根際微生物增強宿主植物耐鉻能力生理機制研究進展

邢淑萍，陳保冬，郝志鵬，張莘,*

1. 中國科學院生態環境研究中心城市與區域生態國家重點實驗室，北京 100085

2. 中國科學院大學，北京 100049

近年來，重金屬鉻(chromium , Cr)在地下水、土壤和沉積物中均有廣泛分布，其污染問題倍受關注[1]。環境中的Cr除了來自地殼巖石風化，主要來源于冶金、電鍍、制染、制革、使用殺蟲劑和化肥等人為化工活動[2-3]。Cr有很豐富的價態(-2～+6)，但其中最穩定和常見的形式是三價鉻Cr(Ⅲ)和六價鉻Cr(Ⅵ)[4-5]。Cr(Ⅲ)的移動性低，相較于Cr(Ⅵ)，其生物可利用性和毒性也更低[6]，在低濃度時，還可以作為葡萄糖耐量因子(glucose tolerance factor, GTF)的重要成分有益于動物和人體健康[7]；而Cr(Ⅵ)無論是在土壤還是細胞膜表面都更易滲透，具有致突變性和致癌性，被美國環境保護局(US EPA)劃為A級人類致癌物[8]。

除此之外，Cr還會對多種陸地植物產生危害[9]，比如，隨其濃度升高，會抑制植物體內光合色素[10]、1-氨基環丙烷-1-羧酸(1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid, ACC)[11]和吲哚乙酸(indole acetic acid, IAA)[12]等物質的合成；引發氧化脅迫[13]，增強依賴煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosohate, NADPH)的超氧化物合成[14]；還會降低碳同化的速率[15-16]；影響營養元素如氮(N)、磷(P)、鉀(K)、鎂(Mg)、鋅(Zn)、鐵(Fe)、鋁(Al)和錳(Mn)以及硫酸鹽轉運蛋白[17]及水分的平衡[18]等，最終抑制種子發芽和根的生長，誘發植株的葉黃病等，甚至導致死亡[10,19-20]。Cr對水生植物也會產生相似的危害，比如抑制根、莖和葉等組織的生長，降低植物體內的葉綠素和蛋白質水平，最終導致萎黃和根部脫落等；還會抑制浮游植物的細胞生長，引發細胞質液泡化[20-25]。

不同植物對Cr的響應有所不同，一些植物如白睡蓮(NymphaeaalbaL.)[19]、水稻(OryzasativaL.)和瓜爾豆(CyamopsistetragonolobaL.)[26]等對Cr比較敏感，小冠重(OcimumtenuiflorumL.)[10]、麻風樹(JatrophacurcasL.)和假馬齒莧(BacopamonnieriL.)[27]等對Cr比較耐受[28]，而尼科菊(Dicomaniccolifera)和線蓬(Suterafodina)則對Cr展現出超強的富集能力，這些植物為了緩解Cr脅迫，發展出多樣的調控和防御機制，其中，除了自身的金屬抗性體系[9]，另外一部分則得益于植物根際微生物[29]。一些根際微生物可以分解重金屬復合物，通過生物吸附和生物沉淀等過程使之轉變成低毒或無毒的形式，降低其可移動性與生物有效性，進而提高植物的耐受性[30]。因此，筆者從植物與根際微生物相互作用的角度，重點綜述了4種根際微生物，即根際促生菌、叢枝菌根真菌、非麥角屬內生真菌和外生菌根真菌，提高宿主植物Cr耐受的機制，這將為通過根際微生物來調節根際環境，促進植物更好地適應Cr污染環境提供借鑒。

1 根際促生菌(Plant growth promoting rhizobacteria, PGPR)

接種PGPR能夠保護植物免受病原菌、營養缺乏以及其他環境脅迫的危害[31-32]，是當前比較熱門的一種緩解植物生物及非生物脅迫的高效且環境友好的方法[33-34]。已有研究總結了目前報道過的一些Cr耐受菌、Cr還原菌及其作為生物菌劑在Cr污染土壤中的具體應用效果與作用機制。研究表明[35-36]，這些PGPR主要來自假單胞菌屬、芽孢桿菌屬、根瘤菌屬和固氮菌屬。PGPR可以通過溶解礦物磷營養，分泌鐵載體(siderophore)、吲哚乙酸和氫氰酸(HCN)等物質促進植物的生長，也可以釋放有機酸和生物表面活性劑等物質降低土壤中Cr的生物有效性和毒性，以提高植物的耐受[37]。

1.1 促進植物生長

PGPR能夠分泌有機酸、生物吸附劑和鐵載體[38-39]，這些物質會抑制金屬與土壤礦質顆粒的結合，并以更強的親和性與金屬螯合后降低其生物有效性，減輕金屬對植物根系產生的危害。另外，鐵載體可以緩解金屬脅迫導致的缺鐵，減少植物根系自由基的形成，這有利于葉綠素的合成和植物對病原菌免疫力的提高[40]。PGPR還能分泌植物生長素IAA，刺激細胞的分裂和延長，促進植物的生長，通過“生長稀釋”的效應提高植物對Cr的耐受[41]，與此同時，ACC脫氨酶(ACC deaminase)的活性也被激發，通過降解乙烯合成的前體ACC，減少乙烯的生成，幫助植物形成更長更密集的根系，提高植物對Cr的耐受[42]。

Gupta等[43]通過給向日葵接種克雷伯氏菌屬耐Cr促生菌Klebsiellasp.和腸桿菌屬耐Cr促生菌Enterobactersp.發現，菌群可以通過釋放IAA、鐵載體、HCN、氨氣(ammonia)和生物表面活性劑等物質，以及溶解土壤中的部分P，提高植物體內葉綠素和可溶性蛋白的含量，增強營養元素如N、P和Fe的吸收和富集，促進了植物生長，同時增強了向日葵對Cr的耐受與富集。

不同的抗Cr促生菌(chromium resistance)或Cr還原促生菌(chromium reduction)發揮促生功能時的機制也各有不同。如假單胞菌屬抗Cr菌Pseudomonassp. VRK3可以分泌IAA和鐵載體，也具有解P能力[44]；同樣的專性抗Cr緩病類芽孢桿菌PaenibacilluslentimorbusB-30488(r)就只能分泌IAA[45]；而兼具抗Cr和還原Cr性能的戴爾福特屬促生菌Delftiasp. JD2除了能分泌IAA，還有固氮的功能[46]；芽孢桿菌(Bacillusspp.)也兼具抗Cr和還原Cr的能力，它既能分泌IAA、鐵載體、HCN和氨氣，也有較強的解P能力[47]。

1.2 緩解氧化脅迫

為了緩解Cr導致的氧化脅迫，接種PGPR的植株會上調抗氧化酶如超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、過氧化氫酶(catalase, CAT)和過氧化物酶(peroxidase, POD)的表達，但是不同菌種的產酶能力不同[43]。

有研究者給向日葵和番茄接種惡臭假單胞菌(Pseudomonasputidastrain CPSB21)之后發現，隨著Cr(Ⅵ)濃度的增加，向日葵和番茄體內的SOD和CAT活性較未接種均有顯著增加，POD活性也略有提高。另外，在接種處理的植物中檢測到更低的丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量，說明接種CPSB21有效減輕了氧化脅迫的危害[43]。

1.3 影響根際菌群

除了細菌自身，宿主植物也會分泌小分子氨基酸、有機酸、糖類、維生素和酶等，這些物質會結合一部分的金屬以減少植物對金屬的吸收，同時，也使有益的菌群通過趨化性遷移定殖在植物根部[37]。

一些熒光假單胞菌既是根際促生菌，也是菌根輔助細菌(mycorrhiza helper bacteria)，在促進植物生長的同時，也提高了菌根在植物根系的定殖率和孢子的產量，促進了根外菌絲的生長。有研究表明，侵染有惡臭假單胞菌(PseudomonasputidaUW4)的黃瓜被刺激合成ACC脫氨酶，減少了乙烯的生成量，同時提高了根際巨孢囊霉(GigasporaroseaBEG9)的定殖率，類似的現象在侵染放射形土壤桿菌(Agrobacteriumradiobacter)和惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)的草莓中也被發現[48-49]。

除了相互影響，PGPR和叢枝菌根真菌(AMF)有時還表現出協同促進植物生長的作用，這也是導致植物對金屬耐受性提高的一個原因[50]。另外，除了和AMF的協同促生作用，PGPR還表現出與水楊酸的協同作用。Islam等[51]同時接種PGPR和水楊酸(salicylic acid, SA)到Cr污染的玉米上，發現SA通過產生更多的分泌物，使具有金屬抗性的PGPR聚集到宿主根系，顯著促進植物的生長。相較于單獨接種PGPR，葉片中α-淀粉酶和β-淀粉酶的水平提高了，即植物中碳水化合物儲備如淀粉以及可溶性糖類的有效性提高了，這不僅有利于植物生長，也改善了植物的防御和調節能力。另外，植物和微生物的互作增強，還刺激了總酚和黃酮等用于重金屬解毒的次級代謝物的生成。但是，可能是由于接種了PGPR的植物受到的金屬脅迫和膜損傷程度相對較輕，聯合接種并沒有顯著提高組氨酸的富集。

2 叢枝菌根真菌(Arbuscular mycorrhizal fungi, AMF)

AMF是環境中常見的一種土壤真菌，它可以和大多數的陸地植物以及部分水生植物[52]形成良好的共生關系。并且共生AMF的植物對干旱、鹽堿、重金屬污染和澇土等環境脅迫耐受性更高[53-55]。

有研究調查了Cr污染土壤中的菌根真菌，發現以無梗囊霉屬、球囊霉屬、巨孢囊霉屬、盾巨孢囊霉屬和類球囊霉屬等為主[56]。而影響這些AMF定殖率的因素也有很多，如植物種類、P營養水平、土壤Cr污染水平和理化性質[57]、AMF的種類等，定殖率又會進一步影響AMF提高植物Cr耐受的效率。以土壤中的P水平為例，植物如果能夠獲取充足的P營養，就會降低對AMF的依賴[58]，利用含P化合物直接結合重金屬，以此提高自身的耐性[59]。總的來說，AMF共生可以通過直接和間接2種途徑改善植物對Cr的耐受，其中，直接途徑主要是通過AMF利用自身結構吸收固持Cr或改變根際Cr的形態和生物有效性，間接途徑主要是通過改善植物的營養狀況以及調控植物體內對Cr的防御機制以提高植物對Cr的抗性[60]。

2.1 間接作用

2.1.1 改善植物營養狀況

AMF沒有分解土壤中復雜有機質的能力，需要依賴于宿主植物獲取生長所需要的碳水化合物，如植物光合作用產生的蔗糖，會在AMF的胞內菌絲(intraradical mycelium, IRM)附近被降解為單糖后被IRM吸收利用[61]。再如AMF(主要為異形根孢囊霉(Rhizophagusirregularis)和巨孢囊霉(Gigasporarosea)等)缺乏脂肪酸合成酶I(FAS-I)的基因，需要依賴宿主將合成的部分脂質轉運至AMF[62-63]。作為交換，AMF可以活化土壤中的養分如N和P(尤其是無機磷)和一些大量元素，吸收并轉運給宿主植物，供植物生長。同時，植物的生長環境改善，光合作用增強，也會增加光合產物向根系的轉運[62]。

土壤中的P大多結合在有機分子和礦質表面，或者形成難溶磷酸鹽沉淀物，生物有效性較低[64]。因此，植物通過直接磷酸鹽吸收途徑(direct phosphate uptake pathway, DPU)獲取P的能力是有限的。而菌根磷酸鹽吸收途徑(mycorrhizal phosphate uptake pathway, MPU)可以大大提高植物吸收P的效率。AMF的菌絲不僅可以伸長并獲取植物根系無法接觸到的無機磷，還可以和共生微生物協同水解有機磷[65]。有研究發現，在低P的環境中，植物會分泌更多的獨腳金內酯(strigolactores, SL)、赤霉酸(gibberellic acid, GA)和乙烯(ethlene)等以提高AMF的定殖率及促進菌絲的生長[66]。

Gil-Cardeza等[67]發現給蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)接種異形根孢囊霉(R.irregularisMULC 41833)后暴露在Cr(Ⅵ)中，4 h后就可以刺激P的吸收，而且根外菌絲暴露在Cr(Ⅵ)中的根系可以吸收更多的Cr。短期暴露就可以刺激根外菌絲對P的吸收，這說明AMF促進植物吸收P的過程是比較高效的。另外，在一些AMF中已經發現了高親和或低親和的磷酸鹽轉運子，但是目前它們參與P從真菌轉移到植物細胞的機制仍然存在很多未知[68-70]。

綜上，較于未接種的植物，根部定殖有AMF[56]的植物在Cr污染土中可以生長得更好。這是因為AMF共生緩解了Cr脅迫導致的養分缺失，尤其是Cr競爭硫酸鹽和磷酸鹽的吸收通道導致的P和S缺失。Wu等[71]發現接種了AMF的蒲公英在Cr(Ⅵ)污染的土壤中顯著增加了對P、S和N的吸收，而營養狀況的改善大大增加了植物生物量，產生“生長稀釋”的效果[72]，表現為接種AMF降低了植株體內的Cr濃度，進而提高了植物對Cr的耐受。

2.1.2 調節植物代謝過程

Cr會介導活性氧(reactive oxygen species, ROS)引起DNA氧化損傷[73]，研究者[58]發現有菌根共生的蒺藜苜蓿會上調高親和硫酸鹽轉運基因MtSULTR1.1和MtSULTR1.2的表達，提高植物對S的吸收，增加體內半胱氨酸(cysteine, Cys)、谷胱甘肽(glutathione, GSH)、植物螯合肽(phytochelatins, PCs)等S代謝產物的產量，提高谷胱甘肽還原酶(glutathione reductase, GR)的活性。其中，GR既可以清除活性氧，也是其他植物螯合劑的合成前體，可以抑制HO·自由基的產生[74-75]，與其他S代謝產物一同螯合重金屬，達到解毒的效果。

除了通過調節S代謝解毒，接種AMF還可以提高植物體內抗氧化酶的活性以及調節功能蛋白(如膜聯蛋白和親環素等)的表達以緩解重金屬危害。常見的抗氧化酶如CAT、POD、SOD和抗壞血酸過氧化物酶(ascorbate peroxidase)，這些酶可以通過抑制自由基反應減少氧化的危害[25]。沈亞琴等[76]研究銻(Sb)脅迫下AMF對玉米抗氧化性能的影響，發現接種AMF之后隨著土壤中Sb添加量的增加，植株體內的MDA含量、CAT活性及POD活性均顯著上升。結合其他如Cd脅迫[77]下小麥接種AMF后體內抗氧化酶水平的提高，Cu和Zn復合污染下接種摩西球囊霉(Glomusmosseae)誘導白楊體內與抗氧化防御有關的基因AL35的表達[78]，Cd脅迫下蒺藜苜蓿體內膜聯蛋白及親環素的表達上調等，可以推測AMF共生可能也會通過調節植物代謝緩解Cr產生的氧化脅迫，但需要更多的實驗加以證明。

2.2 直接作用

2.2.1 影響根際Cr有效性

AMF可以通過直接影響根際或植物根部的Cr以提高植物的耐受性。有研究表明，AMF能夠分泌小分子酸(low molecular weight acids, LMWA)或球囊霉素相關蛋白(glomalin related soil protein, GRSP)，不僅改變了根際微環境，也可以螯合重金屬，影響其形態與生物有效性，如提高根際酸溶態Cr的濃度[74]。

GRSP有螯合多種金屬如Cr、Cu、Pb和Zn等的能力。Gil-Cardeza等[79]研究了Cr污染土壤中GRSP的濃度及與Cr的螯合情況，發現大多數的Cr(Ⅲ)都與總球囊霉素相關蛋白(total glomalin related soil protein, T-GRSP)結合，并且這種結合力較靜電吸附更強。

2.2.2 影響Cr在根系的吸收與轉運

除了吸收過程，AMF還會減少Cr從根系到地上部的轉運[80]，有研究者發現菌根植物中的Cr主要分布在根的表皮，而非維管束，也就是說AMF共生會減少Cr從側根向主根的轉運，以及向地上部的轉運[81]，Wu等[82]后續通過掃描透射X射線顯微成像(scanning transmission X-ray microscopy, STXM)觀察菌根中Cr的分布，進一步證明了這一結論。

另外，AMF會利用真菌結構如菌絲或分泌胞外聚合物(extracellular polymeric substances, EPS)等[82]改變氧化還原環境，將毒性更高的Cr(Ⅵ)還原為Cr(Ⅲ)，使之以磷酸鹽或組氨酸結合態等更穩定的形式[58]固持在根系和菌絲等真菌結構中[82]。根外菌絲通過硫酸鹽通道[83]等主動吸收Cr后，會將其中一部分轉運到菌根根系，同時限制Cr從根系到地上部的移動[84]，另一部分則被真菌結構區隔或固定在根外菌絲體中[85]，從而緩解Cr毒性[81]，增強植物的Cr耐受。

2.2.3 參與Cr的吸收與固定

AMF可以在植物根際形成根外菌絲(extraradical mycelium, ERM)。根外菌絲細胞壁組分中的幾丁質、纖維素等物質可以結合金屬離子，其本身能夠延伸到根系接觸不到的區域，擁有相比根系更強的吸收營養和重金屬的能力，并且不會將Cr轉運到植物的地上部。

Wu等[85]利用雙重無菌培養體系添加甲醛或2,4-二硝基苯酚抑制菌絲的活性發現Cr在菌絲中的吸收和轉運量也減少了，這說明菌絲對Cr的吸收可能是一個主動吸收的過程，且利用的可能是硫酸鹽轉運通道。另外，有部分Cr(Ⅵ)被還原成Cr(Ⅲ)，這說明在菌絲中，除了有鉻酸鹽酶或羧基、硫醇等小分子參與的酶還原途徑，還存在非代謝的還原途徑。

菌絲內的Cr(Ⅲ)主要有2種形態，其中，磷酸鹽結合態主要沉積在菌絲表面，這些磷酸鹽主要來自菌絲表面分泌的大量胞外聚合物(extracellular polymeric substances, EPS)，比較穩定，而一部分Cr會以組氨酸結合態的形式被轉運固持到各個真菌結構如叢枝、液泡以及內生菌絲中[82]，從而緩解植物重金屬毒害。

3 非麥角屬內生真菌(Non-clavicipitaceous endophytes, NC endophytes)

非麥角屬內生真菌主要包括子囊菌門(Ascomycota)、擔子菌門(Basidiomycota)和毛霉亞門(Mucoromycotina)，它們的宿主范圍十分廣泛，包括苔蘚類、蕨類、裸子植物和被子植物。NC endophytes與植物共生，相較于AMF不會導致宿主產生可見的侵染性狀，既可能在逆境脅迫下促進宿主生長，也可能成為潛在的病原菌[86]。它們既通過參與土壤的形成過程間接影響植被，也能調節表觀和轉錄基因，分泌轉運蛋白、抗氧化酶、金屬螯合蛋白、有機酸、鐵載體、氨基酸和胞外聚合物等物質直接提高植物對金屬的抗性[87-88]。

3.1 與AMF的區別

AMF和NC endophytes都屬于內生真菌(endophytic fungi, EF)，但在生活方式和功能上差別較大。研究表明，NC endophytes可以定殖在難以形成菌根的十字花科植物[89]，在超耐受(metallophytes)和超富集植物中也比較常見。它們的生長并不依賴于宿主，可以獨立地完成生命周期，因此可以進行體外培養[90]。另外，它們還能定殖在宿主的葉片、莖和花等地上部組織中，而不局限于宿主的根部，這與AMF有很大的差異[91-92]。但是，在一些菌根植物中，也發現了NC endophytes的定殖，這說明AMF和NC endophytes可以同時共生于一種宿主，且NC endophytes的定殖比較自由。另外，這也引發了關于共生真菌功能的討論，即NC endophytes有何完全區別于AMF的功能？在二者功能重疊時，宿主如何進行共生選擇[90,93-95]？這些問題都還有待探究。并且這些研究對于理解AMF和NC endophytes，或者說對于根際微生物群如何影響宿主植物的Cr耐受也有重要的意義。

3.2 影響植物對重金屬的吸收和轉運

AMF的菌絲結構在吸收水分和營養物質，利用分泌物螯合及固持重金屬，降低重金屬的有效性，進而在提高植物的耐受中起到了很重要的作用，因此，與AMF共生的植物往往有比較短的根系[90]。但NC endophytes沒有為宿主吸收轉運營養物質的功能，雖然它也可以分泌螯合劑，利用菌絲固持部分重金屬，卻主要是通過刺激宿主根的伸長，增加根的表面積來獲取更多的營養[96-97]，當然在實際情況中，植物根系往往共生著多種真菌和細菌，它們的響應遠比單一接種時要復雜得多，即使共生有NC endophytes，它們也不一定會發揮出這種功能[98]。另外，在營養極度缺乏的條件下，NC endophytes可以利用自身的腐生性分解有機質[99]，必要時還直接被宿主捕食，改善宿主的營養狀況[100]。

另外，NC endophytes會通過分泌一些有機酸[101]、鐵載體、胞外聚合物及多酚類物質來降低金屬的有效性和毒性。而且NC endophytes可以分泌AMF無法分泌的檸檬酸鹽、草酸及鐵載體等物質[90]；還可以通過靜電吸附金屬離子或利用細胞質膜上的酶(如硝酸還原酶、依賴黃素腺嘌呤二核苷酸的GR等)、蛋白質和小分子等還原沉淀金屬離子，形成一些納米顆粒(nanoparticles, NPs)，降低金屬的毒性[102-103]。但是關于NPs的合成在植物根際的具體影響以及是否在AMF中也有應用還需要進一步探索。

與AMF相似的是，NC endophytes提高宿主對重金屬的耐受也基本展現出2種模式[88,104-105]。第1種模式是誘導植物抗性，降低金屬的吸收，有研究者發現給油菜(Brassicacampestris)接種一種從高污染土中分離的NC endophytesMucorsp. (class 2)之后發現Cr的吸收量降低了90%，這主要是因為真菌能夠活化土壤中的Cr后富集在菌絲結構中[105]。另外，隨著宿主植物和NC endophytes類型的改變，在植物均對重金屬的耐受性提高的前提下，有時重金屬從根向地上部的轉運增強，有時則降低，這說明NC endophytes提高宿主對重金屬耐受的機制是多樣的，但目前針對此的研究還明顯不足。第2種模式是增加植物對金屬的富集，尤其是在超富集植物中，但無論是AMF還是NC endophytes，它們在提高超富集植物對重金屬耐受的過程中扮演著怎樣的角色都還需要更深入的探究。

3.3 調節植物生理和分子過程

NC endophytes和AMF[58]都可以通過調節S代謝，生成GSH、PCs和金屬硫蛋白(metallothioneins, MTs)等物質螯合重金屬[106]，降低其生物有效性，并利用液泡區隔達到解毒的效果，大大提高植物對重金屬的耐受。另外，GSH還作為抗氧化劑緩解氧化脅迫[107]，Zhao等[108]對暴露在Cd中的NC endophytes嗜魚外瓶霉(Exophialapisciphila)測序后發現一些與金屬絡合、轉運和解毒，緩解氧化脅迫，維持內穩態以及S代謝有關的基因被上調表達[108]。

另外，Rozp?dek等[88]發現接種毛霉菌屬內生真菌Mucorsp.的擬南芥屬物種Arabidopsisarenosa在受到重金屬脅迫時根毛的長度、凈光合速率、體內的水分和P含量均顯著增加，并利用qPCR驗證植物體內與合成乙烯，維持離子內穩態、金屬內穩態和P內穩態有關的基因均上調表達，影響了重金屬的轉運和富集過程，提高了宿主對重金屬的耐受。但是，除此之外，對于NC endophytes如何通過調節植物生理和代謝過程以緩解金屬脅迫的研究少之又少。

4 外生菌根真菌(Ectomycorrhizal fungi, EMF)

EMF也是植物根際的一種共生菌根真菌。與AMF相似的是，它也能改善宿主的營養狀況，緩解干旱、病原菌、鹽分及重金屬等環境脅迫對宿主造成的損害[109]。有研究給黑松(Pinusthunbergia)接種土生空團菌(Cenococcumgeophilum)、彩色豆馬勃(Pisolithustinctorius)、紅蠟蘑(Laccarialaccata)和酒紅褶滑繡傘(Hebelomavinosophyllum)后通過盆栽和根袋實驗發現接種EMF可以促進宿主對營養物質的吸收，進而提高生物量，增強植物對Cu和Cd的耐受。在一個短期的暴露實驗中，接種EMF加速了植物對Cu和Cd的吸收。這說明EMF并非完全起到一個屏障的作用，而是可以通過改善植物的營養狀況促進生長，像AMF一樣起到“生長稀釋”的作用[110]。

過去對EMF提高宿主對金屬的耐受機制的研究中，很大一部分強調了共生EMF基因型的重要作用。研究者認為可以根據基因型將共生EMF分成2類，即敏感型和耐受型。敏感型通常分離于污染較輕的地區，對金屬脅迫的響應比較靈敏和強烈。而耐受型通常分離于高污染地區，是已經對金屬脅迫產生基因適應的物種，因此共生有耐受型EMF的植物往往對金屬的耐性也比較高[111]。

EMF會利用復雜的菌絲網絡，為根際的其他細菌提供礦質元素、水、光合產物和代謝產物[112]。同時，EMF還會釋放一些揮發性的信號分子如有機酸、海藻糖和乙醇等，影響共生微生物的種類，并與根際的微生物互作[113]。Fransson等[114]發現歐洲赤松(PinussylvestrisL.)接種雜色羊肚菌(Suillusvariegatus)和Pilodermafallax之后分泌出的有機酸和一種未鑒別出具體組成的復合物是影響微生物群落多樣性的首要因素。而有研究將黃硬皮馬勃(Sclerodermacitrinum)、捕蠅菌(Amanitamuscaria)和紅褐乳菇(Lactariusrufus)和一種假單胞菌共同接種到PinussylvestrisL.后發現植物增加了對Zn、Pb和Cd的富集，且減少了金屬從根到葉的轉運[115]，這說明EMF能與根際的其他微生物協同提高宿主對金屬的耐受。

與AMF不同的是，EMF無法侵入根細胞內，因此更多的是通過提高自身對金屬的耐受，在根表起到“保護屏障”的作用，間接地影響宿主對金屬的耐受，而非直接提高宿主對金屬的耐受能力。故接下來就圍繞EMF自身對金屬的耐受機制展開闡述。

4.1 胞外作用

4.1.1 對金屬的阻攔

真菌的細胞壁往往由含葡聚糖、幾丁質和半乳糖胺等的聚合物以及蛋白質組成，伴隨有大量游離的羧基、氨基酸、羥基、磷酸鹽和巰基官能團，可以結合重金屬[116]，并且不受真菌代謝活性的影響[117]。除此之外，細胞壁上的黑色素也可以增強金屬的生物吸附[118]。有研究聯合利用13C-NMR光譜、X射線衍射和紅外光譜觀察到了粗糙脈胞霉(Neurosporacrassa)細胞壁上Cd和幾丁質的復合物[119]。Martino等[120]發現在Cd和Zn的脅迫下，粉樹孢菌(Oidiodendronmaius)提高了體內聚半乳糖醛酸酶的活性，加強了果膠的水解，從而增強了對金屬的結合。

除此之外，EMF可以在宿主根表形成菌鞘(sheath)。Ashford等[121]利用熒光示蹤發現從根外到根表的溶液通道分布著密集的菌鞘結構，它像一個“屏障”阻擋金屬進入根表，抑制了金屬的遷移。而且，菌絲里的多酚也有結合和沉淀金屬的功能，有效地減少了進入根細胞的金屬量。

4.1.2 對金屬的結合

真菌的細胞壁可以釋放一些可以結合金屬的有機小分子，如二羧酸和三羧酸，也可以分泌有機酸，提供溶解金屬礦物復合物的質子[122]。但分泌有機酸的過程，受到金屬類型和真菌種類的影響[123]。

除了細胞壁及其分泌物，EMF的菌絲也在與金屬的結合中發揮著重要的作用。密集的菌絲既可以保護宿主[124]，也有利于宿主形成更強大的根系[125]，增強營養物質的轉運。Denny等[126]利用X射線微量分析研究卷邊網褶菌(Paxillusinvolutus)侵染的樺樹(Betulaspp.)中Zn的分布發現，有高濃度的Zn富集在根外菌絲的細胞壁和多糖黏液(polysaccharide slime)中。

4.2 胞內作用

4.2.1 對金屬的區隔

進入EMF胞內的金屬會被轉運到液泡等組織，與聚磷酸鹽[127]、無機離子、PCs、MTs、GSH和有機酸螯合[117]。在不同的真菌中，受到不同金屬類型的脅迫時產生的螯合劑可能不同。比如，受到Cd脅迫的Paxillusinvolutus會上調體內GSH、γ-谷氨酰半胱氨酸和一種金屬硫蛋白的表達，但PCs的表達量基本沒有變化。但是在耐受As的曲霉菌(Aspergillus)分離物中，則在As的脅迫下檢測到大量類植物螯合肽2(phytochelatin 2, PC2)復合物的生成。受到Hg和Cd脅迫的L.laccata沒有改變體內金屬硫蛋白的水平，而是上調了體內半胱氨酸、非蛋白的GSH以及它的前體γ-谷氨酰半胱氨酸的表達。

除了這些螯合劑，EMF還會在金屬脅迫時增加聚胺和精胺的合成，也能通過提高酪氨酸酶的活性，增加菌絲中的黑色素，進一步抑制金屬或其他離子通過菌絲進入細胞[128]。

4.2.2 對金屬的解毒

硫氧還蛋白的2個半胱氨酸殘基可以參與折疊和調節蛋白質，減少脫氫抗壞血酸的生成，修復受氧化損傷的蛋白以及S代謝等過程[129]，在金屬的解毒中起到很重要的作用。有研究者發現，受到Cu2+和Cd2+脅迫的Paxillusinvolutus上調了PiTrx1基因的表達[130]。另外，和其他微生物抗金屬氧化脅迫的機制相似，Ott等[131]發現在Cd脅迫下的Paxillusinvolutus誘導了SOD的生成，并且增加了GSH、依賴GSH的過氧化酶以及GSH還原酶的生成。

在分子水平上，有研究者直接從一種外生真菌Suillushimalayensis中分離出2個金屬硫蛋白基因：shMT1和shMT2，并在酵母突變型cup1Δ(Cu敏感)、ycf1Δ(Cd敏感)和zrc1Δ(Zn敏感)中做了功能互補表達，驗證了shMTs的功能，發現這2個基因相較于Cd更容易被Cu誘導，并在解毒的過程中發揮重要的作用[132]。

4.2.3 對金屬的外排

在耐受型EMF中，金屬的外排是為了防止金屬在細胞質和液泡中過度累積。這個外排體系不僅減少了金屬從真菌到共生界面的轉移量，也不會妨礙正常的營養物質轉運過程[133]。

目前關于EMF提高宿主植物Cr耐性機制的研究十分少，只能根據上述對其他金屬的研究進行了解和推測。例如，在受到Cr脅迫時，EMF的細胞壁是否可以發揮阻擋、結合的功能？是否可以在亞細胞水平上揭示Cr在EMF細胞壁或菌鞘、菌絲等結構中的微區分布？也可以從解毒機制的角度出發，探究不同EMF在受到Cr脅迫時，會分泌何種螯合劑，影響何種基因的表達？S的代謝產物是否也在Cr解毒中發揮著重要作用？有無對Cr敏感或Cr耐受的基因？關于EMF如何響應Cr的脅迫，提高植物對Cr的耐受，還存在太多未知有待探索。

5 總結與展望(Conclusion and prospect)

4種根際微生物作為金屬與植物接觸的“第一道屏障”，在提高宿主Cr耐受的過程中發揮著多樣且重要的作用。它們大多都能利用自身結構組織的特性或分泌一些螯合劑，結合根際環境中的金屬，降低金屬的有效性。此外，有的微生物如PGPR和AMF，可以顯著地改善宿主的營養條件，促進植物的生長。也有一些微生物可以刺激自身或植物細胞內與GSH、PCs和MTs等解毒關鍵物質相關基因的上調表達，以此降低金屬的毒性。另外，還有包括這4種在內的很多微生物及其功能沒有被完整和深入地研究和認識，因此展望如下：

(1)關于Cr在植物體內定位、分布、轉運和富集的過程還存在很多未知，需要更深入全面的探究。在未來生理和分子水平的研究中，可以通過利用更精密的分析方法如X射線吸收精細結構、掃描透射X射線顯微分析等，揭示Cr在共生界面和植物體內的轉化行為和微區分布，及利用分子學手段定位與鑒定參與調節植物內穩態、影響金屬行為的相關基因等，以期從更微觀的角度解釋微生物提高宿主Cr耐受的機制，為未來利用分子生物和基因工程等技術進行種質創新，更安全更高效地提高植物的產量，提高植物對金屬污染土壤的耐受等工作提供理論基礎。

(2)在實際的生長環境中，植物會受到微生物尤其是病原菌以及土壤酸化、鹽堿化和干旱等環境脅迫的多重影響，其根際的微生物也非互相獨立，而是和其他微生物形成一個復雜的互作網絡[134]，植物與微生物，微生物與微生物之間都在相互影響著[98]。當植物受到Cr脅迫時，功能相近的根際微生物占據的生態位有何不同，有多大程度的不同，植物會如何權衡以提高對Cr的耐受都是亟待回答的問題[90]。因此，可以開展一些田間試驗，并結合根際微生物互作網絡的研究，拓寬對實際環境中植物與微生物互作，微生物行為和功能的認識。反過來，這些研究也會幫助我們更深刻地認識根際微生物提高宿主Cr耐受的機制。