HPLC法測定維生素D3軟膠囊中抗氧劑二丁基羥基甲苯的含量

周惠惠 胡立學 劉佳佳 梅興國，3*

1.湖北科技學院藥學院，湖北 咸寧 437100；2.湖北真奧醫藥研究院有限公司，湖北 咸寧 437000；3.軍事醫學科學院毒物藥物研究所，北京 100850

二丁基羥基甲苯(Butylated hydroxytoluene,BHT)作為一種脂溶性抗氧劑，穩定性高，抗氧化能力強，是我國生產量最大的抗氧化劑之一，常用于食品、保健品、藥品中[1]。2020版中國藥典[2]中收錄該品種的含量測定采用高效液相色譜法，也有文獻[3-4]采用氣相色譜法。本文參照2020版中國藥典及相關文獻[5-7]并在此基礎上進行優化，建立了高效液相色譜法測定維生素D3軟膠囊中抗氧劑BHT的含量，現報導如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 40D高效液相色譜儀(島津公司)；XSE105電子分析天平(瑞士梅特勒-托利多)；XW-80A渦旋混合儀(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)。

1.2 試藥 甲醇為色譜純(天津賽孚瑞科技有限公司)；乙醇為色譜純(天津賽孚瑞科技有限公司)；純化水(杭州娃哈哈集團有限公司)；二丁基羥基甲苯對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號190065-201602)；維生素D3軟膠囊(批號200617、200712、200723，自制)。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱：DiamonsilC18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：A相為甲醇-水(9∶1)、B相為甲醇-乙醇(8∶2)，梯度洗脫(0～10 min時為A；10～30 min時為B；30～40 min時為A)；檢測波長：278 nm；柱溫：35 ℃；流速：1.0 mL/min；進樣量：20 μL。

2.2 溶液配制

2.2.1 對照品溶液的配制 稱取BHT對照品約10mg置100mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為BHT儲備液。精密吸取1 mL置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。

2.2.2 供試品溶液的配制 稱取維生素D3軟膠囊內容物適量(相當于BHT 0.2 mg)置20 mL容量瓶中，加適量甲醇溶解渦旋5 min，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，靜置分層，取上清液過濾進樣。

2.2.3 空白溶液的配制 按處方組成及工藝制備不含BHT的空白輔料，按“2.2.2”供試品溶液的配制方法進行配制空白溶液。

2.3 方法學考察

2.3.1 專屬性考察 按照“2.1”色譜條件下，分別取對照品溶液、供試品溶液、空白溶液進樣檢測，記錄色譜圖，觀察在主峰出峰位置是否有干擾。結果顯示，在278 nm處，供試品溶液中的BHT保留時間約為7 min與對照品溶液保留時間相同，空白溶液在主峰位置無干擾。色譜圖如圖1所示。

2.3.2 線性考察 精密稱量BHT對照品約10.87 mg置100 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，制得108.7 μg/mL的對照儲備液。用甲醇溶液逐級稀釋，制得濃度分別為5.44 μg/mL、8.70 μg/mL、10.87 μg/mL、13.04 μg/mL、16.31 μg/mL的對照品溶液。按照2.3.2項的色譜條件進樣，記錄色譜圖，以峰面積(y)對濃度(x)進行線性回歸，得回歸方程：y=10067.15x-1031.8，(R2=0.9999)。結果表明，在5.44～16.31 μg/mL范圍內，BHT峰面積與濃度呈良好線性關系。如圖2所示。

2.3.3 精密度試驗 取對照品溶液(10 μg/mL)重復進樣6次，記錄峰面積。結果BHT峰面積RSD為0.30%，表明儀器精密度良好，色譜條件穩定。見表1。

2.3.4 重復性試驗 取同一批的樣品(批號為200617)平行制備6份供試品溶液，按“2.1”項的色譜條件，記錄峰面積，計算含量。結果RSD為1.02%，表明本方法重復性良好。見表2。

2.3.5 回收率試驗 稱取BHT對照品約10 mg置100 mL量瓶中，加甲醇溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，作為BHT儲備液溶液。精密吸取1 mL置10 mL量瓶中，加甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，作為BHT對照品溶液，平行配置2份。精密稱量9份空白輔料(按處方比例不加入BHT)置50 mL量瓶，分3組，每組3份，各組分別精密加入BHT對照儲備液4 mL、5 mL、6 mL,(分別相當于BHT處方量的80%、100%和120%)，加入適量甲醇溶解并渦旋5 min，用同樣的溶劑稀釋并至刻度，靜置分層，配制成低、中、高三種濃度的供試品溶液，取上清液過濾，按“2.1”項下色譜條件進樣，計算回收率及RSD值。結果表明平均回收率98.2%，RSD為1.52%。見表3。

表1 精密度試驗結果

表2 重復性試驗結果

表3 回收率試驗結果

2.3.6 溶液穩定性 取自制樣品(200723批)按“2.2.2”項制備成供試品溶液，分別于0、4、8、12、24 h，按“2.3.2”色譜條件進樣檢測，記錄峰面積，計算RSD值。結果顯示：BHT的RSD值為0.66，表明樣品溶液在24 h內穩定。見表4。

2.4 樣品含量測定 取三批樣品(200617、200712、200723批)按照“2.2.2”項配制供試品溶液，按“2.1”項的色譜條件進樣，計算含量。結果顯示含量符合要求。見表5。

表4 溶液穩定性試驗結果

表5 含量測定結果

3 討論

3.1 檢測波長的選擇 用甲醇配制成一定濃度的二丁基羥基甲苯(BHT)對照品溶液，在200～400 nm之間進行紫外波長掃描。掃描結果顯示，BHT在278 nm處有最大吸收峰，因此將選擇278 nm為BHT含量測定檢測波長。

3.2 流動相的選擇 2020版中國藥典BHT含量測定記錄流動相為甲醇-水(9∶1)，但本制劑內容物中含有植物油，在BHT出峰附近有較大的雜質峰，因此，筆者選擇流動相甲醇-水(9∶1)及甲醇-乙醇(8∶2)進行梯度洗脫，使植物油洗脫出來同時不干擾BHT的含量測定。

3.3 提取方法的選擇 BHT可溶于甲醇、乙醇等有機溶劑，不溶于水，本實驗研究的是從植物油中提取BHT,筆者選擇極性更大的甲醇作為提取溶劑，在提取次數上考察一次提取與三次提取BHT含量的多少，結果顯示兩者含量無明顯差別，因此選擇用甲醇一次提取的作為樣品處理方法。