基于SDF-1/CXCR4 信號通路探討新安鼻淵方流浸膏對急性鼻竇炎大鼠嗅上皮神經元細胞凋亡的影響

張 田,喻國凍,顧 平,葉惠平,金 瑩

(貴州醫科大學附屬醫院 耳鼻咽喉科,貴陽 550004)

急性鼻竇炎是一種鼻竇黏膜的炎癥性疾病[1],作為耳鼻喉科最常見的疾病之一,在全球范圍內具有較高的發病率。 在我國,急性鼻竇炎的發病率逐年增加,主要臨床癥狀包括頭痛,鼻塞、記憶力下降等[2],其病情反復,難以治愈,嚴重影響患者的身心健康,是臨床上亟需解決的健康問題。 目前,關于鼻竇炎的治療手段主要是采用鼻內鏡外科手術及抗炎藥物[3-4],對于患者創傷性大,而且預后效果不佳,存在復發率高、耐藥性以及其他不良反應等一系列問題。 新安鼻淵方流浸膏由中草藥敗醬草、黃芪等藥物組成,主要用于治療急、慢性鼻竇炎,起效迅速,且經過長期臨床使用證實其療效確切[5]。 但是對于新安鼻淵方流浸膏改善急性鼻竇炎的機制研究還未見報道,因此本研究通過建立大鼠急性鼻竇炎模型來探討新安鼻淵方流浸膏對大鼠急性鼻竇炎嗅上皮神經元細胞凋亡影響的相關機制,為進一步研究以及臨床用藥提供客觀的理論依據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

8～10 周齡 SPF 級 SD 雄性大鼠,體重(200±20) g 40 只購自北京維通利華實驗動物技術有限公司[SCXK(京)2016-0011],依照我院最新的動物實驗管理辦法,實驗動物均在本實驗室SPF 級動物房飼養[SYXK(黔)2018-0001],每籠 3 ～4 只動物,自由飲水、攝食,12 h 光照/ 12 h 黑暗,溫度 20℃ ～25℃,相對濕度 40%～70%。,適應性喂養一周后入組,進行相應的操作。 整個動物實驗期間嚴格按實驗動物3R 原則給予實驗動物人道主義關懷,本實驗獲本院倫理委員會批準(IACUC2018-027)。

1.2 主要試劑與儀器

新安鼻淵方流浸膏由我院中藥制劑實驗室制備;金黃色葡萄球菌由我院微生物室從患者標本中分離獲得;AMD3100 購買于美國Sigma 公司;TNF-α、IL-1β 酶聯免疫試劑盒以及 AEC 顯色試劑盒、PBS 購買于北京索萊寶科技有限公司;嗅標記蛋白(olfactorymarkerprotein,OMP)、TUNEL、SDF-1 以及CXCR4 免疫組化試劑以及 cleaved caspase 3、Bax 以及Bcl-2 一抗試劑盒購買于英國Abcam 公司;切片機(Leica,德國);倒置顯微鏡(OLYMPUS,日本);高速離心機(Eppendorf,德國);紫外分光光度計(Thermo,美國);超低溫冰箱(Siemens,德國)。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組及建模

本研究中40 只大鼠分為4 組每組10 只,包括對照組,模型組(急性鼻竇炎),治療組(急性鼻竇炎+新安鼻淵方流浸膏),抑制劑組(急性鼻竇炎+CXCR4 特異性抑制劑AMD3100)。 除對照組外,其余各組大鼠均構建急性鼻竇炎模型,建模過程如下:麻醉大鼠,剃除鼻背部毛、沿鼻中線部位皮下注射利多卡因麻醉大鼠,切開皮膚,分離粘膜以暴露上頜竇前壁區,可見左側上頜竇前壁,暴露上頜竇骨壁,采用2 mm 鉆頭鉆開上頜竇前壁,將無菌生物止血棉塞入竇腔,0.2 mL 金黃色葡萄球菌懸液注入竇腔,縫合傷口,對照組注射等量無菌生理鹽水代替,其余操作與同上。 造模后第7 天開始采用灌胃方式連續給藥1 周,每天1 次。 其中治療組給藥新安鼻淵方流浸膏按照大鼠體重計算(7 g/kg),抑制劑組給予1 mg/kg AMD3100,對照組以及模型組灌胃等量的生理鹽水。 模型的建立通過大鼠鼻竇炎癥狀評分進行檢測[5]:于給藥前、末次給藥后1 h 分別觀察30 min 內大鼠鼻竇炎癥狀,評分規則如表1,鼻竇炎癥狀評分總計大于7 分認為模型建立成功。

1.3.2 鼻粘膜組織炎性細胞因子檢測

將各組大鼠處死后,分離鼻粘膜并用生理鹽水洗滌,收集鼻腔流出液體,離心取上清,采用酶聯免疫吸附試劑盒對各組大鼠鼻腔灌洗液中炎性因子TNF-α 以及 IL-1β 的濃度進行測定。 使用多功能酶標儀檢測450 nm 處吸光度,用標準細胞因子以及對應濃度作標準曲線,根據標準曲線計算各組樣本中TNF-α 以及 IL-1β 的濃度。

1.3.3 免疫熒光觀察OMP 蛋白的表達

處死動物后,用手術刀劃取左側竇口1 mm×1 mm 大小鼻頂部黏膜,4%甲醛溶液固定,常規石蠟切片。 切片經PBS 漂洗后加入蛋白酶K-鹽酸緩沖液恒溫孵育20 min,再經PBS 漂洗后加入山羊血清封閉30 min;滴加稀釋好的(1 ∶500)山羊抗鼠OMP,4℃過夜;再加稀釋好的(1 ∶500)兔抗山羊熒光二抗,PBS 漂洗后甘油封片,置于熒光顯微鏡下觀察并拍照記錄。

1.3.4 HE 以及免疫組化檢測

將上述制備好的各組大鼠的石蠟切片采用二甲苯脫蠟,乙醇脫水,過氧化物酶滅活,血清封閉后分別加入SDF-1 以及CXCR4 的一抗,4℃ 條件下過夜孵育;加入二抗,孵育30 min 后加入鏈霉素卵白素工作液并在37℃條件下孵育30 min;使用DAB顯色,顯微鏡下觀察染色情況。 陽性細胞表示為細胞質呈棕黃色或棕褐色,并采用Image J 軟件對于對各組光密度值進行統計。

1.3.5 TUNEL 染色檢測各組大鼠嗅上皮神經元細胞的凋亡

取各組大鼠嗅上皮組織,常規方法固定,石蠟包埋切片,二甲苯浸洗兩次,梯度乙醇浸洗5 min,風干后3%雙氧水-甲醇浸泡10 min,PBS 漂洗3 次,每次3 min,然后4℃預冷乙醇上進行如下操作:0.1%TRItonX-100、0.1%緩沖液處理2 min,PBS 漂洗3 次,每次3 min,加入TUNEL 反應混合液,封口膜密封,暗濕盒反應1 h,溫度37℃,PBS 漂洗,梯度乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹脂封片,顯微鏡進行觀察,采用Image J 軟件對各組光密度值進行分析。

表1 急性鼻竇炎癥狀評分標準Table 1 Score criteria for acute sinusitis symptoms

1.3.6 Western blot 檢測

將各組大鼠嗅上皮組織樣本加入300 μL RIPA裂解液,裂解10 min 后離心5 min(15000 r/min),收集上清。 每組上樣20 μg 蛋白樣本。 將蛋白樣品和上樣緩沖液混合均勻,100℃水浴變性3 min,采用10% SDS-PAGE 分離膠電泳,轉膜,室溫封閉2 h,加入稀釋后的 cleaved caspase 3 一抗(1 ∶1000)、Bax 一抗(1 ∶500)、Bcl-2 一抗(1 ∶500)、β-actin 一抗(1 ∶2500),搖床 4℃孵育過夜。 復溫后用 PBST 洗滌PVDF 膜三次后加入 HRP 標記的山羊抗鼠 IgG,37℃孵育2 h 之后ECL 顯影拍照,保存圖像, Image J 軟件分析條帶的灰度值,以β-actin 作為內參計算各蛋白的相對表達。

1.4 統計學方法

采用軟件 SPSS 21.0、GraphPad Prism 5 對實驗數據進行統計學分析,數據表示為平均數±標準差(ˉx±s),兩組數據間比較采用獨立t檢驗,P＜0.05 表示具有統計學差異。

2 結果

2.1 大鼠鼻竇炎癥狀評分

給藥前模型組與各給藥組評分相比,評分無統計學差異(P＞0.05),模型組和各治療組評分結果顯著高于對照組(P＜0.05)。 給藥后模型組評分顯著高于對照組,各治療組評分顯著低于模型組(P＜0.05),治療組與抑制劑組組在評分上相比無統計學差異(P＞0.05)見表2。

2.2 OMP 熒光標記結果

成熟的嗅上皮神經細胞OMP 熒光染色后紅色熒光表示陽性,本實驗中標本切片為OMP 陽性細胞,說明實驗取材位置為嗅覺黏膜,可用于后續的實驗研究,見圖1。

2.3 大鼠嗅上皮組織HE 染色以及炎性因子檢測

與對照組比較,模型組大鼠嗅上皮組織損傷嚴重,且 TNF-α 以及 IL-1β 顯著增加(P＜0.05);治療組與模型組相比嗅上皮組織損傷減輕,TNF-α 以及IL-1β 表達明顯降低(P＜0.05);治療組組與抑制劑組相比,炎性因子 TNF-α 以及 IL-1β 表達無顯著差異(P＞0.05),見圖 2。

2.4 大鼠嗅上皮神經元細胞凋亡

與對照組比較,模型組大鼠嗅上皮神經元細胞凋亡顯著增多(P＜0.05);與模型組相比,治療組組與抑制劑組大鼠嗅上皮神經元細胞凋亡減少(P＜0.05),治療組與抑制劑組相比無明顯差異(P＞0.05)見圖 3。

2.5 大鼠嗅上皮組織SDF-1、CXCR4 的蛋白表達

相比于對照組,模型組大鼠嗅上皮組織SDF-1、CXCR4 的蛋白表達顯著升高(P＜0.05);治療組與抑制劑組大鼠與模型組相比嗅上皮組織SDF-1、CXCR4 的蛋白表達明顯降低(P＜0.05);治療組與抑制劑組相比無明顯差異(P＞0.05),見圖4。

2.6 大鼠嗅上皮組織caspase-3、Bax 以及Bcl-2 的表達

相比于對照組,模型組大鼠嗅上皮組織重促凋亡蛋白cleaved caspase 3、Bax 的表達顯著升高(P＜0.05),抗凋亡蛋白Bcl-2 表達水平明顯降低(P＜0.05);治療組與抑制劑組大鼠與模型組相比嗅上皮組織促凋亡蛋白cleaved caspase 3、Bax 的表達明顯降低(P＜0.05)抗凋亡蛋白Bcl-2 的表達顯著增加(P＜0.05);治療組與抑制劑組相比無明顯差異(P＞0.05),見圖 5。

3 討論

急性鼻竇炎是發生于鼻竇粘膜的一種炎癥性疾病,主要病理特征為各種竇口狹窄或阻塞,以及黏膜纖毛功能發生障礙。 作為耳鼻咽喉科的常見病和多發病,其主要的臨床表現為嗅覺功能障礙,同時會伴有鼻塞、鼻癢、流涕、打噴嚏、頭痛、頭昏等癥狀[6]。 其病因復雜,發病機制尚不明確,牽涉因素眾多,可能與細菌感染、過敏反應、環境因素等多種因素有關[7-9]。 在急性期若沒有得到及時治療則會轉變為慢性鼻竇炎,嚴重影響患者正常生活。

近年來,中藥應用于鼻炎的研究受到眾多研究者的重視[10-11]。 新安鼻淵方流浸膏主要包含中藥敗醬草、黃芪、魚腥草、辛夷等[12-13]。 該方具有清熱解毒、祛瘀排膿、止痛通竅的功效。 敗醬草具清熱解毒、排膿消癰、止痛之功,被廣泛用于治療肺經蘊熱、膽經(腑)郁熱所導致的鼻淵癥狀[14]。 黃芪能排膿通竅,補益正氣,斂瘡生肌,現代藥理學證實其可增強機體免疫[15]。 相關研究[5]表明新安鼻淵方流浸膏對于急性鼻竇炎有很好的治療效果。 常見的急性鼻竇炎致病菌有金黃色葡萄球菌、肺炎雙球菌等[16],因此本研究中,采用金黃色葡萄球菌構建急性鼻竇炎大鼠模型。 結果表明模型組大鼠鼻竇炎癥狀評分以及嗅上皮神經元細胞凋亡比例顯著多于對照組,證明模型建立成功。 新安鼻淵方流浸膏組大鼠的嗅上皮神經細胞凋亡以及凋亡相關蛋白的表達明顯低于模型組,表明新安鼻淵方流浸膏對于大鼠急性鼻竇炎具有明顯的改善作用。 但是,對于新安鼻淵方流浸膏治療急性鼻竇炎的相關機制目前仍不清楚。 因此,本研究構建大鼠急性鼻竇炎模型來探究新安鼻淵方流浸膏對于鼻竇炎的調節作用以及其相關機制。

圖1 OMP 免疫熒光結果Figure 1 Results of OMP immunofluorescence

圖2 HE 染色觀察各組大鼠鼻黏膜病理變化Note. A, Control group. B, Model group. C, Treatment group. D,Inhibitor group. Compared with the control group, *P ＜0.05.Compared with the model group, #P ＜0.05. The same as below.Arrow indicates eosinophilic infiltration.Figure 2 Pathological changes of nasal mucosa of rats in each group were observed by HE staining

圖3 各組大鼠嗅上神經元細胞凋亡Figure 3 Apoptosis of upper olfactory neurons in each group

圖4 免疫組化檢測各組大鼠SDF-1、CXCR4 的表達Figure 4 Expression of SDF-1 and CXCR4 in each group was detected by immunohistochemistry

圖 5 caspase-3、Bax 以及 Bcl-2 蛋白表達水平Note. A, Control group. B, Model group. C, Treatment group. D,Inhibitor group. Compared with control group,*P＜0.05.Compared with the model group,#P＜0.01.Figure 5 Expression levels of cleaved caspase 3, Bax and Bcl-2

表2 給藥前后大鼠鼻竇炎評分表(n=10)Table 2 Scores of sinusitis of rats before and after administration

近年來,趨化因子受體 CXCR4 以及 SDF-1/CXCR4 相互作用形成的信號通路由于參與多種疾病的發生以及發展而備受關注[17]。 其中SDF-1 作為一種趨化因子,由炎性反應因子如TNF-α、IL-1β所誘導,由于其對炎性反應細胞具有強大的趨化能力,因此常被作為炎性反應的特異性指標。 此外,CXCR4 是一個G 蛋白偶聯受體,作為SDF-1 唯一的受體,CXCR4 多表達于免疫細胞之中,對細胞生長發育至關重要。 目前,研究證明SDF-1/CXCR4 信號通路對細胞凋亡具有明顯的調節作用[18-19]。 此外,相關研究[20-21]表明SDF-1/CXCR4 在鼻炎鼻粘膜中呈現高表達現象,提示該通路參與鼻炎鼻粘膜病變的發生和發展。 B 淋巴細胞瘤-2(Bcl-2)是一種抗凋亡蛋白,以線粒體為單位參與細胞凋亡的調控,其同源二聚體X 蛋白(Bax)是一種促凋亡蛋白,Bcl-2 和Bax 是在凋亡調控過程中功能對立的一對重要的調控基因,cleaved caspase 3 作為凋亡過程中最關鍵的凋亡執行蛋白酶誘發細胞凋亡[22-23]。 眾多研究[24-25]證實:SDF-1/CXCR4 通路的激活導致 Bax、cleaved caspase 3 等促凋亡蛋白表達升高,抗凋亡蛋白Bcl-2 表達降低最終誘發細胞凋亡。 本研究中,相比于模型組,治療組大鼠SDF-1 以及CXCR4 的表達顯著降低,同時促凋亡蛋白表達明顯降低,抗凋亡相關蛋白的表達顯著增高,而給予CXCR4 特異性抑制劑AMD3100 處理后,大鼠病理變化與治療組相似。 以上結果提示,新安鼻淵方流浸膏對于急性鼻竇炎大鼠嗅上神經元細胞凋亡的改善作用可能是通過抑制SDF-1/CXCR4 信號通路實現的。

綜上所述,本研究通過建立大鼠急性鼻竇炎模型驗證了新安鼻淵方流浸膏可能通過抑制SDF-1/CXCR4 的表達,從而抑制嗅上皮神經元細胞的凋亡,最終改善急性鼻竇炎癥狀。 然而急性鼻竇炎的發生發展涉及因素眾多,機制復雜,因此新安鼻淵方流浸膏改善變急性鼻竇炎嗅上皮神經元細胞凋亡的具體機制有待深入研究。