Ac-SDKP 抑制YEATS4 拮抗實驗性矽肺的機制

蔡文臣,張詩匯,高一冰,牛婉麗,徐 洪,3,楊 方*

(1.華北理工大學公共衛生學院,河北唐山 063210; 2.華北理工大學臨床醫學院,河北唐山 063210;3.河北省器官纖維化重點實驗室,河北唐山 063210)

矽肺纖維化主要是由于長期吸入游離二氧化硅(SiO2)粉塵引起的,以矽結節形成和彌漫性肺間質纖維化為主要病理變化的一種職業性肺病,發生機制尚未完全闡明[1]。 課題組前期通過高通量轉錄組測序技術,發現含 YEATS(Yaf9、ENL、AF9、SAS5、TAF14) 結 構 域 蛋 白 4 ( YEATS domain containing protein 4, YEATS4)可能是實驗性矽肺模型進展的重要靶基因[2]。 YEATS4 是一種高度保守的,具有YEATS 家族結構域的核蛋白[3]。 作為轉錄激活因子,YEATS4 參與了多種腫瘤的發生發展[4-5]。 課題組多年來對N-乙酰基-絲氨酰-天門冬酰-賴氨酰-脯氨酰(N-acetyl-seranyl-aspartate-lysylproline, Ac-SDKP)的抗矽肺纖維化作用機制進行了系列研究[6-7]。 因此,本研究擬觀察Ac-SDKP 能否通過對YEATS4 的調節,從而抑制巨噬細胞活化,發揮拮抗矽肺纖維化的作用。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

SPF 級 3 周齡 30 只雄性 Wistar 大鼠(180±10)g 購自北京維通利華動物技術有限公司[SCXY(京)2016-0008]。 于華北理工大學醫學實驗中心潔凈級動物房飼養[SYXK(冀)2020-0007], 室溫(22±2)℃,相對濕度40%～60%,自由飲水、進食,分籠喂養。 所有操作均符合實驗動物倫理學要求(LX2019035),并按照實驗動物使用的3R 原則給予人道的關懷。

1.1.2 實驗細胞

小鼠單核巨噬細胞RAW264.7(中國科學院上海細胞庫)。

1.2 主要試劑與儀器

動式染塵控制系統(天津開發區合普工貿有限公司);兔抗I 型膠原(Collagen type I,COLI)(美國Abcom 公司);鼠抗YEATS4(美國Santa Cruz);鼠抗精氨酸酶-1(Arginase-1)(美國BD 公司);兔抗單核細胞趨化蛋白-1(Monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)(美國 Affinity 公司);α-微管蛋白(Tubulin alpha, Tublin α)(美國 Affinity 公司);二氧化硅(silicon dioxide,SiO2)(美國 Sigma 公司);DMEM 培養基(以色列BI 公司);Ac-SDKP(瑞士Bachem AG公司);PV6000 通用型兩步法免疫組化試劑(北京中杉公司);二抗山羊抗兔,抗鼠IgG(美國KPL 公司);ECL 顯色試劑盒(美國GE 公司);蘇木精染色液(珠海貝索公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組

采用HOPE-MED8050 動式染塵控制系統制備矽肺大鼠模型[2]。 實驗動物分組:①對照24 周組(Control 24 week, C24):吸入純凈氣至16 周后,腹腔埋入含有生理鹽水的微量緩釋膠囊;②矽肺24 周組(silicosis 24 week, S24):動式染塵以(50±10)μg/m3的濃度h/d,染塵至16 周后,腹腔內埋入含有生理鹽水的微量緩釋膠囊;③Ac-SDKP 治療組(Ac-SDKP treatment 24 week, Ac24):動式染塵至16 周后,在大鼠腹腔內埋入含有Ac-SDKP[800 μg/(kg·d)]的微量緩釋膠囊,均于24 周處理動物。 取右肺下葉組織置于4%多聚甲醛中固定,常規石蠟

1.4 統計學方法

采用SPSS 20.0 軟件進行統計學分析。 數據以平均數±標準差()表示。 采用獨立樣本t檢驗或單因素方差分析評估組間差異,進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 沉默 YEATS4 可抑制 SiO2 誘導的RAW264.7 活化

如圖1、表1 所示,Western blot 結果顯示,與siC組比較,siY-3 明顯減弱了 YEATS4 的表達(P＜0.05)。 如圖 2、表 2 所示,與 siC 組比較,沉默YEATS4 后,COL I、MCP-1、Arginase-1 表達明顯降低,差異均具有統計學意義(P＜0.05)。 給予SiO2刺激 的 同 時 沉 默 YEATS4 后, COL I、 MCP-1、Arginase-1 表達也明顯降低(表3),差異均具有統計學意義(P＜0.05)。

2.2 Ac-SDKP 對 SiO2 誘導的 RAW264.7 細胞中YEATS4 表達的調節作用

免疫細胞化學染色結果顯示,與對照組比較,SiO2刺激組中 YEATS4 高表達;與 SiO2刺激組比較, Ac-SDKP 處理組中,YEATS4 陽性表達明顯降低(圖 3)。 如圖4、表 4 所示,與對照組比較,SiO2刺激組中 COL I、MCP-1、Arginase-1 和 YEATS4 蛋白表達均升高,差異均具有統計學意義(P＜0.05);與SiO2刺激組比較, Ac-SDKP 處理組中,COL I、MCP-1、Arginase-1 和 YEATS4 蛋白表達均降低,差異均具有統計學意義(P＜0.05)。

圖1 YEATS4 沉默序列篩選Figure 1 YEATS4 silencing sequence screening

表1 YEATS4 沉默序列篩選Table 1 YEATS4 silencing sequence screening

圖 2 COL I、MCP-1、Arginase-1 蛋白在沉默YEATS4 的 RAW264.7 中的表達Figure 2 The levels of COL I, MCP-1 and Arginase-1 in RAW264.7 regulated by silencing YEATS4

表 2 COL I、MCP-1、Arginase-1 蛋白在沉默YEATS4 的 RAW264.7 中的表達Table 2 The levels of COL I, MCP-1 and Arginase-1 in RAW264.7 regulated by silencing YEATS4

表 3 COL I、MCP-1、Arginase-1 蛋白在 SiO2 誘導的沉默YEATS4 的 RAW264.7 中的表達Table 3 The levels of COL I, MCP-1 and Arginase-1 in silica-treated RAW264.7 regulated by siRNA-YEATS4

圖3 Ac-SDKP 對SiO2 誘導的RAW264.7 細胞中YEATS4 表達的調節作用Figure 3 Ac-SDKP inhibits the high-expression of YEATS4 in RAW264.7 cells induced by silica

2.3 Ac-SDKP 對實驗性矽肺大鼠肺組織中YEATS4 的表達的調節作用

IHC 結果顯示,與 C24 周組比較,S24 周組中YEATS4 陽性表達主要定位于矽結節中的巨噬細胞;與S24 周組比較,Ac-SDKP 處理組中YEATS4 陽性表達細胞數量減少(圖5)。 如圖6、表5 所示,與C24 周組比較,S24 周組中 COL I、MCP-1、Arginase-1和YEATS4 表達均升高,差異均具有統計學意義(P＜0.05)。 與 S24 周組比較,Ac24 周組中,COL I、MCP-1、Arginase-1 和 YEATS4 蛋白表達明顯降低,差異均具有統計學意義(P＜0.05)。

圖4 Ac-SDKP 對 SiO2 誘導的 RAW264.7細胞中YEATS4 表達的調節作用Figure 4 Ac-SDKP inhibits the high-expression of YEATS4 in RAW264.7 cells induced by silica

表4 Ac-SDKP 對 SiO2 誘導的 RAW264.7細胞中YEATS4 表達的調節作用Table 4 Ac-SDKP inhibits the high-expression of YEATS4 in RAW264.7 cells induced by silica

圖5 Ac-SDKP 抑制染塵大鼠肺組織中YEATS4 的高表達Figure 5 Ac-SDKP inhibits the increasing level of YEATS4 in rats exposed to silica

圖6 Ac-SDKP 抑制染塵大鼠肺組織中YEATS4 的高表達Figure 6 Ac-SDKP inhibits the increasing level of YEATS4 in rats exposed to silica

表5 Ac-SDKP 抑制染塵大鼠肺組織中YEATS4 的高表達Table 5 Ac-SDKP inhibits the increasing level of YEATS4 in rats exposed to silica

3 討論

課題組前期通過高通量測序技術,在實驗性矽肺大鼠模型中篩選了與矽肺纖維化發生、發展有關的長鏈非編碼RNA,而YEATS4 是其重要的靶基因之一[2]。 研究表明,YEATS 家族成員能夠選擇性識別組蛋白賴氨酸乙酰化位點,可促進賴氨酸巴豆酰化,在轉錄后修飾方面起到了重要的調節作用,主要參與染色質修飾、轉錄調控和DNA 修復[9-13]。 在本研究中,以實驗性矽肺大鼠模型和體外SiO2誘導的RAW264.7 細胞作為研究對象,發現了YEATS4主要定位于巨噬細胞,且其高表達伴隨著巨噬細胞活化指標Arginase-1、MCP-1 和纖維化指標COL I 表達的上調,提示YEATS4 可能參與了實驗性矽肺進程,其主要作用可能與矽塵導致的巨噬細胞活化有關。

諸多研究顯示,YEATS4 作為一種致癌基因,在腫瘤發生、發展中起到了重要的調節作用。 在非小細胞肺癌中,YEATS4 能夠激活P53 信號通路促進腫瘤細胞的增殖和遷移,采用基因沉默技術則能夠抑制該變化[14]。 其還可通過激活Wnt/β-連環蛋白信號促進胰腺癌和胃癌細胞遷移、增殖和侵襲[5,15]。另有研究顯示,YEATS4 在固有淋巴細胞及其祖細胞中高表達,并促進向輔助固有淋巴祖細胞分化,敲除YEATS4 小鼠肺泡灌洗液中嗜酸性粒細胞浸潤顯著減少[16]。 在本研究中,采用基因沉默技術,下調YEATS4 后,在基礎水平和SiO2誘導水平均顯著下調了 Arginase-1、MCP-1 和 COL I 的表達水平,進一步提示沉默YEATS 能夠抑制巨噬細胞的活化。課題組前期研究表明,Ac-SDKP 可通過抑制巨噬細胞活化、肌成纖維細胞分化和上皮間質轉化進程,從而發揮拮抗矽肺纖維化的作用[17-18]。 體內外實驗結果顯示,予以Ac-SDKP 能夠抑制矽肺大鼠和RAW264.7 細胞中 YEATS4 的表達, 同時下調Arginase-1、MCP-1 和 COL I 的表達水平,提示 Ac-SDKP 可能通過對YEATS4 的阻斷,從而發揮拮抗矽肺纖維化的作用。

總之,本研究發現YEATS4 可在SiO2誘導的巨噬細胞活化中起到了重要調節作用,其可能是矽肺纖維化進展的重要環節,采用基因沉默技術或給予Ac-SDKP,均能夠抑制YEATS4 表達的上調,提示其可作為抗矽肺纖維化進展的一個有效靶點。 在今后的研究工作中,將深入研究矽肺纖維化進展中YEATS4 參與組蛋白乙酰化/巴豆酰化的具體機制,為明確其功能提供進一步的理論和實驗依據。