引黃灌區不同種植年限紫花苜蓿土壤真菌群落多樣性特征

牟紅霞, 張文文, 劉秉儒

(1.寧夏大學 西北退化生態系統恢復與重建教育部重點實驗室, 銀川 750021;2.北方民族大學 生物科學與工程學院, 銀川 750021)

紫花苜蓿(Medicagosativa)屬于多年生草本植物，且這種植物的根系比較發達、抗鹽堿、擁有較好的適應能力、能夠防風固沙、改良土壤等多種特性[1]。因其具有高產量、高品質，可用于放牧、青貯飼料和干草的制備等多種利用方式，因此將其作為牧草栽培中的優良品種。紫花苜蓿是我國種植面積居首位的牧草，具有十分重要的生態和經濟效應。關于紫花苜蓿生長年限對土壤理化性狀和肥力研究均有報道，比如，有研究已證明，生長年限對土壤理化性狀和肥力均有影響，除pH值外不同種植年限間有著一定的差異性[2-3]，土壤中有機質和全氮的含量隨種植年限增加而增長，但其增長率會隨種植年限增加而下降，這表示其增幅具有一定的周期性[4-5]。同時苜蓿地土壤中養分增長年限會因為區域的不同而有所不同，在中國黃土高原地區，通常其土壤有機質、全氮增長期表現在5～10 a[6]。但是在一些干旱地區，種植4 a左右，土壤養分含量相對來說比較高[7]。對“黑土灘”不同建植年限栽培草地的研究則發現土壤養分變化表現為2 a一個周期的變化規律[8]。土壤養分增加幅度和周期受到土壤微生物的調控，但是對苜蓿種植年限的土壤微生物群落結構變化及演變規律與影響因素知之甚少。

微生物是整個土壤生態系統之中最為關鍵的分解者，參與到了土壤碳氮養分循環的過程之中，是土壤中肥力的重要活性因子[9-10]。真菌是土壤中微生物的一個主要成分，大約占微生物總量的90%[11]。而微生物量快速周轉過程中逐步釋放的供植物生長的有效營養，主要受真菌菌群的調控。同時在植物有機體分解的初期過程中，真菌是比較活躍的，因此真菌在生態系統營養循環中具有關鍵作用[12]。在降雨量只有200 mm左右的引黃灌區，紫花苜蓿種植有著得天獨厚的優勢，使其產量更高、品質更好，在這樣的水土條件下，微生物真菌的群落結構和功能與其他地區有怎樣的差異尚不清楚。因此，本研究從土壤微生物中真菌多樣性特征入手，通過不同種植年限苜蓿地土壤肥力變化與真菌群落多樣性變化之間的某種規律，尋找影響土壤肥力的主要真菌菌群，為引黃灌區紫花苜蓿連種提供一個穩定的土壤養分循環系統。

因其真菌的種類非常多，而且個體間的多態性不是非常明顯，因此采用傳統的方法對真菌進行正確的分類存在較大的困難[13]。本研究使用高通量測序的方法對其土壤中的真菌多樣性進行全面的分析。深度測序的性能是高通量測序技術的優勢[14]，同時也給微生物方面的研究提供了一定技術層面的便利。本研究以寧夏賀蘭山人工紫花苜蓿農場種植時間為1～6 a的紫花苜蓿地為研究對象，研究其土壤養分分布特征，并使用18SrDNA擴增子測序技術分析土壤中真菌結構及多樣性特征。進而從土壤真菌群落變化和養分動態變化等角度篩選探索最佳的牧草種植期，并為西北地區紫花苜蓿土壤養分管理和大面積栽培及高質量生產提供科學指導[15]。

1 研究區概況

研究區位于寧夏銀川市賀蘭山的人工苜蓿農場(38°30′N，106°06′E)，海拔高度為1 135 m，位于我國西北內陸，是中溫帶干旱區[15]。晝夜溫差較大，該地區年平均氣溫8.4℃，年最低氣溫為-20℃，極端最高氣溫為38℃，年平均降水量為189.9～216.1 mm，年蒸發量為2 250.0 mm左右。年平均日照時間為3 075.5 h，無霜期為160 d。人工苜蓿農場從2012年開始，每一年都有新種植的同種苜蓿。

2 材料與方法

2.1 樣品采集

本研究以種植年限為1～6 a(2012—2017年)的紫花苜蓿地為研究對象，苜蓿地的灌溉條件、灌溉制度、氣候降水及土壤類型一致，均為地形平坦的灌區土壤環境，試驗設置的6個不同年限處理中，每個處理設置3個面積為30 m×30 m的重復，在每個重復樣地使用土壤鉆按照5點混合法取0—20 cm深度的土壤[15]，每個土樣采集1份，在試驗樣地將一小部分裝入經高壓滅菌后的凍存管，貼上標簽，立即放入-4℃的保溫箱。剩余樣品裝入自封袋，并對其進行相應的標記。隨后將土樣帶回實驗室，凍存管轉移至-80℃冰箱保存，用于真菌群落的測定。自封袋中的樣品在實驗室自然風干，并將土壤中植物碎屑和細根等雜質剔除，按要求過篩后用于測定土壤的各項理化指標。

2.2 土壤理化性質的測定

土壤的pH值、電導率是通過水土比2.5∶1的懸液，用PHS-3C酸度計和便攜式電導率儀測定。土壤全氮采用elementer元素分析儀進行測定。采用堿解擴散法對堿解氮進行測定。用重鉻酸鉀氧化—外加熱法測定土壤中的有機碳。全磷采用NaOH熔融—鉬銻抗比色法。速效磷是用NaHCO3浸提—鉬銻抗比色方法測定的[16]。最后采用SPSS 19.0對土壤理化數據進行方差分析和多重比較。

2.3 土壤基因組DNA提取及HiSeq測序

土壤在碾碎過80目篩后，第一步是先使用SDS對樣本中的DNA進行提取，然后使用瓊脂糖凝膠電泳測定樣本中DNA的程度和濃度，取出一定量的樣品，然后將其置于離心管內，使用無菌水稀釋樣品至1 ng/μl[17]。以稀釋后的基因組DNA為測序模板，根據測序區域的選擇，使用Barcode的特異引物528F和706R，New England Biolabs公司的Phusion?High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer和高效高保真酶進行PCR處理，確保擴增效率和準確性，之后通過HiSeq 2500 PE 250進行上機測序[18]。

2.4 生物信息學分析

下機數據通過預處理，將一些質量較低的reads移除，然后將成對reads拼接成一條序列，為得到高質量的reads，對tags兩端的barcode序列及引物序列進行去除，去除掉嵌合體以及短序列之后獲得clean tags。通過對經拼接過濾后的clean tags與物種注釋數據庫比對來檢測嵌合體序列，同時去除其中的嵌合體序列[19]，得到最終的Effective Tags，對所有樣本的全部Effective Tags進行聚類，默認以97%的一致性(Identity)將序列聚類成為OTU(Operational Taxonomic Units)，同時依據其算法原則篩選出OTU中出現頻數最高的序列作為OTUs的代表序列，對OTU代表序列進行物種注釋，使用Qiime軟件(Version 1.9.1)之中的blast方法[20]與Unit數據庫對物種進行注釋分析，而且對于每個分類水平：kingdom(界)，phylum(門)，class(綱)，order(目)，family(科)，genus(屬)，species(種)進行分類統計，統計其群落組成以及各個樣本的豐度信息。

2.5 多樣性分析

Alpha多樣性分析是對單個樣品中物種多樣性分析，基于OTU的結果，同時利用Qiime軟件(Version 1.9.1)計算出菌群豐度指數(Chao1，ACE)和菌群多樣性指數的大小(Shannon，Simpson)[21]；Beta多樣性是比較和分析不同樣本的微生物群落構成。同樣是基于OTU的結果計算Unifrac距離，之后使用OTU的豐度信息對Unifrac距離進一步構建Weighted Unifrac距離[22]。最后，通過多變量統計學方法PCA主成分分析、PCoA主坐標分析和Beta多樣性指數組間的差異分析，從而發現不同樣本(組)之間的差異。

2.6 環境因子關聯分析

研究環境因子與物種之間，環境因子與物種豐富度(alpha多樣性)之間的相關性，目前常用的有Spearman相關性分析和Mantel test分析。Spearman相關性分析以Spearman相關系數作為量度，Spearman相關系數又被叫做秩相關系數。其基本原理也就是兩變量所具有的秩次大小不同進行線性分析，對于數據的原始變量分布沒有進行要求，這是一種非參數類型的分析辦法，其適用范圍比較廣泛；Mantel test是對兩個矩陣相關關系的檢驗，總的來說，它是兩個不同總體之間的相關關系，多用于生態學上，Mantel test用于計算環境因子和微生物群落數據的相關性，是對兩個矩陣相關關系的檢驗。

3 結果與分析

3.1 不同種植年限紫花苜蓿土壤基本理化指標分析

研究區pH值在8.5～8.7，屬于堿性土壤，第1年和第6年存在顯著差異，但相差數值僅為0.11，所以長期種植苜蓿對土壤酸堿度影響很小。對苜蓿地土壤樣本進一步進行主要養分分析得到：電導率、有效磷和全磷含量均無顯著變化，有機碳、全氮和堿解氮含量均呈先降后回升的趨勢，且在第5年達到最大，說明隨著種植年限的增加，苜蓿地土壤養分變化可能表現為循環往復的波浪式變化趨勢(表1)。

表1 不同種植年限紫花苜蓿土壤理化指標

3.2 紫花苜蓿土壤真菌OTU水平分析

為了準確地認知各樣本OTU聚類情況和注釋情況，對OTU聚類及注釋結果進行了綜合統計和分析，其中Total Tags是每個樣本的總Tags數目，用于OTU聚類等后續分析的有效數據；Taxon Tags是用于構建OTUs并且獲得注釋信息的Tags數目；Unclassified Tags指的是沒有獲得注釋信息的Tags數目；Unique Tags是頻數為1，并且無法被聚類到OTUs的Tags數目，所以不對其進行后續分析，詳細的統計數據如表2所示。在樣本之中隨機性的進行抽取測序量的數據，對他們的物種數目進行統計(也就是OTUs數目)，將測序數據量和其對應的物種數來構建曲線，即稀釋曲線，稀釋曲線能夠直觀地反映出測序數據量是否科學合理，同時能夠間接地反映出物種的豐富度，如圖1所示，曲線傾向于平坦，表明測序數據的科學合理，而更多的數據量只會產生少量新的物種。

表2 不同種植年限苜蓿地OTU聚類和注釋情況統計

圖1 土壤真菌稀釋曲線分析

3.3 不同種植年限苜蓿地土壤真菌群落組成

圖2和圖3分別展示了6組樣品，在綱水平和屬水平下豐度前10的真菌群落組成情況。在綱水平上，鑒定的豐度前10的菌占了總數中的73%，其中包括糞殼菌綱(Sordariomycetes)(44%)、座囊菌綱(Dothideomycetes)(12%)、散囊菌綱(Eurotiomycetes)(6%)、盤菌綱(Pezizomycetes)(3%)、絲足蟲綱(Incertae)(4%)為優勢菌，所占比例高達69%，不同菌隨種植年限的的變化呈現不同的變化規律(圖2)。在屬水平上，共鑒定出328個屬，豐度前10的菌占總數的27%，其中毛殼屬(Chaetomium)(8%)、鐮孢屬(Fusarium)(7%)、赤霉菌屬Gibberella(4%)、Lectera(1%)、小畫線殼屬(Monographella)(1%)，除毛殼屬隨著種植年限的不同有較大變化外，其余菌屬變化都較為穩定(圖3)。

圖2 不同種植年限苜蓿地土壤真菌群落相對豐度前10真菌綱

圖3 不同種植年限苜蓿地土壤真菌群落相對豐度前10真菌屬

3.4 不同種植年限苜蓿地土壤真菌生物多樣性

3.4.1 單個樣品Alpha多樣性分析 對指示群落結構改變的4個Alpha多樣性指數Shannon，Simpson，Chao1以及ACE指數展開組間差異性分析。表3結果表明，Simpson指數隨種植年限的不同并沒有發生顯著性變化，Shannon，Chao1和ACE指數均在種植時間為5 a時達到最大，2 a時達到最小，且差異達顯著水平，由此可知在種植時間為5 a時，土壤真菌菌群豐度和多樣性均達到最高，變化規律從大到小依次為5 a>6 a>1 a>4 a>3 a>2 a。

表3 不同種植年限苜蓿地土壤真菌Alpha多樣性指數

3.4.2 復雜樣品的真菌群落Beta 多樣性分析 Beta多樣性是指利用Weighted Unifrac距離對兩個樣品之間的相異系數進行衡量，其數值越小，表示兩個樣本在物種多樣性方面差異性越小。Beta多樣性分析表明，種植時間為1 a和2 a，3 a和4 a，2 a和4 a之間的相異系數從大到小分別為0.554，0.489，0.482，這3組樣本物種多樣性差異達到最大；而2 a和3 a，4 a和5 a，2 a和5 a之間相異系數從小到大分別為0.26，0.298，0.364，因此可以得到種植時間為2 a和3 a時，其物種多樣性組成相似性最高(圖4)。

圖4 加權Unifrac的熱圖

3.5 土壤環境因子與真菌群落組成相關性分析

對屬水平下真菌群落組成與土壤環境因子展開Spearman相關性分析，結果表明：pH值、AN和SOC與一部分真菌間存在顯著或極顯著相關性。pH與Gibellulopsis、鏈格孢屬(Alternaria)具有極顯著正相關關系，與Lectera、小畫線殼屬(Monographella)具有顯著負相關關系，與金孢子菌屬(Chrysosporium)呈顯著正相關關系；AN與Lectera具有極顯著負相關關系，與木霉屬(Trichoderma)呈顯著正相關關系，與金孢子菌屬(Chrysosporium)呈顯著負相關關系；SOC與綠僵菌屬(Metarhizium)、小畫線殼屬(Monographella)、漆斑菌屬(Myrothecium)具有顯著負相關關系。EC、TP和TN與個別屬類存在顯著相關性(圖5)。

圖5 環境因子相關性分析熱圖

4 討 論

土壤真菌數量大，種類多，是檢測土壤質量變化的重要指標，在評價土壤生態系統等功能方面具有重要作用[23]。本研究通過對不同種植年限苜蓿地土壤在綱水平和屬水平下真菌群落組成中豐度占比前10的菌類分析發現，糞殼菌綱、座囊菌綱、散囊菌綱、盤菌綱、絲足蟲綱為優勢菌綱，毛殼屬、鐮孢屬、赤霉菌屬、Lectera、小畫線殼屬為優勢菌屬。其中糞殼菌綱占總綱類真菌的44%，而且隨著種植年限的增加，沒有大的波動，糞殼菌是一種寄生在動物糞便上的真菌，因此糞殼菌成為最具優勢菌的原因可能是農田管理過程中大量農家肥施入的結果，其他優勢菌類隨著種植年限的增加，表現為先減小后增大的變化趨勢，這與土壤理化指標變化基本保持一致。在屬水平下，土壤真菌群落由于受pH值，AN和SOC等理化因子的影響，隨著種植年限的增加，各菌屬變化不再呈現規律性變化。相關的研究顯示，鐮刀屬、毛殼屬和木霉屬在土壤中是常見的纖維素分解者[24]，而本研究發現毛殼屬為6個樣本中最具優勢的真菌，占總菌屬的8%，因此毛殼屬可能是影響苜蓿地土壤碳循環的主要真菌菌屬[25]。

土壤微生物群落多樣性通常用多樣性指數的大小來分析，多樣性指數越高則微生物群落多樣性越高[26]。本試驗通過對指示群落結構變化的Alpha多樣性指數進行組間差異性分析，最終研究結果表明，Simpson指數不受種植時間的影響，而Shannon指數、Chao1指數和ACE指數表現出相同的變化規律，即均在種植2 a時達到最小，5 a時達到最大，且差異達顯著水平，因此連種苜蓿會使土壤中真菌菌群的多樣性處于一個較高的水平，這與Wal等[27]發現休耕地土壤真菌多樣性指數也處于較高水平的研究結果保持一致，畢明麗[28]、孫倩[29]等研究結果也支持這一結論。Beta多樣性分析結果顯示，隨著種植年限的增加，土壤真菌多樣性變化表現為由變幅較大到逐漸趨于平穩的趨勢，各種植年限間相異系數可反映這一變化規律。

已有研究表明，土壤真菌多樣性和群落組成受多種因素影響，土壤環境是其中一個重要因素[30-31]，因此對屬水平下真菌群落組成與土壤環境因子進行Spearman相關性分析，有助于探索影響不同種植年限苜蓿地土壤真菌群落結構及多樣性的主要影響因子。結果表明土壤pH值，AN和SOC與一部分真菌間存在顯著或極顯著相關性，EC、TP和TN與個別真菌存在顯著相關性，AP與所有真菌不具有相關性。Liu等[32]研究發現，速效磷對土壤真菌群落結構具有較大影響，且施磷肥會提高土壤真菌多樣性[33]，而本研究中，速效磷變化范圍為7.89～14.15，隨著種植年限的增加未發生顯著性變化，因此未能體現影響程度。Beare等[34]提出免耕少耕能增加真菌菌群的多樣性，增加不穩定碳的固定積累，進而影響土壤有機碳含量，這與本研究Spearman相關性分析結果一致。本研究中pH值隨著種植年限的變化第1年與第6年存在顯著性變化，且pH值與真菌屬水平下存在顯著或極顯著相關性，這與韓世忠等[35]研究發現土壤pH值會對真菌群落結構組成造成影響的結果一致。

5 結 論

毛殼屬、鐮孢屬、赤霉菌屬、Lectera、小畫線殼屬這是在不同的種植年限苜蓿地土壤中的優勢菌群，隨著種植年限的增加并無顯著性變化；多樣性指數分析結果顯示，土壤中的養分以及真菌群落組成和豐度都在種植5 a的時間達到峰值；Simpson指數隨種植年限的增加無顯著性變化；種植時間為1～6 a的苜蓿地土壤真菌的多樣性組成相似度較低，土壤pH值、速效氮和有機碳是影響真菌群落組成及多樣性的主要環境因子。