代謝工程改造微生物合成單萜芳香產品的研究進展

朱 坤，孔 婧，榮蘭新，劉士琦，肖冬光，于愛群

（天津科技大學生物工程學院，省部共建食品營養與安全國家重點實驗室，工業發酵微生物教育部重點實驗室，天津市工業微生物重點實驗室，天津 300457）

從代謝工程概念的首次提出到現在的30年左右的時間里，在分子生物學、基因組學、生物化學和基因工程等相關學科和技術的推動下，經過幾代人的努力，目前代謝工程已經形成了一套比較完備的理論體系和技術方法。現階段，代謝工程技術的基本路線就是首先利用先進的生物理論和技術對細胞的代謝途徑及調控網絡進行分析并提出合理的設計策略，再結合基因重組技術對相關途徑和網絡進行修飾、改造、擴展或者引入，從而實現改變細胞特性或者提高特定代謝產物產量的目的。

近年來，越來越多的科研人員投身于利用代謝工程技術構建微生物細胞工廠的研究工作。所謂的微生物細胞工廠如同一般意義上的工廠一樣[1]，由微生物細胞作為制造產品的生產廠房，代謝通路擔任生產線，培養基提供生產原料和動力來源，而細胞內復雜的反饋和調控機制則是生產管理系統，工廠內各個部門之間密切配合，最終目的是實現目標產品產量的最大化。這其中最熱門的研究就是利用代謝工程技術在不同微生物底盤中成功構建了包括單萜及其衍生物在內的多種植物天然產物的生物合成途徑，如檸檬烯、紫蘇醇、香葉醇、芳樟醇等。

單萜類植物天然產物是一類從植物體內分離出來的次生代謝產物，由兩個異戊二烯骨架結構單位組成[2]，具有豐富的藥理學或生物學活性，廣泛應用于食品、飲料、化妝品和醫藥工業中，其市場需求也日益增長。例如，檸檬烯就是一種典型的天然活性單萜物質，分子式為C10H16，屬于單環單萜。它很早就被國際權威組織認定為“公認安全”（generally regarded as safe，GRAS）化合物，作為前體物可以轉化合成多種高附加值的藥物和香精化學品[3-4]。氫化后的檸檬烯由于凝固點較低而且不溶于水，在低溫條件下作為添加劑能夠有效改善燃料的性能[5]，因此在能源領域也有很大的發展潛力。作為檸檬烯衍生物的紫蘇醇、香葉醇是很好的香精原料，目前已被廣泛應用于配制食品和日用產品；除此之外，這兩種物質都有著非常出色的藥理功效，如紫蘇醇入藥可以抑制癌細胞的遷移，逆轉人體內已形成的腫瘤[6]，而香葉醇作為抗炎劑在治療炎癥方面療效顯著[7]。另一種檸檬烯衍生物芳樟醇幾乎每年都居于香料消費名單的榜首，實驗表明芳樟醇也具有抑制細菌、真菌、病毒等微生物的活性[8-9]，并且還具備緩解壓力、提高睡眠質量等功效[10]。

迄今為止，人們獲取活性植物天然產物的主要方法是植物提取分離法和有機合成法[11]，但植物提取分離法存在植物生長周期長、產物提取難度大和效率低等問題，而化學合成法也存在著嚴重依賴化石燃料、反應效率低以及極易造成環境污染等缺點。近年來，隨著代謝工程等相關技術取得了一系列的突破性發展，利用微生物細胞工廠異源合成植物天然產物有望成為替代植物提取分離法和化學合成法的一種有效策略。從環保和生態的角度來看，微生物合成法具有節約成本、減少環境污染等優勢，因此是建設節約型社會，實現可持續發展的綠色生產方式，發展前景廣闊。本文綜述了近年來在不同的微生物底盤細胞中利用代謝工程技術構建細胞工廠從而生物合成一些單萜類植物天然產物方面的研究進展，并討論了該方法目前所面臨的瓶頸問題及其可能的解決措施，以期為在微生物細胞工廠中實現單萜類化合物的規模化、效益化工業生產提供可能的理論依據。

1 在微生物底盤中所構建的單萜化合物異源合成途徑

大多數微生物細胞本身并不具備合成單萜類植物天然產物的能力，研究人員利用代謝工程技術手段通過引入部分或完整代謝途徑的方法重構了微生物的代謝網絡，在不同微生物底盤中成功構建了單萜類化合物的異源合成途徑（圖1）。為了便于研究，大多數研究者會把單萜類化合物在微生物底盤中的合成過程分成三個模塊：首先，由自然界中兩種代謝路徑合成植物單萜的共同前體物異戊烯基焦磷酸（isopentenyl pyrophosphate，IPP）和二甲基烯丙基焦磷酸（dimethylallyl pyrophosphate，DMAPP）；隨后，在單萜生物合成途徑中關鍵酶——香葉基二磷酸合酶（geranyl diphosphate synthase，GPPS）的催化下，1分子IPP和1分子DMAPP合成直接前體香葉基焦磷酸（geranyl diphosphate，GPP）；最后，GPP在一系列單萜合酶作用下生成各種單萜類化合物[11]。其中，IPP和DMAPP互為同分異構體，合成這兩種物質的天然生物合成途徑有兩種，分別為甲羥戊酸（mevalonate，MVA）途徑和甲基赤蘚醇磷酸（methylerythritol phosphate，MEP）途徑。MVA途徑和MEP途徑在合成場所、合成原料和途徑酶等方面均存在明顯差異：MEP途徑主要存在于原核生物和植物的質體中，它以丙酮酸（pyruvate）和3-磷酸甘油醛（glyceraldehyde-3-phosphate，G3P）為合成原料，關鍵限速途徑酶包括1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶（1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase，DXS）、1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構酶（1-deoxy-Dxylulose-5-phosphate reductoisomerase，DXR）、4-羥基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸合酶（4-hydroxy-3-methylbut-2-enyl diphosphate synthase，HDS）和4-羥基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸還原酶（4-hydroxy-3-methylbut-2-enyl diphosphate reductase，HDR）等[12-13]；MVA途徑則主要存在于真核生物細胞質中，它以乙酰輔酶A（acetyl-CoA）為合成原料，關鍵限速酶為乙酰乙酰輔酶A硫解酶（acetoacetyl-CoA thiolase，AACT）、羥甲基戊二酰乙酰輔酶A合酶（hydroxymethylglutaryl-CoA synthase，HMGS）、羥甲基戊二酰輔酶A還原酶（hydroxymethylglutaryl-CoA reductase，HMGR）、甲羥戊酸激酶（mevalonate kinase，MK）和磷酸甲羥戊酸激酶（phosphomevalonate kinase，PMK）等[14]。盡管這兩種代謝途徑的合成邏輯完全不同，但是合成過程中卻都產生了IPP、DMAPP、GPP這樣的末端產物，并且都是通過中間產物交換和反饋調節作用來對微生物代謝網絡進行調控，甚至在合成某些代謝物時彼此之間還會發生協同作用[15]。這些發現極大地激發了研究人員的探索興趣，一方面驅使研究者去探尋是否在自然界中存在一條甚至多條有著更高生產效率的單萜類產物合成途徑，另一方面啟迪研究者通過合成生物學的手段去構建全新的非天然代謝途徑來合成單萜類產物，為未來徹底解除限制目的產品高產的代謝瓶頸提供了更多的可能。

圖1 微生物單萜及其衍生物的生物合成途徑Fig.1 Overview of the biosynthetic pathway of monoterpenes and their derivatives in microorganisms

2 代謝工程改造微生物合成單萜芳香產品的策略及應用實例

2.1 代謝工程改造思路

近年來，通過利用代謝工程技術對特定微生物的代謝途徑進行改造，研究者們已經成功實現了多種單萜芳香產品的微生物異源合成（表1）。代謝工程中的具體調控方式有很多種，大致可分為轉錄水平、翻譯水平和蛋白質水平上的調控等。經過一代又一代科研工作者的努力，目前代謝工程改造過程中所使用到的技術和方法已經取得了很大的進步和突破。但目前在利用微生物合成單萜芳香產品的研究工作中，主要采用的還是強化目標產物合成途徑中代謝通量的思路來對微生物底盤細胞進行改造，以實現目標產物產量的提高（表1），具體改造思路總結如下：

2.1.1 過表達關鍵酶基因 目前的研究結果基本能夠確定單萜類產物合成的前體物GPP就是MVA途徑的主要限速瓶頸，因此實現前體底物GPP的充足供應是提高單萜芳香產品產量的關鍵，而過表達MVA途徑中的關鍵酶基因則是提高合成途徑代謝通量的重要手段和方法。

羥甲基戊二酰輔酶A還原酶（HMGR）是MVA途徑中的關鍵限速酶之一，其催化HMG-CoA生成甲羥戊酸的生化反應的強弱是決定微生物細胞內GPP產量的重要因素之一。華東理工大學花強團隊[16]首先在解脂耶氏酵母產芳樟醇工程菌株中單基因過表達HMGR的編碼基因HMG1，芳樟醇的產量與初始菌株相比顯著增加，達到了0.52 mg/L。為了進一步促進產物的合成，該團隊研究人員緊接著探討了HMG1基因與MVA途徑中磷酸甲羥戊酸激酶基因ERG8、乙酰乙酰輔酶A硫解酶基因ERG10、甲羥戊酸激酶基因ERG12或甲羥戊酸二磷酸脫羧酶基因ERG19組合表達時對芳樟醇產量的影響，發現與單獨過表達HMG1的菌株相比，各基因組合過表達菌株合成芳樟醇的產量有了進一步的增加，其中共過表達HMG1和ERG12的工程菌株合成芳樟醇的能力最強，產量提升至0.84 mg/L。

表1 微生物單萜及其衍生物的產量和相關的途徑改造策略Table 1 The production of monoterpenes and the related engineering strategies in microorganisms

由IDI1基因編碼的異戊烯基二磷酸異構酶能夠催化IPP異構化為DMAPP，并調整GPP和法尼基焦磷酸（Farnesyl diphosphate，FPP）的通量分布，在GPP合成途徑中也具有重要的意義。華東理工大學花強團隊[16]在解脂耶氏酵母產芳樟醇工程菌株中引入3個拷貝的IDI1基因，芳樟醇產量為0.75 mg/L；當共過表達HMG1和IDI1基因時，芳樟醇產量提高至1.44 mg/L，幾乎是對照菌株的16倍，是單獨過表達HMG1菌株的2.8倍。

天津科技大學于愛群團隊[17]同樣在解脂耶氏酵母產檸檬烯工程菌株中采用相似的策略，分別單基因過表達MVA通路中涉及到的十個酶的編碼基因ACOAAT1、ACOAAT2、HMGS、HMGR、MK、PMK、PMVADO、IPPDI、GGPPS和FPPS，其中單基因過表達HMGR基因的菌株合成D型和L型檸檬烯的產量最高，分別達到0.256和0.316 mg/L，該研究確定了檸檬烯合成過程中的關鍵限速酶為HMGR。

2.1.2 關鍵酶的改造和調控 單萜產量的最大化由單位菌體生產能力和菌體總量決定，通過對關鍵酶蛋白進行直接改造和調控的方式來提高關鍵酶的活性可有效解除MVA途徑中的關鍵酶限速步驟，從而提高單位菌體的生產能力。該方法也有利于避免由基因過表達對細胞所產生的代謝負擔。

微生物中缺乏特異性的GPPS，在法尼基焦磷酸合酶（ERG20）催化IPP和DMAPP生成GPP的反應過程中，它會再次以GPP為底物生成FPP，這也是造成在微生物細胞中合成單萜類化合物的直接前體GPP供給不足的主要原因。華東理工大學花強團隊[16]在解脂耶氏酵母初始菌株中引入ERG20F88W-N119W基因，造成了ERG20的氨基酸殘基發生了突變，從而改變了GPP和FPP通量的分布，大大提高了GPP的積累量。與對照菌株相比，以改造后的工程菌株作為出發平臺，其異源合成芳樟醇的產量大大提升。浙江大學葉麗丹團隊[18]通過對F96W、N127W和K197G這三個突變位點進行組合誘變以進一步改變了ERG20的底物選擇性，結果表明在線粒體和細胞質中表達改造型ERG20F96W-N127W基因的釀酒酵母工程菌株合成芳樟醇的產量最高，達到2.69 mg/L，與表達野生型ERG20基因的菌株相比增加了2倍。

GPPS和檸檬烯合酶（limonene synthesis，LS）的N端都含有一段靶向序列，對這段靶向序列進行的截短修飾有利于提高酶的催化活性[19]。美國勞倫斯伯克利國家實驗室Taek Soon Lee團隊[20]在大腸桿菌中構建出L-檸檬烯的合成途徑后，通過對GPPS和LS這兩種酶進行截短優化，使得L-檸檬烯的產量從2 mg/L提升到了約40 mg/L。其次，使用強啟動子提高MK和PMK的表達水平，并用來自金黃色葡萄球菌的HMGS和HMGR來替換大腸桿菌的內源酶，L-檸檬烯的產量從2 mg/L提升到了70 mg/L。最后，結合使用上述兩種策略，L-檸檬烯的產量從2 mg/L又提升到了335 mg/L。

天津大學元英進團隊[2]在改造釀酒酵母菌株生產香葉醇的過程中依托計算機應用軟件去認識和理解關鍵酶的結構，通過理性設計達到了對酶進化和修飾的目的。首先基于計算機對導肽結構的預測結果，在香葉醇合酶（CrGES）N端4個不同的位置（S14、L28、S43和S52）分別進行截斷，并通過建模分析發現在S43處去除導肽序列的香葉醇合成酶（t3CrGES）的二級結構穩定性比其余3種酶更高，結果表明t3CrGES截短型菌株合成香葉醇的產量最高，達到191.61 mg/L，是未截短型菌株的4.45倍，說明了導肽和蛋白質結構穩定性對酶活性有重大影響。之后在蛋白質相互作用理論的指導下，用短柔性連接體GSG（微蛋白支架）分別從正向和反向兩個角度來連接法尼基焦磷酸合酶ERG20F96W-N127W和t3CrGES以產生融合蛋白質，使得兩種酶表現出更高的催化活性并減少了中間產物的損耗，結果表明組合型為t3CrGES-ERG20F96W-N127W+ERG20F96W-N127W的菌株合成香葉醇的產量最高，達到523.96 mg/L，體現出在合成途徑中縮短多個酶的空間距離，能夠有效地提高酶的催化反應效率。該實驗結果體現出了酶工程作為關鍵方法改造微生物底盤合成單萜類產物的重要性，對進一步提高香葉醇產量很有指導意義。

2.1.3 區室化工程 在酵母亞細胞域細胞質內采用組合共表達MVA途徑中的途徑基因、突變關鍵酶ERG20的基因位點，以及對關鍵酶進行融合表達（如利用蛋白支架連接）等方法目前已經成為了代謝工程改造微生物異源合成單萜芳香產品研究中比較常態化的策略，而把異源途徑轉移到微生物其它亞細胞區室中的報道卻很少看到。浙江大學葉麗丹團隊[18]在釀酒酵母不同亞細胞區室（如線粒體和細胞質）中構建了雙重MVA代謝途徑，在雙向GAL1/GAL10啟動子的作用下，以單順反子形式在線粒體和細胞質中同時表達芳樟醇合酶（linalool synthase，LIS）基因和ERG20F96W-N127W基因，合成芳樟醇的產量達到7.61mg/L，與僅在細胞質中表達MVA途徑相比，芳樟醇的產量得到明顯提升，這種區室化工程策略為今后芳樟醇和其它單萜類化合物的高水平生產提供了較好的思路。

2.2 發酵優化策略

根據微生物在生長繁殖過程中對外界環境的要求，對微生物的發酵條件和營養條件進行優化，能夠有效提高其細胞生長速率和代謝產物合成速率，進而實現利用微生物生產更多特定代謝產物的目標。在經代謝工程改造后能夠異源合成單萜芳香產品的菌株中，原有的代謝途徑及調控機制已被改變，此時的發酵優化就顯得尤為重要。

2.2.1 優化發酵條件 天津科技大學于愛群團隊[17]利用代謝工程技術改造解脂耶氏酵母異源生產檸檬烯后，設計實驗驗證了鎂離子對解脂耶氏酵母工程菌株合成檸檬烯的促進作用，并利用單因素實驗法（溫度、pH、轉速、初始細胞密度、添加劑）對工程菌株進行發酵優化試驗，確定了最佳的工藝條件：發酵溫度20 ℃，轉速250 r/min，初始OD600=2.0，pH 5.74和培養基體積50 mL（250 mL搖瓶中），正十二烷體積10%，培養時間5 d，MgSO4·7H2O濃度0.2%。實驗過程中獲得的D-檸檬烯和L-檸檬烯的最高產量分別達到11.705 和11.088 mg/L。

中科院青島生物能源與過程研究所咸謨和劉會洲團隊[21]從優化發酵培養方式和培養環境入手來提升大腸桿菌工程菌株的生產性能，進而提高香葉醇的產量：a.對大腸桿菌工程菌株進行搖瓶發酵培養（OD600=2），48 h后產量達到68.6 mg/L；另外對該菌株進行分批補料發酵培養，IPTG誘導5 h，產量提高到78.8 mg/L。b. 在沒有葡萄糖的情況下，大腸桿菌細胞會重復利用醋酸鹽，從而促進乙酰基酯酶（Acetylesterase，Aes）催化乙酸香葉酯轉化生成香葉醇。于是，通過對大腸桿菌工程菌株采用葡萄糖饑餓策略（在48 h停止葡萄糖供應，在葡萄糖不足的條件下繼續培養）進行培養，分批補料發酵后成功將濃度為1.27 g/L（88.8%）的乙酸香葉酯轉化為香葉醇，香葉醇的終產量達到2.0 g/L。

2.2.2 優化培養基碳源 華東理工大學花強團隊[16]利用解脂耶氏酵母產芳樟醇工程菌株來探究葡萄糖、甘油、果糖或檸檬酸（各20 g/L）分別作為單一碳源對細胞生長和合成芳樟醇的影響，結果表明檸檬酸鹽組合成芳樟醇的產量最高，產量和細胞干重（dry cell weight，DCW）分別達到2.52 mg/L和356 μg/g。另外還探究了10 g/L檸檬酸鹽與10 g/L葡萄糖、甘油或果糖的混合碳源對細胞生長和合成芳樟醇的影響，觀察到檸檬酸鹽和葡萄糖作為混合碳源的細胞生長情況最好，而芳樟醇的產量與以20 g/L檸檬酸鹽作為唯一碳源組相比幾乎保持不變。最后，工程菌株在以20 g/L檸檬酸鹽和8 g/L丙酮酸鹽為碳源時進行搖瓶培養合成芳樟醇的產量最高，達到了6.96 mg/L（939 μg/g DCW）。

在此基礎上，華東理工大學花強團隊[22]繼續對解脂耶氏酵母工程菌株生產檸檬烯的發酵條件進行了優化，首先探究了8種初始濃度為20 g/L的碳源（甘油、葡萄糖、檸檬酸、果糖、麥芽糖、蔗糖、甘露糖和半乳糖）對解脂耶氏酵母合成檸檬烯的影響，結果表明以甘油為碳源時合成檸檬烯的產量最高，達到1.74 mg/g DCW。再通過在培養基中添加不同初始濃度（10、20、30、40、50 g/L）的甘油來探究碳源濃度對解脂耶氏酵母生產檸檬烯的影響，結果表明，初始濃度為20 g/L的甘油組合成檸檬烯的產量最高，達到1.47 mg/g DCW；并觀察到隨著甘油初始濃度的升高，檸檬烯產量達到峰值的時間點會出現向后推遲的現象。此外，該團隊還探究了不同初始濃度（0～4 g/L）的檸檬酸鹽、乙酸鹽、丙酮酸鹽和蘋果酸鹽作為輔助碳源對解脂耶氏酵母生產檸檬烯的影響情況，結果表明初始濃度為4 g/L的檸檬酸鹽組作為輔助碳源時合成檸檬烯的產量最高，達到58.4 mg/L，比對照組高1.39倍。最后該團隊以甘油作為主要碳源，并補充輔助碳源檸檬酸，在1.5 L發酵罐中進行分批補料發酵培養，檸檬烯的終產量達到了165.3 mg/L，這也是目前為止解脂耶氏酵母異源合成檸檬烯的最高產量。

浙江大學葉麗丹團隊[18]同樣采用分批發酵培養方式，將釀酒酵母產芳樟醇工程菌株在尿嘧啶缺陷型培養基中進行培養，并對輔助碳源進行了優化。結果表明補充輔助碳源對提高細胞生產芳樟醇的性能有很大：添加丙酮酸（4 g/L）組芳樟醇的最高產量達到21.01 mg/L，添加甲羥戊酸內酯（70 mg/L）組芳樟醇的最高產量達到23.45 mg/L。

眾所周知，不同菌體對原料的利用能力不同，各種原料的利用效率之間也相差很大，并且原材料組分的差異導致各種類型培養基的價格相去甚遠，因此在滿足微生物生長生產要求的前提下，應該優先選擇價格低、效果好的培養基。天津科技大學于愛群團隊[17]探究了不同添加量（0、10%、30%、50%和70%）的廚房廢油替代葡萄糖為唯一碳源對解脂耶氏酵母工程菌株生產檸檬烯的影響，結果表明：工程菌株在添加濃度為70%的廚房廢油的培養基中發酵效果最好，D型和L型檸檬烯的產量分別達到2.514 和2.723 mg/L，比初始產量提高了20倍，這一研究成果也為今后利用微生物轉化廉價碳源合成高附加值產品的研究帶來了希望。

2.3 產物分離方法

隨著微生物細胞中生化反應的進行，微生物生長環境中代謝產物的濃度會不斷升高，從而對細胞產生毒害或者代謝負擔[24-25]，最終導致單萜產品的產量和細胞生物量之間呈現反比例關系。在微生物發酵工程中，對目標產物進行有效、及時地分離可有助于解決該問題。

中國科學院青島生物能源與過程研究所咸謨和劉會洲團隊[21]對大腸桿菌產香葉醇工程菌株進行分批補料發酵培養時發現，向生產系統中加入香葉醇標準品，在發酵過程的前5個小時內，生產系統因揮發作用損失了81.4%的香葉醇。該團隊還發現向生產系統中添加十四酸異丙酯形成的水、有機兩相系統可有效防止目標產物的揮發，也同時降低了目標產物對細胞的毒性，產物產量大大提升。

荷蘭瓦赫寧根大學植物生理學實驗室的Harro Bouwmeester團隊和荷蘭瓦赫寧根國際植物研究中心的Jules Beekwilder團隊[23]利用酵母菌ERG20基因突變株AE9K197G探索在培養系統中（1.7 g/L酵母氮基（不含氨基酸）、5 g/L（NH4）2SO4、20 g/L D-葡萄糖、20 g/L瓊脂）捕獲目標產物檸檬烯的有效手段，比較了包括戊烷萃取、固相微萃取、十二烷覆蓋萃取、特殊吸收器吸收在內的四種不同的捕獲方法，證明了在微生物發酵系統中同步采取捕獲產品的措施可有效地將檸檬烯提取出來，并且獲得的產品與基于植物的提取系統相比更加穩定、也達到了食品級的要求。該研究成果也展現了利用微生物合成法生產揮發性單萜芳香產品的優勢。

美國勞倫斯伯克利國家實驗室Taek Soon Lee團隊[20]以大腸桿菌產紫蘇醇工程菌株為研究對象，探究了基于陰離子交換樹脂的原位產品回收方法對目標產物紫蘇醇生產的影響，發現了樹脂Amberlite IRA 410 Cl（A）能夠特異性捕獲紫蘇醇，也最大限度地提高了工程菌株的生產能力，使得紫蘇醇的終產量達到105 mg/L。但該樹脂的添加也會引起細胞毒性或機械應力從而降低細胞密度。

3 結論與展望

綜上所述，本文從代謝工程改造思路、發酵優化策略及產物分離方法等角度出發綜述了利用代謝工程技術改造不同微生物宿主合成天然單萜芳香產品的研究進展。從目前報道的結果來看，利用代謝工程改造策略來優化或改變微生物宿主已有的代謝和表達調控網絡，有助于大大提高目標產物產量。總之，通過代謝工程手段所構建的能夠合成單萜芳香產品的微生物細胞工廠為這一重要植物天然產物的綠色生產提供了一條新路線。

但是，目前利用代謝工程技術改造微生物直接發酵生產各類單萜芳香產品的研究還面臨諸多挑戰，主要包括：a. 所用微生物底盤的不同對目的產物的終產量是有明顯影響的，而目前的研究還主要局限于大腸桿菌、釀酒酵母和解脂耶氏酵母中（表1）；b. 相關產物在這幾種微生物底盤中的產量基本都是毫克級（表1），還很難滿足產業化生產的實際要求。因此，在這一背景下，為了構建更高效合成單萜芳香產品的微生物細胞工廠并最終實現其綠色制造，亟需深入探究影響不同微生物底盤高效生產特定目標產物的關鍵機制及核心問題。要進一步明確不同微生物底盤中合成單萜芳香產品的關鍵控制節點和與之相對應的控制策略，應從以下幾個層面入手：

3.1 培養基方面

眾所周知，培養基是由人工配制的營養基質，是微生物各種生命活動的物質基礎。不同微生物底盤對各種培養基原料的利用能力和效率之間相差很大，因此培養基成分是決定微生物底盤合成目標產物（尤其是異源產物）能力高低的重要因素之一。例如，之前的研究已經證實了在YPD培養基中添加適量鎂離子能夠提高解脂耶氏酵母D-檸檬烯合酶（dlimonene synthase，DLS）和L-檸檬烯合酶（l-limonene synthase，LLS）的催化活性同時提高檸檬烯的產量[17]；在YPD培養基中補充適量丙酮酸有利于增加釀酒酵母的菌體濃度同時提高芳樟醇的產量[18]。因此，為了獲得更高的目標產品產量，從培養基方面可以從進一步優化發酵培養基成分和篩選產品合成途徑中相關限速酶激活劑兩方面著手。

3.2 底盤細胞方面

底盤細胞是各種生化反應發生的直接場所，因此它的重要地位不言而喻。近些年，依托基因測序技術和生物信息學的高速發展，對各種微生物底盤細胞自身特征的認識已經取得了很大突破。例如，研究者對作為原核模式微生物代表的大腸桿菌的生理和代謝特征了解最為充分，應用最為廣泛，其生產的許多轉基因產品也已經取得了商業化。雖然在包涵體形成以及蛋白翻譯后修飾等方面存在缺陷，但憑借遺傳背景清晰、易培養、遺傳操作性強、異源蛋白產量高等特點，大腸桿菌往往成為代謝工程中底盤細胞的首選[26-27]。對于單萜芳香產品來說，相比釀酒酵母和解脂耶氏酵母，目前大腸桿菌底盤中相關產物（檸檬烯和香葉醇）的產量也是更高的，顯示出很好的應用前景。

與大腸桿菌相比，真核模式微生物釀酒酵母具有遺傳穩定性更高（如能夠在基因組中同時插入多個外源基因片段）、表達真核來源功能蛋白（如植物源細胞色素P450酶和單萜合酶）的能力更強[28]等特點。此外，釀酒酵母本身就具有催化產生單萜芳香產品合成所需前體物GPP的MVA途徑。因此，釀酒酵母成為了異源合成單萜芳香產品的理想微生物底盤。

解脂耶氏酵母是一種新型的非模式微生物底盤細胞。相比于釀酒酵母，它具有更適合高密度發酵、碳源譜范圍更廣泛以及對惡劣生長環境的適應度更高等特點，使得該酵母在工業領域具有很大的應用前景[29-30]。另外，解脂耶氏酵母已經具有了MVA途徑，且作為產油酵母其胞內乙酰輔酶A的積累量較高；因此在生產單萜芳香產品方面具有明顯優勢，應用前景同樣廣闊。然而由于對解脂耶氏酵母的研究及應用起步較晚，因此目前尚未完全掌握該底盤細胞內的基因表達調控等分子機制，遺傳操作系統也迄待完善。

總之，目前利用代謝工程技術生產各類單萜芳香產品的研究還主要集中在大腸桿菌、釀酒酵母和解脂耶氏酵母這幾種微生物底盤中。值得關注的是，依托基因測序技術和生物信息學的高速發展，近年來對許多非模式微生物底盤細胞（如藍細菌[31-32]等）特征的認識已經取得了很大的突破，再加上CRISPR/Cas9等基因編輯技術的不斷完善，有利于研究者為單萜芳香產品的微生物合成發掘新的、更有工業應用前景的非模式微生物底盤細胞，并找到不同產物與微生物底盤之間的最大兼容性。另外，利用合成生物學技術構建微生物基因組精簡優化的底盤細胞[33]也有望成為提高單萜芳香產品產量的重要策略。

3.3 代謝工程策略方面

從之前的研究結果來看，利用適宜的代謝工程策略來增大代謝網絡中通向目標產物合成途徑的代謝流有利于提高單萜芳香產品的產量。但是，目前仍然存在很多挑戰，比如：a. MVA途徑自身的代謝通量過低；b. MVA途徑中存在有多個分支代謝途徑；c.中間體和產物的積累會造成嚴重的代謝負擔以及毒害作用；d.對某些微生物底盤生理和代謝機制的認知還不夠充分；e.無法真正意義上對微生物底盤的代謝網絡進行動態調控和實現目標代謝通量的最大化。因此，很多研究者認為可以把單萜芳香產品代謝工程的優化工作分成上、中、下游三個模塊來分別進行[34]：a.增加起始物質——乙酰輔酶A、丙酮酸和3-磷酸甘油的供應量[35-37]；b.強化直接前體物GPP合成途徑的代謝流[38-39]；c.敲除或弱化直接前體物GPP的競爭性途徑[18]。

目前的研究結果表明，GPP的供應不足可能是造成單萜芳香產品合成量不高的主要限速瓶頸，因此實現GPP的充足供應是提高目標產品產量的重中之重。另外，單萜芳香產品合成后存在的內源性轉化現象也是導致產物產量無法大幅度提升的重要因素[23]。另外，研究者需要利用更理性全面的策略（如系統生物學）和更先進的技術和方法（如合成生物學）來深入探究影響不同微生物底盤高效生產特定目標產物的限速步驟、關鍵機制及核心問題。只有明確了關鍵限制因素，才能找準目標、有的放矢，最終實現目標產物產量、產率的大幅度提高。

3.4 代謝產物耐受性方面

隨著產物的不斷積累，微生物生長環境中單萜芳香產品的濃度不斷升高，就產生了對微生物底盤細胞的毒害作用。單萜芳香產品對微生物細胞造成毒害的機制非常復雜，目前已知的主要原因是單萜物質引起了微生物細胞壁、細胞膜和細胞器膜等結構的破壞[40-41]；降低了細胞內某些酶的活性；并阻礙了細胞生理活動的正常進行，最終導致微生物死亡。以下策略可以提高微生物底盤對代謝產物的耐受性問題：a.利用誘變育種或適應性進化等技術篩選出耐受性更強的菌株作為出發的底盤細胞；b.首先利用轉錄組學或蛋白質組學等方法探索微生物耐受單萜物質的機制，然后采用分子育種手段（比如引入特異性轉運蛋白）來提高微生物底盤細胞對單萜產物的耐受性；c.采用萃取、樹脂吸收或膜過濾等分離技術及時地把單萜產物從培養環境中分離出來，實現“邊產生邊分離”，阻止毒害現象的發生。

最后，利用構建多種微生物底盤細胞組成的混合發酵系統[42-43]以及無細胞表達系統[44]等策略來突破現有的一些限制性因素，從而提高代謝工程設計和改造的效率，也有助于提高利用微生物細胞工廠合成單萜芳香產品的生產水平。