倫理委員會批準(IACUC-20190018),實驗過程符合3R 原則,且遵守視覺與眼科學研究會制定的關于科研動物規范。

1.2 主要試劑與儀器

miR-20a-5p agomir 購自廣州銳博生物科技有限公司;引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成;實時熒光定量PCR(Quantitative real-time PCR,qRT-PCR)試劑盒購自賽默飛世爾,貨號:K1622;蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin, HE)染色試劑盒購自碧云天科技有限公司,貨號:C0105;VEGF 抗體購自英國abcam 公司,貨號:ab32152;眼科裂隙燈顯微鏡購自意大利CSO 公司,型號:SL990/SL980;氧箱購自寧波華儀寧創智能科技有限公司,型號:Attendor-110pro;qRT-PCR 儀購自美國ABI 公司,型號:ViiA7。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗分組及OIR 小鼠模型建立

實驗前對所有小鼠在眼科裂隙燈顯微鏡下檢查眼部,均未發現異常。 實驗分為正常組、模型組、高氧對照組、miR-20a-5p 高表達組,每組24 只。 除正常組外,其余各組參照文獻[7]在出生后第7 天建立OIR 小鼠模型,測氧儀時刻監測氧濃度,小鼠置于氧濃度(75.00±2.00)%氧箱中,12 h 光照12 h 黑暗,高氧環境5 d 后置于常氧中飼養,在高氧環境結束前一天(出生后第11 天)開始,每組左眼作為陰性對照,右眼高氧對照組玻璃體腔內注射1 μL 磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline, PBS),miR-20a-5p 高表達組右眼玻璃體腔內注射1 μL miR-20a-5p 激動劑(miR-20a-5p agomir)(1 μmol/L),處理完后立即置于氧箱中,模型組不進行任何處理,1 d 后所有小鼠出氧箱。 正常組小鼠一直置于空氣中正常飼養。 高氧環境結束后各組小鼠正常空氣再飼養5 d(出生后第17 天)進行實驗。

1.3.2 qRT-PCR 檢測視網膜組織 miR-20a-5p、VEGF、血管內皮生長因子受體(VEGF receptor,VEGFR)-1、VEGFR-2 表達情況

每組隨機取8 只小鼠,右眼取視網膜組織,剪碎,加TRIzol 裂解。 氯仿、異丙醇法提取總RNA,并反轉錄為cDNA,參照qRT-PCR 試劑盒說明操作進行實驗。 引物序列:miR-20a-5p F:5’-ATGCTAAA GTGCTTATAGT-3’、 R: 5’-CAGTGCAGGGTCCGAG GTATTC-3’, U6 F: 5’-CGCTTCGGCAGCAGCACA TATAC-3’、R:5’-AATTTGCGTGTCATCCTTGC-3’,VEGF F:5’-GCTCTACCTCCACCATGCCAAGTGGTC CCA-3 ’、 R: 5 ’-GACCCTGGTGGACATCTTCCAG GAGTACCC-3 ’, VEGFR-1 F: 5 ’-CCACCTCCAT GTTTGAAGAC-3’、 R: 5’-TACCAGCAGTCTGCTG ACCTCCCC-3 ’, VEGFR-2 F: 5 ’-CTCCATCTTTT GGTGGGATG-3’、 R: 5’-AGGCCACAGACTCCCTG CTTTTACTG-3’, β-actin F: 5’-AAGACCTCTATG CCAACACAG-3’、R:5’-GGAGGAGCAATGATCTTG ATC-3’。 上樣體系均為 20 μL:cDNA 1 μL(50 ng/μL),F/R(10 μmol/L)各 0.5 μL,2×Mix 10 μL,ddH2O 8.0 μL。 反應條件:95℃、10 min;95℃、15 s,62℃、30 s(miR-20a-5p)/60 s(VEGF、VEGFR-1、VEGFR-2),40 個循環。 2-ΔΔCT法計算 miR-20a-5p、VEGF、VEGFR-1、VEGFR-2 表達水平。

1.3.3 視網膜鋪片觀察視網膜血管形態

每組隨機取8 只小鼠,右眼進行視網膜鋪片。1%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉小鼠,左心室灌注4%多聚甲醛5 min 立即摘除右眼并固定,去除眼前節,保留完整視網膜組織。 經漂洗、孵育、顯色、甘油明膠封片,顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.4 HE 染色計數視網膜新生血管內皮細胞核情況

每組剩余8 只小鼠立即處死并摘取右眼,經4%多聚甲醛固定,切片后部分經脫蠟、復水、染色,再脫水、透明、封片進行HE 染色。 隨機、雙盲法顯微鏡下計數突破視網膜內界膜的新生血管內皮細胞核數量。 且僅計數與內界膜有緊密聯系的細胞核,不計數與內界膜無聯系的血管內皮細胞核。

1.3.5 免疫組化檢測視網膜組織中VEGF 陽性細胞情況

1.3.4 中切片同HE 方法脫蠟、復水步驟,熱修復抗原、5%脫脂奶粉封閉后,滴加一抗VEGF(陰性對照用同型同種鼠IgG 代替一抗)2 h,滴加二抗20 min 后DAB 顯色,蘇木素復染核,分色、脫水、透明、封片。 光學顯微鏡拍照。 每張切片在高倍顯微鏡下隨機選擇10 個視野,采用 MetaMorph/Evolution MP5.0/BX51 分析軟件測量陽性細胞積分光密度(integrated od total,IOD)值。 陽性面積百分比=IOD/總面積×100%。

1.4 統計學方法

采用SPSS 25.0 軟件進行統計學分析,計量數據均采用平均數±標準差()表示,先采用單因素方差分析各組間總體比較,若存在差異則使用SNK-q檢驗行組間兩兩比較。P＜0.05,差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-20a-5p 在各組小鼠視網膜組織中表達情況

與正常組相比,模型組、高氧對照組視網膜組織中miR-20a-5p 水平降低(P＜0. 05);分別與模型組、高氧對照組相比,miR-20a-5p 高表達組視網膜組織中miR-20a-5p 水平升高(P＜0. 05)。見表1。

2.2 miR-20a-5p 對小鼠視網膜血管形態的影響

正常組小鼠視網膜血管基本成熟,自視盤向周圍發出放射狀大血管,呈均勻分布,分支狀態良好延伸至視網膜周邊部位。 模型組和高氧對照組自視盤向周圍發出的放射狀大血管迂回、不規則擴張,出現大量新生血管,新生血管結構及分布紊亂,且周邊毛細血管網閉塞。 miR-20a-5p 高表達組自視盤向周圍發出的放射狀大血管迂回不明顯、不規則擴張減輕,新生血管明顯減少。 見圖1。

2.3 miR-20a-5p 對小鼠新生血管內皮細胞核數量的影響

與正常組相比,模型組、高氧對照組視網膜血管內皮細胞核數量升高(P＜0.05);分別與模型組、高氧對照組相比,miR-20a-5p 高表達組視網膜血管內皮細胞核數量降低(P＜0.05)。 見圖2、表2。

表1 4 組小鼠視網膜組織中miR-20a-5p 表達水平比較( ,n=8)Table 1 Comparison of miR-20a-5p expression in retina of mice in 4 groups

表1 4 組小鼠視網膜組織中miR-20a-5p 表達水平比較( ,n=8)Table 1 Comparison of miR-20a-5p expression in retina of mice in 4 groups

注:與正常組相比,#P＜0.05;與模型組相比,*P＜0.05;與高氧對照組相比,&P＜0.05。Note. Compared with normal group, #P ＜0.05. Compared with model group, *P ＜ 0.05. Compared with hyperoxia control group, &P ＜ 0.05.

組別Groups miR-20a-5p正常組Normal group 1.01±0.14模型組Model group 0.42±0.06#高氧對照組Hyperoxia control group 0.43±0.05#miR-20a-5p 高表達組miR-20a-5p overexpression group 1.38±0.15*&F P 146.368 0.000

2.4 miR-20a-5p 對小鼠視網膜組織中VEGF 陽性細胞的影響

VEGF 陽性表達呈棕黃色,模型組和高氧對照主要存在視網膜內界膜附近、神經節細胞層和內核層。 miR-20a-5p 高表達組主要存在神經節細胞層和內核層。 與正常組相比,模型組、高氧對照組視網膜中VEGF 蛋白陽性面積百分比升高(P＜0.05);分別與模型組、高氧對照組相比,miR-20a-5p 高表達組視網膜中VEGF 蛋白陽性面積百分比降低(P＜0.05)。 見圖 3、表 3。

表2 4 組小鼠視網膜血管內皮細胞核數量比較( ,n=8)Table 2 Comparison of nuclear number of retinal vascular endothelial cells in 4 groups

表2 4 組小鼠視網膜血管內皮細胞核數量比較( ,n=8)Table 2 Comparison of nuclear number of retinal vascular endothelial cells in 4 groups

注:與正常組相比,#P＜0.05;與模型組相比,*P＜0.05;與高氧對照組相比,&P＜0.05。Note. Compared with normal group, #P ＜0.05. Compared with model group, *P ＜ 0.05. Compared with hyperoxia control group, &P ＜ 0.05.

組別Groups血管內皮細胞核(個)Endothelial cell nucleus (n)正常組Normal group 3.16±0.16模型組Model group 25.35±3.15#高氧對照組Hyperoxia control group 25.94±3.47#miR-20a-5p 高表達組miR-20a-5p overexpression group 16.48±2.18*&F P 135.347 0.000

圖1 4 組小鼠視網膜血管形態情況Figure 1 The morphology of retinal vessels in 4 groups

圖2 4 組小鼠視網膜形態情況(HE 染色)Figure 2 Retinal morphology of the 4 groups of mice(HE staining)

2.5 miR-20a-5p 對小鼠視網膜組織中 VEGF、VEGFR-1、VEGFR-2 mRNA 水平的影響

與正常組相比,模型組、高氧對照組視網膜組織中 VEGF、VEGFR-1、VEGFR-2 mRNA 表達水平升高(P＜0.05);分別與模型組、高氧對照組相比,miR-20a-5p 高表達組視網膜中 VEGF、VEGFR-1、VEGFR-2 mRNA 表達水平降低(P＜0.05)。 見表 4。

3 討論

OIR 表現為局部新生血管生成,會導致牽拉性視網膜脫落、并發性白內障、繼發性青光眼等,還可引起斜視、弱視等并發癥,影響患兒健康[8]。 本研究發現,與正常組相比,模型組小鼠視網膜組織視盤向周圍發出的放射狀大血管迂回、不規則擴張,大血管出現混亂,可能影響功能,促使出現大量新生血管,新生血管結構及分布紊亂,且周邊毛細血管網閉塞,新生血管短暫時間內補償大血管功能;但新生血管會破壞視網膜原有功能,誘發疾病。 及時有效的治療是減少該病致盲的主要方法。

表3 4 組小鼠視網膜中VEGF 蛋白表達水平比較( ,n=8)Table 3 Comparison of VEGF protein expression in retina of 4 groups

表3 4 組小鼠視網膜中VEGF 蛋白表達水平比較( ,n=8)Table 3 Comparison of VEGF protein expression in retina of 4 groups

注:與正常組相比,#P＜0.05;與模型組相比,*P＜0.05;與高氧對照組相比,&P＜0.05。Note. Compared with normal group, #P ＜0.05. Compared with model group, *P ＜ 0.05. Compared with hyperoxia control group, &P ＜ 0.05.

組別Groups 陽性面積百分比(%)正常組Normal group 3.15±0.46模型組Model group 63.85±13.05#高氧對照組Hyperoxia control group 65.03±12.34#miR-20a-5p 高表達組miR-20a-5p overexpression group 13.15±3.51*&F 102.470 P 0.000

VEGF 被認為是啟動新生血管最為重要的細胞因子,可選擇性地增強血管內皮細胞和淋巴管細胞的有絲分裂,促進內皮增生、遷移和分化,同時抑制內皮細胞老化和抗凋亡[9];可增加小靜脈通透性,促使血漿大分子外滲,外滲蛋白可形成纖維蛋白原,從而支持內皮細胞生長,為建立新生血管網提供可能[10]。 VEGFR 作為 VEGF 受體,屬跨膜酪氨酸激酶受體,其中VEFFR1 可介導內皮細胞遷移從而促進血管新生[11];VEGFR2 是VEGF 介導血管生成的主要受體,激活VEGFR2 可促進內皮細胞分裂、增殖,進而促進血管生成[12]。 在 OIR 中抑制VEGF 的表達可抑制 VEGFR2 的表達[13]。 本研究發現,與正常組相比,模型組VEGF 陽性表達呈棕黃色,主要存在視網膜內界膜附近、神經節細胞層和內核層,VEGF、VEGFR-1、VEGFR-2 mRNA 水平升高,提示在OIR 視網膜組織中VEGF 及其受體均處于激活狀態,VEGF 結合其受體增加小靜脈通透性,促使血漿大分子外滲,外滲蛋白加速形成纖維蛋白原,加速內皮細胞遷移、生長過程,促進內皮細胞增生,加速新生血管生成,進而影響視網膜功能。

圖3 4 組小鼠視網膜VEGF 蛋白表達情況(免疫組化染色)Figure 3 expression of VEGF protein in retina of 4 groups (immunohistochemical staining)

表4 4 組小鼠視網膜組織中VEGF、VEGFR-1、VEGFR-2 mRNA 表達水平比較( ,n=8)Table 4 Comparison of mRNA expression levels of VEGF, VEGFR-1 and VEGFR-2 in retina of mice in 4 groups

表4 4 組小鼠視網膜組織中VEGF、VEGFR-1、VEGFR-2 mRNA 表達水平比較( ,n=8)Table 4 Comparison of mRNA expression levels of VEGF, VEGFR-1 and VEGFR-2 in retina of mice in 4 groups

注:與正常組相比,#P＜0.05;與模型組相比,*P＜0.05;與高氧對照組相比,&P＜0.05。Note. Compared with normal group, #P ＜ 0.05. Compared with model group, *P ＜ 0.05. Compared with hyperoxia control group, &P ＜ 0.05.

組別Groups VEGF VEGFR-1 VEGFR-2正常組 Normal group 0.98±0.15 0.99±0.14 1.00±0.15模型組 Model group 4.15±0.31# 2.75±0.25# 1.98±0.08#高氧對照組 Hyperoxia control group 4.17±0.29# 2.76±0.24# 1.96±0.12#miR-20a-5p 高表達組miR-20a-5p overexpression group 1.38±0.25*& 1.93±0.17*& 1.32±0.09*&F 360.406 134.053 146.822 P 0.000 0.000 0.000

抗VEGF 已經成為治療ROP 的重要靶位點之一[14]。 眼科血管疾病靶向治療中主要策略為抗VEGF 抑制劑和miRNA 為核心的基因治療[15],其中miRNA 作為單鏈小分子非編碼RNA,參與轉錄后基因調控,在真核生物中存在廣泛,且高度保守;構建miRNA 模擬物或抑制劑調節信號通路、靶基因等,抑制VEGF 通路或其受體表達可達到治療疾病目的[16-17]。 miR-17-92 基因簇在人和小鼠的多種組織中廣泛表達,包括 miR-17、miR-18a、miR-19a、miR-19b-1、miR-20a、miR-92-1[18]。 miR-17 和 VEGF 在血管性癡呆中關系密切,影響血管受損后修復、神經元損傷等過程[19]。 miR-20a 與血管新生關系密切,調節miR-20a 水平可以影響血管新生狀況[20]。本研究發現,OIR 視網膜組織中miR-20a-5p 表達降低,升高miR-20a-5p 后可抑制視網膜組織中VEGF、VEGFR1、VEGFR2 mRNA 水平,降低視網膜血管內皮細胞核數量,使放射狀大血管迂回不明顯,血管不規則擴張現象減輕,新生血管明顯減少,從而改善血管狀態。

綜上所述,miR-20a-5p 可能抑制VEGF 通路減少OIR 小鼠視網膜血管新生,亦可能影響其他信號通路,從而減少OIR 小鼠視網膜血管新生,為OIR靶向治療提供一定參考。