針刺通過調節GABA-Gln 代謝對失眠大鼠癥狀的改善及對自發活動的影響

邢春蕊,陳應奇,孫 曌,劉英蓮

(1.海口市人民醫院健康管理體檢科, 海口 570802; 2.海南醫學院中醫學院,海口 570802)

隨著社會快速發展,生活節奏不斷加快以及工作壓力的增加,現代人失眠發病率不斷上升。 失眠是一種睡眠障礙類疾病,表現為入睡困難、睡眠維持時間短、早醒等[1]。 長時間失眠可導致一系列健康和心理問題,可誘發心腦疾病、糖尿病等,并可伴發抑郁癥,嚴重影響患者身體健康和生活質量[2-3]。目前臨床上治療失眠主要有藥物療法和非藥物療法,長期使用藥物治療,易產生耐藥性及藥物成癮性,存在較大隱患。 中醫認為,睡眠是一個節律性生理過程,正常睡眠與人體陰陽及五臟氣血密切相關,失眠主要由機體陰陽失衡、氣血不足、臟腑功能失調及痰淤阻滯所致[4]。 針灸可以調虛實、平陰陽、通經脈,通過針刺特定穴位治療失眠,經濟、安全,且無副作用,被患者廣泛接受[5]。 針刺治療失眠臨床療效顯著,但其具體作用機制報道較少,本研究采用針刺特定穴位,評價其對對失眠大鼠癥狀的改善及自發活動的影響,并對其具體作用機制進行探討,以期為臨床治療失眠提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

45 只 SD 大鼠,雄性,SPF 級,7 周齡,體重(200±20)g,購自北京維通利華實驗動物技術有限公司[SCXK(京)2016-0006],飼養于海南斯達制藥有限公司實驗動物中心[SYXK(瓊)2016-0006],保持環境溫度20℃～25℃,相對濕度45%～65%,適應性飼養1 周。 本研究經海南醫學院中醫學院動物倫理委員會批準(201803060027),實驗過程給予人道關懷,符合3R 原則。

1.2 主要試劑與儀器

地西泮片(批準文號:國藥準字H11020898,北京益民藥業有限公司,每片2.5 mg);對氯苯丙氨酸(p-chlorophenylalanine, PCPA)、谷氨酸(glutamate,Glu)、γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid, GABA)標準品(美國Sigma 公司);質譜級甲醇(美國Fisher 公司); 兔抗大鼠谷氨酸脫羧酶( glutamate decarboxylase, GAD) 多 抗、 谷 氨 酰 胺 合 成 酶(glutamine synthetase, GS)多抗[英國艾博抗(上海)貿易有限公司];HRP 標記的山羊抗兔IgG(北京中衫金橋生物技術有限);Synapt G2 超高效液相色譜-四級桿飛行時間串聯質譜儀(美國Water 公司);實時熒光定量PCR 儀、Varioskan LUX 酶標儀(美國 Thermo Fisher 公司);DYY-6C 電泳儀(美國Bio-RAD 公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 建模及分組

取35 只大鼠,采用腹腔注射PCPA 法[6]建立失眠大鼠模型,按400 mg/kg 大鼠體重稱取PCPA,研磨成細粉,加入適量生理鹽水,待研磨成泡沫狀后,用生理鹽水配制成100 mg/mL 的混懸液備用,臨用前震蕩調勻。 造模開始后,于每日上午 8 ∶00～10 ∶00腹腔注射PCPA,每天1 次,連續2 d。 模型判定標準[7]:第一次注射PCPA 后28～30 h,大鼠出現性情煩躁、晝夜節律紊亂、興奮性和攻擊性增強,大便灰白等表示造模成功。 造模成功大鼠30 只隨機分為失眠組、針刺組、西藥組,每組各10 只。 剩余10 只為對照組,腹腔注射等量生理鹽水。

1.3.2 干預方法

造模成功后12 h 開始干預。 所有大鼠,每日上午8:00～10:00,進行治療。

對照組和失眠組:僅抓取、固定,灌胃生理鹽水。

針刺組:抓取固定大鼠后,取穴位置參照《實驗針灸學》[8],將局部皮膚消毒,取針于雙側申脈、照海穴平刺,針有下沉感后捻轉補瀉,先補照海,后瀉申脈,留針15 min。 灌胃生理鹽水。

西藥組:僅抓取、固定,根據人與大鼠體表面積計算給藥量,灌胃地西泮0.9 mg/kg。

各組大鼠均每日干預1 次,連續7 d。

1.3.3 曠場實驗檢測大鼠自發活動

末次干預后24 h,曠場實驗檢測大鼠自發活動。采用100 cm×100 cm×50 cm 曠箱,底面分成25 個邊長4 cm 的正方形,曠場上方放置攝像頭,將大鼠放在正中格,觀察大鼠5 min 水平活動情況和垂直活動情況,水平活動得分以爬行總格數計;垂直活動得分以直立次數計。 每只大鼠測試前使用乙醇噴灑曠箱消除上只氣味。

1.3.4 戊巴比妥鈉協同睡眠實驗

通過預實驗確定戊巴比妥鈉引起100%大鼠睡眠的閾上劑量為45 mg/kg,以翻正反射消失1 min為睡眠,30 s 內翻轉3 次為睡眠結束,記錄大鼠睡眠潛伏期(從注射開始至大鼠入睡所需的時間)和睡眠持續時間。

1.3.5 RT-qPCR 法檢測視交叉上核生物鐘基因水平

末次干預12 h,麻醉大鼠,斷頭取腦,用生理鹽水沖洗干凈,分離下丘腦,取出視交叉上核,保存于液氮中。 取液氮中保存視交叉上核50 mg,冰上研磨,加入TRIzol 裂解液,裂解細胞,提取總RNA,檢測RNA 的濃度和純度,按照逆轉錄試劑盒說明書逆轉錄cDNA,進行實時熒光定量PCR。 反應體系:模板 cDNA 2 μL,2×qPCR Mix 10 μL,上下游引物各0.5 μL,加雙蒸水至總體積 20 μL。 反應條件:95℃預變性10 min,95℃變性5 s,55℃退火30 s,72℃延伸30 s,45 個循環,以 β-actin 為內參基因,采用2-△△CT法計算目的基因相對表達水平。 引物序列:clock上游序列:5′-CTGACTATGCTAGCTAGCTAG-3′;下游序列:5′-AGTAGCTAGCTGATCGTAGCT-3′。per2 上游序列:5′-CGTGATGCTGCTAGCTGAC-3′;下游序 列:5′-ACATGTCCTAAGCTCAGCC-3′。β-actin上游序列:5′-ATAGATAGTGCACTGTACA-3′;下游序列:5′-ACTAAGTGCATGCATGCAT-3′。

1.3.6 高效液相檢測下丘腦GABA、Glu 含量

處死大鼠后[9],分離下丘腦,用生理鹽水沖洗干凈,-80℃保存。 取0.1 g 下丘腦組織,加入甲醇進行勻漿,加入10 μL 內標靜置30 min,去除蛋白。將組織勻漿2000 r/min 離心10 min,取上清,加入0.1 mL 甲醇,2000 r/min 離心 10 min,取上清。 采用高效液相色譜法檢測腦中GABA、Glu 含量。 色譜條件:色譜柱為Acquity UPLC HSS PFP 柱(2.1 mm×100 mm,1.8 μm);柱溫:30℃;流動相:含 0.1%甲酸的5 mmol/L 乙酸銨水溶液-甲醇溶液;流速為0.4 mL/min;進樣量 2 μL。 質譜條件:電噴霧離子源,正離子模式,選擇離子掃描(m/z) 104.072(GABA),203.035(Glu),離子源溫度為120℃,脫溶劑溫度為500℃,脫溶劑氣體流速為800 mL/min。

1.3.7 Western blot 法檢測下丘腦GAD、GS 蛋白表達水平

一部分下丘腦保存于液氮中。 取液氮保存下丘腦50 mg,加入RIPA 裂解液,冰上裂解,離心后去上清,用BCA 法蛋白定量,100℃水浴10 min,蛋白變性,蛋白上樣,進行SDS-PAGE 電泳,電泳結束后將蛋白轉至PVDF 膜,5%脫脂奶粉室溫封閉2 h,加入 1 ∶2000 稀釋的 GAD、GS、β-actin 一抗,4℃孵育過夜,TBST 洗膜,加入HRP 標記的山羊抗兔二抗(1 ∶5000),室溫孵育2 h,TBST 洗膜,加入ECL 顯影、定影,采用Image 圖像軟件分析蛋白灰度值,結果以目的蛋白/β-actin 表示。

1.4 統計學方法

采用SPSS 24.0 統計學軟件分析數據,計量資料以平均數±標準差()表示,多樣本計量資料比較采用單因素方差分析,兩兩樣本比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠一般情況

對照組大鼠精神活潑,活動規律;失眠組出現明顯失眠特征,表現為白天夜晚活動頻繁、睡眠減少、精神疲憊,對外界聲光刺激異常敏感;針刺組和西藥組一般行為狀態較失眠組有所改善,精神較好、活動較規律。

2.2 各組大鼠自發活動比較

水平運動和垂直運動得分比較,差異有統計學意義(P＜0.001,P＜0.001)。 與對照組比較,失眠組、針刺組和西藥組水平運動和垂直運動得分降低(P＜0.001,P＜ 0.01,P＜ 0.01,P＜ 0.001,P＜ 0.001,P＜0.01);與模型組比較,針刺組和西藥組水平運動和垂直運動得分升高(P＜0.001,P＜0.001,P＜0.001,P＜0.001);針刺組和西藥組水平運動和垂直運動得分比較,差異無統計學意義(P＞0.05,P＞0.05)。 見表 1。

2.3 各組大鼠睡眠潛伏期和睡眠時間比較

各組大鼠睡眠潛伏期和睡眠時間組間比較,差異有統計學意義(P＜0.001,P＜0.001)。 與對照組比較,失眠組、針刺組和西藥組大鼠睡眠潛伏期延長,睡眠時間縮短(P＜0.001,P＜0.001,P＜0.01,P＜0.001,P＜0.05,P＜0.05);與失眠組比較,針刺組和西藥組大鼠睡眠潛伏期縮短,睡眠時間延長(P＜0.001,P＜0.001,P＜0.01,P＜0.001);針刺組和西藥組大鼠睡眠潛伏期和睡眠時間比較,差異無統計學意義(P＞0.05,P＞0.05)。 見表2。

2.4 各組大鼠生物鐘基因mRNA 水平比較

視交叉上核clock、per2 mRNA 相對表達量組間比較,差異有統計學意義(P＜0.001,P＜0.001)。 與對照組比較,失眠組、針刺組和西藥組視交叉上核clock、per2 mRNA 相對表達量降低(P＜ 0.001,P＜0.001,P＜0.001,P＜0.001,P＜0.01,P＜0.05);與失眠組比較,針刺組和西藥組視交叉上核clock、per2 mRNA 相對表達量升高(P＜ 0.001,P＜ 0.001,P＜0.001,P＜0.001);針刺組和西藥組視交叉上核clock、per2 mRNA 相對表達量比較,差異無統計學意義(P＞0.05,P＞0.05)。 見表 3。

2.5 各組大鼠下丘腦 Glu、GABA、Glu/GABA 水平比較

下丘腦Glu、GABA、Glu/GABA 水平組間比較,差異有統計學意義(P＜0.001,P＜0.001,P＜0.001)。與對照組比較,失眠組、針刺組和西藥組下丘腦Glu水平升高,GABA 水平降低,Glu/GABA 升高(P＜0.001,P＜ 0.001,P＜ 0.001,P＜ 0.001,P＜ 0.05,P＜0.05,P＜0.001,P＜0.05,P＜0.05);與失眠組比較,針刺組和西藥組下丘腦Glu 水平降低,GABA 水平升高,Glu/GABA 降低 (P＜ 0.001,P＜ 0.001,P＜0.05,P＜0.05,P＜0.05,P＜0.01);針刺組與西藥組下丘腦 Glu、GABA、Glu/GABA 比較,差異無統計學意義(P＞0.05,P＞0.05)。 見表 4,圖 1。

2.6 各組大鼠下丘腦GAD、GS 蛋白水平比較

下丘腦GAD、GS 蛋白相對表達量組間比較,差異有統計學意義(P＜0.001,P＜0.001)。 與對照組比較,失眠組、針刺組和西藥組下丘腦GAD 蛋白相對表達量降低,GS 蛋白相對表達量升高(P＜0.001,P＜0.001,P＜0.01,P＜0.001,P＜0.001,P＜0.001);與失眠組比較,針刺組和西藥組下丘腦GAD 蛋白相對表達量升高、GS 蛋白相對表達量降低(P＜0.001,P＜0.001,P＜0.01,P＜0.001);針刺組和西藥組下丘腦GAD、GS 蛋白相對表達量比較,差異無統計學意義(P＞0.05,P＞0.05)。 見表 5,圖 2。

表1 各組大鼠水平運動和垂直運動得分比較(ˉx±s, n=10, min)Table 1 Comparison of the horizontal and vertical movement scores of rats in each group

表2 各組大鼠睡眠潛伏期和睡眠時間比較(ˉx±s, n=10, min)Table 2 Comparison of sleep latency and sleep time of rats in each group

表3 各組大鼠生物種基因mRNA 水平比較(ˉx±s, n=10)Table 3 Comparison of mRNA levels of biological species in each group of rats

3 討論

睡眠是人體正常生理過程重要組成部分,具有解除疲勞和恢復體力作用,是維持身體健康和鞏固記憶的重要環節。 中醫認為,人體五臟陰平陽秘,氣機升降條達,營衛運行通暢,方可心神得養、寐寤正常。 失眠發病機制復雜,導致失眠的病因包括情志失調、勞倦、體虛等多種因素,但其基本病機與陰陽失衡及臟腑功能失調擾亂心神有關,治療失眠當補虛瀉實,以平衡陰陽、調理氣血、清心安神為主要原則[10-11]。 中醫治療失眠主要有中藥方劑、針灸及推拿等方法,針灸療法具有諸多優點,已成為臨床治療失眠的主要手段之一。 目前認為針刺具有特異性和非特異性生物學效應,而針刺的特異性生物學效應尚不十分明確,安慰/假針刺作為針刺對照研究,須不具備針刺特異性療效,其合理性尚存在爭議,故本研究未設置安慰/假針刺組,而將未針刺的失眠大鼠作為針刺組的對照,通過比較針刺組與失眠組相關指標變化,探討針刺對失眠大鼠的改善作用。

表4 各組大鼠下丘腦GABA、Glu、Glu/GABA水平比較(ˉx±s, n=10)Table 4 Comparison of GABA, Glu and Glu/GABA levels in hypothalamus of rats in various groups

圖1 下丘腦色譜圖Figure 1 Chromatogram of hypothalamus

圖2 下丘腦GAD、GS 蛋白表達Figure 2 GAD and GS protein expression levels in hypothalamus

睡眠-覺醒周期是人體最基本的生物節律,在一定年齡階段,人類睡眠-覺醒周期相對恒定,失眠患者由于存在睡眠障礙,睡眠相對不足且覺醒時間相對延長,導致睡眠-覺醒周期發生紊亂。clock基因是重要的生物鐘基因,發生突變可導致神經高度興奮引起睡眠減少。per2 是哺乳動物體內重要的節律因子,其表達與長周期有關,該基因突變可引起睡眠時間減少,覺醒時間延長。 臨床研究顯示,針刺對機體晝夜節律具有一定調整作用,失眠患者通過針灸治療,睡眠時間相對延長[12]。 動物模型實驗也證實針灸可恢復倒相活動大鼠的自發活動節律,使其失眠癥狀得到一定程度恢復[13]。 中醫認為,失眠與陰陽蹺脈失調、衛氣運行不暢有關,“申脈”、“照海”均與蹺脈相交,申脈通陽蹺脈,照海通陰蹺脈,陰陽蹺脈分別于照海、申脈而出,終會于目,司目之開合。 針刺二穴,陰陽相應,蹺脈功能得以恢復,從而調節失眠[14]。 本研究基于蹺脈理論,通過針刺申脈、照海二穴位,調和陰陽,促進蹺脈功能恢復,結果顯示針刺組較失眠組大鼠自發活動改善明顯,戊巴比妥鈉協同鎮靜實驗顯示針刺治療后睡眠潛伏期明顯縮短,睡眠時間明顯延長,同時生物鐘基因clock和per2 表達明顯升高,與西藥改善大鼠失眠效果相當,提示針刺對失眠大鼠具有一定改善作用,可調節其自發活動節律,促使紊亂的睡覺-覺醒周期得以恢復。

Glu、GABA 分別是是哺乳動物中樞神經系統最重要的興奮性/抑制性神經遞質,其代謝主要通過Glu/GABA-谷氨酰胺(glutamine,Gln)代謝環路進行循環[15]。 Glu 不能透過血腦屏障,通過三羧酸循環合成Gln,參與神經調節,Glu 可通過Glu-Gln 循環滅活,也可通過脫羧生成GABA,共同維持睡眠-覺醒周期。 GAD 是Glu/GABA-Gln 代謝環路中將Glu轉化為GABA 的主要代謝酶,GAD 表達降低,引起Glu 向GABA 轉化出現障礙;GS 負責將Glu 轉化為Gln,維持不同神經元之間Glu 的突觸傳遞。 Glu/GABA 代謝平衡是維持大腦正常生理活動的基礎,Glu 與GABA 神經興奮/抑制功能失調,Glu 過度積累易引起興奮性神經毒性,與神經疾病疾病密切相關[16]。 研究顯示,失眠患者體內 Glu/GABA 失衡,失眠動物模型體內Glu、GABA 含量較正常組明顯改變[17-18]。 本研究失眠組大鼠Glu 含量較正常組明顯升高,GABA 含量降低,Glu/GABA 升高,提示失眠大鼠體內存在Glu/GABA 失衡現象;經針刺治療后,Glu/GABA 有一定程度恢復,且GAD 表達降低,GS 表達升高,提示針刺對失眠大鼠的改善作用可能是通過調節Glu/GABA-Gln 代謝環路中GAD 和GS蛋白表達,從而恢復Glu/GABA-Gln 代謝平衡發揮作用。

綜上所述,針刺對失眠大鼠具有一定改善作用,其可能是通過調節GAD 和GS 蛋白表達,恢復Glu/GABA-Gln 代謝平衡,從而改善睡眠狀態,為臨床治療失眠提供一定理論基礎。