基于微觀結構和蛋白質組學分析影響豬肉持水性的差異蛋白

楊波若，李華健，蘇婭寧，李 霞，瞿 靜，陳 韜

（云南農業大學食品科學技術學院，云南昆明 650201）

蛋白質組學是通過將基因表達的信息翻譯為蛋白質，進而研究蛋白質的一門學科[1]。通過蛋白質組學實驗可以對肉類在蛋白質水平進行定性、定量分析[2]。目前，被廣泛用于肉及其制品研究的定量蛋白質組學鑒定技術主要有無標記定量（Label-free）測定技術和標記（Stable isotope labeling）定量測定技術[3-4]。無標記測定蛋白組學技術，具有通量大、線性范圍廣和檢測價格低等優勢，但對前期樣品制備和質譜穩定性要求較高，在檢測豐富度較低的蛋白時靈敏度低[5]。標記定量技術主要包括多肽體外標記技術（Tandem Mass Tag, TMT）和標記相對定量技術（isobaric tags for relative and absolute quantification，iTRAQ）。標記定量技術在檢測中靈敏度高，但在樣品復雜的情況下，母離子共篩選和共碎裂會對其結果產生干擾[6]。

持水性（Water-holding capacity, WHC）是指宰后肌肉對其內部水分束縛的能力，常用汁液流失率（drip loss）的高低來衡量。研究發現，汁液流失率的高低受宰后溫度、pH下降速率、細胞骨架蛋白降解程度、氧化應激反應程度和肌細胞微觀結構的變化等因素影響[7-8]。目前有研究發現，宰后汁液流失現象與蛋白質變化有密切的聯系[9-10]。已有研究人員利用蛋白質組學鑒定技術對宰后牛肉、鵝肉、雞肉和豬肉進行持水性的研究，其中，Luca等[11]通過SDSPAGE和質譜分析對貯藏期的豬肉滲出液進行蛋白質組學鑒定，發現高汁液流失組滲出液中Hsp70表達量顯著高于低汁液滲出組；Gap-Don等[12]通過液相二級質譜對宰后豬最長肌的不同部位進行蛋白質組學分析，發現各段磷酸甘油變位酶的表達量不同可能導致不同段豬最長肌的持水性不同。國內外學者在研究宰后蛋白質組變化對肉品質的影響時多采用無標記蛋白組學和iTRAQ蛋白質組學進行分析，然而有研究表明iTRAQ蛋白質組學鑒定技術比TMT多肽體外標記技術靈敏度低，噪音信號干擾較大[13]。

本實驗采用TMT多肽體外標記定量蛋白質組學技術，結合UniProt蛋白數據庫對宰后初期不同持水能力的豬背最長肌樣品進行蛋白質組比較，找到兩組間存有差異的蛋白，探討兩組豬肉持水能力不同的原因，為提高肉的持水能力提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

三元雜交豬 在曲靖市東恒經貿集團食品有限公司屠宰場選擇品種和飼養條件相同、體重相近（105±5 kg）的三元雜交豬（大河烏豬 × 約克夏 × 長白豬）作為樣品；蛋白酶抑制劑 Calbiochem公司；胰蛋白酶 Promega公司；碘代乙酰胺（分析純）、二硫蘇糖醇（分析純）、尿素（分析純）、三乙基碳酸氫銨（TEAB）（分析純）、三氟乙酸（分析純） 美國Sigma公司；BCA試劑盒 碧云天公司；TMT標記試劑盒、預染標記物 Thermo Fisher Scientific公司；二甲苯（分析純） 中國上海試劑廠；檸檬酸（分析純） 湖北津樂達化工有限公司；醋酸鈾（分析純）

北京中科光析化工技術研究所。

Bio Rad通用迷你垂直電泳細胞電泳槽、電泳儀電源、IMARK酶標儀 伯樂生命醫學有限公司；JY92-ⅡN高強度超聲處理、Velocity 18R離心機英國Dynamica Scientific Ltd.公司；HI9025C便攜式pH計 意大利哈納；1000納米高效液相色譜、164568液相柱、Q-Exactive質譜儀 Thermo Fisher Scientific公司；JEM-1011透射電子顯微鏡 日本電子株式會社（JEOL）；Agilent 1260高pH反向液相色譜 美國安捷倫科技公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品制備 依照生豬屠宰操作規程（GB /T17236-2008）進行屠宰，宰后進行四分體分割。依據Warner等[14]和Florowski等[15]的標準，選取10條蒼白發軟表面有汁液滲出的肉（pale, soft exudative，PSE）樣品：L*＞50， 汁液流失率≥5%，pH45min≤5.8, pH24h≤5.5；;10條正常肉（Reddish-pink,firm, nonexudative，RFN）樣品：L*=42～50, 汁液流失率＜5%， pH45min＞5.8， pH24h=5.6～6.0。樣品為左側背最長肌第七腰椎段至最后腰椎段肌肉。樣品用保鮮膜包裹，放在4 ℃的條件，在不同時間點取樣用于基本指標測定、蛋白質組學檢測和電鏡拍攝。測定汁液流失率后，挑選汁液流失率最高的3個樣品（汁液流失率分別為：5.66%、5.78%和6.36%）和汁液流失率最低的3個樣品（汁液流失率分別為：0.57%、0.81%和1.06%）用于蛋白質組學分析和其他指標測定。

1.2.2 檢測指標及其測定方法

1.2.2.1 基本肉質指標測定 在4 ℃的冷藏環境中，將矯正好的便攜式pH計的pH探頭和溫度探頭插入待檢測豬背最長肌樣品內部3 cm處，測定宰后9、24 h時樣品背最長肌的溫度和pH。

參照Honikel等[16]的方法測定汁液流失，具體如下：將之前準備好的樣品切成2.5 cm的肉片，用精度為萬分之一的天平稱重，記做W1，稱重后用細鐵絲穿過肉片進行固定，使肌纖維始終保持垂直向下，放置在清潔干燥的聚乙烯薄膜袋中（肉片與袋壁要保持距離，不能接觸袋壁），扎緊袋口后吊掛于4 ℃冷庫中，24 h后取出肉片再次稱重，記做W2，依據公式計算汁液流失率。

稱取25 g樣品，剔除外表脂肪和筋膜，剁成鮮肉肉糜，取10 g肉糜放在105 ℃的恒溫干燥箱中干燥至恒重，將肉糜用濾紙包裹好放入萃取套管中，啟動通風櫥。將160 mL石油醚加入萃取杯中沒過濾紙包，萃取循環設置在10 次/h，連續萃取6 h，取出抽提杯（包括濾紙包）并放置于硅膠干燥器中過夜，第二日將抽提杯放入真空干燥箱內（80 ℃，13 kPa）干燥1.5 h后取出稱重記做B1，依據公式計算肌間脂肪含量。

1.2.2.2 肌肉微觀結構觀察 參照Luo等[17]的方法，將樣品置入3.5%戊二醛試劑（pH 7.2）中進行2 h的前期固定，用0.1 mol/L磷酸緩沖液沖洗樣品表面殘留的前期固液，沖洗完成后，用2%的鋨酸進行1.5 h的后期固定。兩次固定完成后，將樣品取出放入乙醇溶液中脫水，脫水完成后從乙醇溶液中移至室溫下的丙酮溶液中，用Epon-618滲透包埋并切片。用檸檬酸鉛-醋酸鈾對切片進行染色，在4000倍的電子顯微鏡下得到細胞內外間隙圖片。對每個樣品的9和24 h分別進行8～10張數字照片的拍攝，用Image-Pro Plus 5.1（Image House, Denmark）軟件測量肌細胞膜與細胞體之間的平均寬度（細胞內間隙）和肌細胞之間的平均寬度（細胞外間隙）。

1.2.3 TMT定量蛋白質組學檢測

1.2.3.1 蛋白質提取 稱取0.8 g組織樣品放置于提前用液氮預冷的研缽中，添加液氮充分研磨至粉末狀，加入1%的蛋白酶抑制劑裂解緩沖液，在高強度超聲處理機中進行超聲裂解后，放入離心機，調至4 ℃，12000×g離心10 min，去除細胞膜等碎片，將上清液吸取至干凈的離心管內，利用BCA試劑盒在IMARK酶標儀中對蛋白濃度測定。

1.2.3.2 高速液相色譜分級 使用色譜柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）對酶解后肽段進行多肽體外標記（Tandem mass tag，TMT），用pH反向高速液相色譜（High performance liquid chromatography，HPLC）分級，具體操作如下：肽段用pH=9、分級梯度為8%（8 min）、16%（35 min）、32%（25 min）的乙腈，流速均為1.0 mL/min，分離出60組分后將分離的肽段以9組分合并，合并完成后再次進行真空冷凍干燥處理以便后續操作。

1.2.3.3 液相色譜-質譜聯用分析 使用液相色譜流動相A相溶解肽段后用超高效液相系統將肽段分離。流動相A、B均為甲酸乙腈混合而成的水溶液，流動相A[0.1（v/v）甲酸、0.2（v/v）乙腈]；流動相B（0.1%甲酸、90%乙腈）。對液相進行梯度設置：0～38 min，6%～22% B；38～52 min，22%～32% B；52 ～56 min，32%～80% B；56～60 min，80% B, 維持流速75 nL/s。通過數據依賴型掃描（DDA）程序對數據進行采集匯總，將一級掃描中信號強度前20%的肽段用28%的能量碎裂，后用二級質譜逐個進行分析。

1.2.3.4 蛋白質鑒定 使用UniProt 數據庫中Sus_scrofa_9823_PR_20190816庫作為搜索數據庫，利用Proteome Discoverer 2.2軟件對檢索數據過濾：認為可信度99%以上的肽段為可信肽段PSMs（peptide spectrum matches），含有單個肽段（特有肽段）的蛋白為可信蛋白，只保留可信的肽段和可信蛋白，使用FDR對其驗證，舍棄FDR大于1%的肽段和蛋白。對鑒定到的蛋白進行GO蛋白注釋。

1.2.3.5 差異蛋白的確定 根據譜圖峰面積可得每個樣品中各個可信肽段的相對定量值，將鑒定出的特有肽段中所包含所有肽段匹配定量信息校正后，得到特有肽段的相對定量值，最后將通過特有肽段在蛋白質中的含量對蛋白質進行相對定量。將高汁液組和低汁液組中多次重復實驗得到的質譜峰面積的均值之比作為差異倍數（Fold Change，FC），對FC≥1.2倍的蛋白的質譜峰面積值進行t-檢驗，P值作為顯著性指標，應用超幾何檢驗計算P值，以P≤0.05為閾值，將FC≥1.2倍，且P≤ 0.05的蛋白定義為高汁液流失組和低汁液流失組中表達量存在顯著差異的蛋白，最后針對篩選出來的差異蛋白進行GO功能富集分析。

1.3 數據分析

數據采用SPSS 23.0（SPSS程序，SPSS Inc.，Chicago，IL，USA）進行平均值、標準誤差、聚類分析和相關性分析。使用image J測量軟件對現有電鏡圖片進行細胞間距的測量。使用Inter Pro Scan v.5.14-53.0對差異蛋白進行GO注釋，R package networkD3 v.0.4繪制差異蛋白互作圖。

2 結果與分析

2.1 肉樣基本指標測定及微觀結構觀察

從采集到的樣品中挑取汁液流失率最低的三個樣品和汁液流失率最高的三個樣品（每個樣品重復5次），分為兩組，即高汁液流失組（High Drip Loss Group，H組，n=3）和低汁液流失組（Low Drip Loss Group, L組, n=3）。將兩組樣品存放在4 ℃環境下，于9 和24 h后分別測量兩組樣品的pH、溫度、肌細胞內間隙（Intracellular space）、肌細胞外間隙（Extracellular space）和肌間脂肪（instramusclar fat,IFM）含量（見表1）。

表1 宰后存放在4 ℃下9 和24 h的H組與L組的樣品的肉質指標Table 1 Meat quality indicators of samples in the H-group and L-group after slaughter at 4 ℃ for 9 and 24 h

如表1所示，H組汁液流失率極顯著高于L組（P＜0.01）。宰后9 h時，H組pH顯著低于L組（P＜0.05），24 h時H組溫度極顯著高于L組（P＜0.01）。宰后溫度和pH的變化是由糖原代謝引發的，肌肉的pH下降主要是由肌糖原無氧糖酵解產生乳酸以及ATP分解產生的磷酸根離子造成的[18]。pH的下降加速了肌動球蛋白形成和肌肉收縮，從而加速汁液流出。

在電子顯微鏡下，觀察到H組和L組樣品的肌細胞微觀結構如圖1所示。宰后9 h的L組中（如圖1A），肌原纖維的排布有序且緊湊，肌細胞膜緊密地貼合在肌細胞周邊，肌細胞與肌細胞間幾乎沒有縫隙，而H組中（見圖1C），肌原纖維排布松散，部分肌細胞膜脫離肌細胞，肌細胞間的間隙大于9 h的L的組。在宰后24 h的L組中（見圖1B），大面積細胞膜脫離肌細胞，細胞內間隙和細胞外間隙對比9 h均增大。而H組中（見圖1D），肌細胞膜與肌細胞間的間隙增大，與24 h時L組相比，肌細胞之間呈現出更大程度的分離。為了量化宰后肌細胞微觀結構變化，使用Image-Pro Plus 5.1測量肌細胞內、外間隙。測量結果如表1所示，宰后9～24 h，H組和L組的肌細胞內外間隙值均增大，且L組細胞內外間隙小于H組，其中在24 h時，L組的細胞外間隙極顯著小于H組（P＜0.01）。肌細胞內外間隙的大小與汁液流失的相關性分析如表2所示。肌細胞內外間隙均與汁液流失率呈正相關。在24 h時，肌細胞外間隙同汁液流失呈顯著正相關（P＜0.05），這表明細胞內外間隙越大的樣品汁液流失率越高，即保水性（WHC）越弱。Sch?fer等[19]研究也發現宰后肌細胞間隙大，對肉的WHC有負面影響，與本實驗結論相同。

圖1 宰后9 h和24 h時的兩組不同汁液流失率肉樣微觀圖片Fig.1 Microscopic photos of two groups of meat samples with different drip loss at 9 h and 24 h after slaughter

表2 宰后背最長肌中細胞內外間隙與汁液流失率的相關性Table 2 Correlation between intracellular and extracellular spaces and drip loss rate in the longissimus dorsi muscle

2.2 蛋白質鑒定結果

對宰后9 、24 h時L組與H組的樣品采用肽質量指紋法進行蛋白質組學鑒定，對所有鑒定到的酶解后肽段進行蛋白分析。成功識別出2299個蛋白質，可以進行定量的蛋白質為1476個。兩組中有57個蛋白的表達量差異顯著，如表3所示。

2.2.1 結構蛋白 結構蛋白變化對肉的持水性有重要影響，宰后結構蛋白降解會破壞肌纖維的穩定性[8]。實驗結果發現，在宰后24 h兩組間錨蛋白1（Ankyrin 1）和層粘連蛋白（Laminin）亞基表達量存在顯著差異。錨蛋白1是結構蛋白家族中重要的一員，可將細胞骨架蛋白固定在細胞上，維持細胞形態穩定[20]。本實驗發現，宰后24 h，L組中錨蛋白的表達量為H組1.32倍。這表明錨蛋白表達量高，有助于增強細胞穩定性，減少汁液流失。與Aslan等[21]研究的錨蛋白1基因表達量越多，肌肉的持水性越強一致。層粘連蛋白是位于細胞膜上的結構蛋白，與細胞外基質相連。本實驗觀察到宰后24 h時L組層粘連蛋白的亞基（Laminin α4）表達量為H組的1.21倍，且24 h的L組細胞外間隙明顯小于H組（表1）。L組中鑒定到的層黏連蛋白亞基表達量越高，說明該蛋白在L組中存在越完整，細胞與細胞外基質的連接更加緊密，Sch?fer等[19]等發現細胞與細胞外基質間間距小，有助于減小細胞間間隙，從而提高肌肉的持水能力。本文推測L組中汁液流失量低可能與其內laminin表達量大，細胞間間隙小有關。

2.2.2 糖酵解相關蛋白 宰后由肌肉向肉轉化的過程中，無氧呼吸逐步代替有氧呼吸，肌細胞中與糖酵解相關的酶隨即也發生變化，這些酶變化會影響糖酵解的速率，從而影響汁液流失率。宰后9、24 h時，L組中葡萄糖磷酸變位酶-1的表達量均高于H組，而轉酮醇酶和磷酸甘油變位酶的表達量均低于H組。

葡萄糖磷酸變位酶-1（Phosphoglucomutase 1，PGM1）是肌間脂肪（intramuscular fat；IMF）合成的還原性輔因子[22]。有研究表明，在葡萄糖磷酸變位酶-1基因表達量高的樣品中IMF含量高，汁液流失率低[23]。Watanabe等[24]實驗發現，在豬最長肌中，IMF含量高的組，汁液流失率低，持水能力強。本實驗發現在宰后9、24 h時，L組的葡萄糖磷酸變位酶-1表達量分別為H組的1.34倍和1.23倍，且L組的IFM含量（表1）顯著高于H組（P＜0.05）。L組肉具有較低的汁液流失率可能是因為葡萄糖磷酸變位酶-1表達量高，IFM含量大，肌肉持水性強。

磷酸甘油變位酶（Phosphoglycerate mutase，PGAM2）是糖酵解途徑中重要的酶，參與了糖酵解途徑的最后一個步驟：丙酮酸在厭氧條件下轉化為乳酸。肌細胞中磷酸甘油變位酶表達量高會導致3-磷酸甘油酸和磷酸烯醇丙酮酸表達量升高，進而能促進丙酮酸轉化為乳酸[25]，降低肌肉的pH，影響肉的持水性、肉色和肌間脂肪表達量[26]。有報道證明磷酸甘油變位酶基因表達量與肉的WHC呈負相關[27]，即磷酸甘油變位酶表達量越高，汁液流失率越高。實驗顯示，在9、24 h時H組中磷酸甘油變位酶表達量分別為L組的1.21和1.24倍。導致H組肉樣高汁液流失的原因可能是肌細胞中磷酸甘油變位酶表達量高，促使丙酮酸轉化為乳酸，造成低pH和高汁液流失（表1）。

表3 宰后9 h和24 h高低汁液流失組存在顯著差異的57個蛋白Table 3 57 proteins with significant differences in high and low drip loss groups were identified at 9 h and 24 h postmortem

轉酮醇酶（Transketolase，TKT）在磷酸戊糖途徑的非氧化階段起著關鍵作用。與戊糖磷酸途徑中其他酶一樣，它位于細胞質中[28]，是碳水化合物在戊糖磷酸途徑轉化中非氧化階段的關鍵限速酶，其表達量越高，糖酵解反應速率越快，產生乳酸量越多[29]。本實驗發現在宰后9 、24 h時，H組的轉酮醇酶表達量分別是L組的2.5倍和1.6倍。推測H組汁液流失率高的原因，可能是H組中轉酮醇酶表達量高，糖酵解反應劇烈，乳酸產生速率加快，含量增多，導致pH下降快，汁液流失率高。因此，轉酮醇酶有可能作為宰后預測宰后肉類持水性的蛋白質。前人的相關報道中未發現轉酮醇酶與汁液流失有關。

續表 3

圖2 差異蛋白的GO功能分類圖Fig.2 Identification of the differential proteins by GO functional classification

2.2.3 氧化應激相關蛋白 豬肉汁液流失率的高低受到遺傳、宰后蛋白質變化和氧化應激反應的劇烈程度等多種因素的影響[30]。從肌細胞中熱休克蛋白70（Hsp70）的表達量可以看出宰前應激反應的劇烈程度[31]。宰前機體內應激反應越劇烈，宰后肌細胞內的Hsp70的表達量越低，樣品的汁液流失率越高[32]。本試驗發現24 h時，L組中Hsp70表達量是H組的4.70倍，與前人研究發現Hsp70表達量越高，汁液流失率越低，持水性越強[33]，這一結論相符合。Traore等[34]學者證明氧化反應會使肌細胞結構和完整性遭到破壞。Liu等[35]通過電子顯微鏡觀察到，被氧化試劑處理過的豬最長肌樣本的細胞間隙大于對照組（未使用氧化劑處理的組），且汁液流失率高于對照組。Jeong等[36]學者證明硒蛋白W（Selenoprotein W；SELENOW），具有抗氧化活性。Li等[37]的研究發現，宰后肌肉中硒蛋白W的表達量越多，肌肉的抗氧化能力越強，汁液流失率越低，持水性越強。本實驗發現宰后9和24 h，L組比H組細胞間隙小（表1），且L組的硒蛋白W表達量是H組的3.5倍和2.74倍。肉樣出現高汁液流率的原因可能為肌細胞中硒蛋白W表達量低，抗氧化能力弱氧，使肌細胞結構被破壞，細胞間間隙增大造成的。

圖3 差異蛋白的KEGG通路的富集圖Fig.3 Identification of the differential proteins by KEGG pathway enrichment analysis

圖4 宰后差異蛋白的互作網絡圖Fig.4 Identification of the differential proteins by interaction network diagram

2.3 生物信息學分析

對鑒定到的差異蛋白，進行GO分類及KEGG富集，旨在尋找差異蛋白功能、涉及到的代謝途徑。使用InterProScan5.14-53.0軟件對差異蛋白進行聚類分析（見圖2），發現H組和L組中的差異蛋白主要存在于細胞內（intracellar，GO:0005622）、細胞器（intracellar organelle，GO:0043229）、和 膜 系 統（membrane-bounded organelle，GO:0012505）等。這些蛋白參與的生物過程（見圖2）有：有機環化合物結合（organic cyclic compound binding，GO:0071704）和生物調節過程（regulation of biological process，GO:0009056）等。這些差異蛋白的分子功能（見圖2）有：蛋白綁定（protein bounding, GO:0005515）等。京都基因和基因組百科全書的通路富集分析計數顯示57個差異蛋白質所在的145通路（見圖3），這些通路包含糖酵解途徑（ssc00010）和戊醣酸途徑（ssc00030）等。如圖4，使用String 10.0對差異蛋白互作網絡進行可視化展示（見圖4）。鑒定到的差異蛋白在互作網絡圖中可以分為三個關鍵的蛋白簇，從左至右依次為氧化應激蛋白簇、糖酵解蛋白簇和細胞結構蛋白簇。前人的研究表明糖酵解蛋白簇是影響汁液流失的關鍵蛋白簇[38]。因糖酵解蛋白簇中的轉酮醇酶（Transketolase, TKT）可以調節乳酸產生量，所以推測轉酮醇酶與宰后肉的持水性有關。

3 結論

本次TMT蛋白質組學實驗分析和證實了一些蛋白質與汁液流失有關，葡萄糖磷酸變位酶-1、硒蛋白W、Hsp70和磷酸甘油變位酶在H組和L組中存有顯著差異（P＜0.05）。結合透射電鏡和差異蛋白推測，laminin表達量越大，細胞間間隙可能小，肌肉持水性越好。本實驗推測轉酮醇酶與肉類持水性有關，轉酮醇酶表達量高會加速磷酸戊糖途徑中乳酸的形成，導致肉樣持水性降低，所以轉酮醇酶有可能作為宰后預測肉汁液流失的蛋白。對宰后初期蛋白質變化與持水性的關系還需進一步研究，以便更好地了解因蛋白質變化導致的持水性變化。