復合發酵劑對發酵牛肉干理化品質及安全性能的影響

梁蕊芳，張邦建，高麗霞，梁國良，李 瑛，王德寶，徐 龍

（內蒙古包頭職業技術學院，內蒙古包頭 014035）

牛肉是世界上僅次于豬肉、家禽的第三大肉類消費產品，其含有豐富的蛋白質、氨基酸，可提高機體抵抗防御能力，中醫認為牛肉具有補中益氣、滋養脾胃、強健筋骨等保健功效。牛肉產量較高，但深加工產品種類較少，結合高新技術加工而成的牛肉產品更少。隨著微生物益生菌研究與應用逐漸深入，微生物發酵技術與肉制品融合的新產品逐漸被消費者所認同。肉制品加工過程中，接種發酵劑會使肉中蛋白質與脂質發生氧化降解生成小分子營養素和特征風味物質[1]；發酵劑在加工過程中快速繁殖促進產品酸化，降低肉制品pH和水分活度（Aw），可抑制致病菌及腐敗菌生長繁殖，提高產品安全性和延長貨架期[2]。由于肉制品發酵期間溫度處于20～30 ℃，易促進原料肉中從空氣或加工器具上混入的腸桿菌、腸球菌及其他有害雜菌的生長繁殖，Xie等[3]研究表明腸桿菌等雜菌與發酵香腸中生物胺的形成具有一定相關關系。近年來，由前體氨基酸經微生物的氨基酸脫羧酶脫羧后形成具有芳香族（腐胺、尸胺、精胺、亞精胺）、脂肪族（β-苯乙胺、酪胺）及雜環結構（色胺、組胺等）的生物胺[4-5]引起的食品安全問題成為了一大研究熱點。少量生物胺存在對機體具有重要生理功能，可以促進生長、清除自由基及增強代謝和提高免疫力[6-7]；攝入過量生物胺則會引起血管擴張、頭疼、呼吸紊亂、心悸、腹瀉等不良反應，甚至會造成機體中毒[8]。李思寧等[9]在自然發酵及人工接種發酵劑的牦牛肉香腸中均檢測到酪胺、亞精胺等生物胺。孫欽秀等[10]研究表明，復合香辛料提取物可以有效抑制脂質氧化、生物胺的積累。Baka等[11]通過接種清酒乳桿菌制作發酵香腸，表明其可顯著降低香腸中生物胺的含量。Zhang等[12]研究發現接種ZY-40植物乳桿菌可有效控制發酵鰱魚香腸中生物胺水平。王德寶等[13]研究不同復合發酵劑對發酵香腸中生物胺形成的影響，結果表明植物乳桿菌與肉葡萄球菌復合發酵劑相對單一發酵劑可降低香腸中生物胺整體含量水平。Van等[14]研究發現，肉葡萄球菌和清酒乳桿菌復合發酵劑可降低發酵香腸中的腐胺與酪胺含量。近年來對于發酵牛肉干的研究，僅局限于牛肉干的工藝和基礎理化品質變化方面[15-16]。目前，發酵牛肉干研究熱度逐漸擴大，成為消費者追求的一種發酵肉制品，而有關牛肉干中生物胺形成及含量變化對其食品安全性影響的報道甚少。

本文選擇清酒乳桿菌、戊糖片球菌、木糖葡萄球菌為發酵劑，制作發酵牛肉干，探究復合發酵劑對發酵牛肉干理化品質及安全性能的影響，以期為實際生產應用提供理論依據及數據支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

原料肉：精選牛后腿肉 源自包頭市博克食品有限責任公司巴西進口牛肉；腸衣 30～32 mm膠原蛋白腸衣；發酵劑：清酒乳桿菌（Lactobacillus sakei，XR-1） 自行分離鑒定；戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus，BNCC 192624）和木糖葡萄球菌（Staphylococcus xylosus，BNCC 337469） 標準菌株，北京北納創聯生物技術研究院；木瓜蛋白酶 10萬酶活力單位，美國Sigma-Aldrich公司；單磺酰氯 色譜級，衍生試劑，美國 Sigma-Aldrich公司；組胺、β-苯乙胺、酪胺、尸胺 色譜級，標準品，美國 Sigma-Aldrich公司；1,7-二氨基庚烷 色譜級，美國 Sigma-Aldrich公司；甲醇、正己烷、丙酮 色譜級，上海安譜實驗科技股份有限公司。

1260型高效液相色譜儀 美國安捷倫公司；TG16-WS型臺式高速離心機 湖南離心機儀器有限公司；LRH-250-HS型恒溫恒濕培養箱 沈陽亮衡天平儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 發酵牛肉干的制作

1.2.1.1 實驗配方 牛肉100 g，食鹽2.5%，白糖0.56%，生抽2%，黃酒1.5%，味精0.2%，姜粉0.1%，黑胡椒0.15%，鮮洋蔥片5%，安息香酸鈉0.05%，木瓜蛋白酶0.04%，發酵劑（清酒乳桿菌:戊糖片球菌:木糖葡萄球菌為1:2:2）107CFU/g。

1.2.1.2 制作工藝 原料肉修整：選取牛后腿肉，剔除筋膜和脂肪，切成寬 × 厚 × 長為2 cm× 2 cm× 18 cm肉條。

嫩化：將切好的肉條與木瓜蛋白酶按照比例攪拌均勻后，置于50 ℃恒溫恒濕（90%）中嫩化2 h。腌制：嫩化結束后，將肉條與輔料、發酵劑等攪拌混勻置于4 ℃條件下腌制24 h。灌裝：將腌制好的肉條在紫外殺菌后無菌環境中灌入直徑為20～25 mm膠原蛋白腸衣中，排氣后兩端扎好。發酵：掛入恒溫恒濕培養箱中，在30 ℃、90%～95%濕度條件下發酵2 d。成熟：成熟第一階段：牛肉干在溫度14～15 ℃、濕度為75%～85%條件下成熟3 d；成熟第二階段：在12～13 ℃、濕度為60%～75%條件下再成熟4 d。成熟結束后去除腸衣，將發酵好的牛肉干切成5 cm長度后進行無菌包裝。

1.2.2 實驗分組 通過添加清酒乳桿菌、戊糖片球菌及木糖片球菌，將本試驗分為發酵劑組（簡稱為LSS）及對照組（不添加外源發酵劑，簡稱為CO）。經腌制、發酵、成熟加工而成發酵牛肉干，將腌制結束（0 d）、發酵結束（2 d）、成熟第一階段（5 d）、成熟第二階段（9 d）的四個階段牛肉干進行取樣，然后保存于-80 ℃，測定肉干理化品質及生物胺組成。

1.2.3 菌相的測定 菌落總數、乳酸菌數、腸桿菌及葡萄球菌參照GB 4789.2-2016 《食品安全國家標準食品微生物檢驗 菌落總數測定》、GB 4789.35-2016《食品安全國家標準 食品微生物檢驗 乳酸菌檢驗》、GB 4789.41-2016 《食品安全國家標準 食品微生物檢驗 腸桿菌科檢驗》等方法進行測定[17-19]，肉干中木糖葡萄球菌利用MSA 培養基 30 ℃ 48 h后進行計數。

1.2.4 理化指標的測定 參照GB 5009.237-2016《食品pH值的測定》[20]、使用HD-3A型智能水分活度儀、CR-410型色差計測定香腸pH、Aw、紅度值（a*）。

1.2.5 生物胺含量的測定 參照 GB 5009.208-2016測定發酵牛肉干中生物胺含量[21]。

色譜條件：C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流速 0.8 mL/min，紫外檢測波長 254 nm，進樣量10 μL，柱溫35 ℃，流動相 A為90%乙腈+10%含0.1%乙酸的0.01 mol/L乙酸銨溶液，B 為90%含0.1%乙酸的0.01 mol/L乙酸銨溶液 + 10%乙腈，梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution procedure

1.2.6 感官評價 通過對牛肉干進行感官評價，確定發酵劑接種對最終產品質量的影響。外觀、顏色、味道、質地和整體質量屬性用9分制（1分=非常差，9分=非常好）進行評估。感官小組由9名訓練有素、來自于包頭輕工職業技術學院食品專業的小組成員組成。實驗是在通風良好的房間里在20～22 ℃下進行。將樣品切成4 mm厚，裝入直徑5 mm有蓋的塑料容器中，樣品隨機編號。為小組成員提供了水和面包，以清洗和清潔評價成員口腔。感官數據使用非參數Mann Whitney檢驗進行分析。

1.3 數據處理

采用Excel和SPSS 19.0對生物胺數據進行統計和顯著性處理，利用Sigmaplot 12.5制作柱形圖。

2 結果與分析

2.1 發酵劑對發酵牛肉干菌相組成的影響

發酵劑對發酵牛肉干中菌相組成的影響如表2。腌制結束，牛肉干中總菌數量處于8.22～8.53 CFU/g；隨著牛肉干進入發酵成熟過程，總菌數數量快速增加，發酵結束時CO與LSS兩組總菌數數量分別達到8.99、9.38 CFU/g；5 d末LSS組增加到9.85 CFU/g，高于CO組的9.36 CFU/g；進入5～9 d的成熟第二階段，CO、LSS組分別下降了0.29、0.72個單位。總菌數的快速增長期為0～5 d的發酵和成熟初期，2～5 d總菌數增長幅度小于0～2 d的發酵期。其中牛肉干中乳酸菌數量與總菌數變化相一致，腌制結束時LSS組乳酸菌數量（8.18 CFU/g）高于CO組（6.36 CFU/g），這可能是發酵劑組添加乳酸菌發酵劑對這一差異起到主要作用。在成熟第一階段結束（5 d）時，乳酸菌數量達到最高，顯著高于其他階段（P＜0.05）。且乳酸菌數量高于葡萄球菌數量較高，說明接種的乳酸菌對肉環境具有較強的適應能力，乳酸菌也有助于改善發酵香腸的理化品質，如質地、風味、感官等特性[22]。牛肉干中葡萄球菌數量同樣呈現先上升后下降的變化趨勢，在5 d末時數量達到最高。造成這一結果的原因可能是由于進入成熟過程中環境溫度、濕度急劇下降及香腸內部水分的散失，致使5～9 d成熟過程中乳酸菌和葡萄球菌數量逐漸降低[2,22]。在整個加工過程中，CO組大腸桿菌數量變化微小，LSS組腸桿菌數量由0 d的5.84CFU/g下降到2.04 CFU/g，說明肉干中腸桿菌受到了接種的發酵劑的強烈抑制作用。降低香腸中腸桿菌數量可以減少更多有害物質如生物胺[3]的生成。

表2 發酵劑對發酵牛肉干發酵成熟過程菌相變化的影響Table 2 Effect of starter cultures on microbial phase composition of fermented beef jerky in fermentation and ripening process

2.2 發酵劑對發酵牛肉干pH的影響

發酵劑對發酵牛肉干pH變化的影響如圖1。由圖1可知，牛肉起始pH較高，近為6.20。在0～2 d，隨著發酵期間乳酸菌和葡萄球菌等菌種數量的大幅增加，促使CO和LSS組pH大幅下降，Lorenzo、Wang、Nie等[23-25]研究結果表明發酵期間乳酸菌等發酵劑數量快速增加促使肉中碳水化合物分解為乳酸等小分子有機酸，且發酵劑組因清酒乳桿菌等發酵劑的添加，促進LSS組pH（4.43）顯著低于CO組（5.03）（P＜0.05）。在2～5 d成熟初期，因菌種仍有小幅上升，引起發酵牛肉干pH保持持續下降的趨勢。5～9 d成熟過程，菌株活性受到低溫、低pH、低濕度的強烈抑制，菌種數量大幅下降，此時酸度下降的速率可能小于蛋白質分解產生氨、三甲胺等堿性物質速率[26]，致使牛肉干pH在此階段呈現小幅回升的現象。低pH有利于改善香腸色澤、口感、改變蛋白質與水分結合能力和抑制肉干中腸桿菌等一類有害及致病菌生長繁殖。成熟結束后牛肉干pH低于發酵肉制品安全酸度要求5.3[27]。

圖1 發酵劑對發酵牛肉干發酵成熟過程pH變化的影響Fig.1 Effect of starter cultures on pH value of fermented beef jerky in fermentation and ripening process

2.3 發酵劑對發酵牛肉干Aw值的影響

水分活度值（Aw）高低是衡量香腸保質期的一個重要柵欄技術因子。Aw低于0.9時，食品中腐敗菌生長受到抑制；低于0.85時，酶活性大幅下降；低于0.6時，霉菌及耐鹽菌活性降到最低[28-29]。

腌制結束，兩組水分活度值（Aw）均為0.91；發酵過程中，CO組Aw值沒有變化，LSS組僅下降0.1個單位。2～5 d成熟第一階段，發酵牛肉干Aw值下降幅度增大，5 d末CO、LSS兩組分別降為0.81、0.84。而在5～9 d成熟第二階段，CO、LSS兩組Aw值下降幅度分別為13.67%、15.53%，LSS組下降幅度高于CO，但差異不顯著（P＞0.05）。成熟結束，兩組Aw值差異不明顯，說明發酵劑對牛肉干Aw值變化影響較小。牛肉干水分活度及pH均顯著下降，低Aw值、pH有利于抑制肉干中可產生致癌物亞硝胺的腸桿菌等有害菌及致病菌生長繁殖，從而可提高產品品質和安全性，延長產品貨架期[30]。

圖2 發酵劑對發酵牛肉干發酵成熟過程水分活度變化的影響Fig.2 Effect of starter cultures on water activity of fermented beef jerky in fermentation and ripening process

2.4 發酵劑對發酵牛肉干紅度值的影響

發酵劑對發酵牛肉色澤的影響如圖3。發酵牛肉干的紅度值呈現先上升后下降的變化趨勢。在0～2 d發酵過程中，兩組紅度值均上升，發酵結束后CO與LSS組紅度值（a*）分別為20.41、22.34。此時紅度值的增加可能與發酵劑快速產酸、促使亞硝酸鹽在酸性條件下與肌紅蛋白結合形成呈現玫瑰紅的亞硝肌紅蛋白有關[31-33]。成熟過程中，牛肉干紅度值大幅下降，與肉干在成熟過程中水分大量蒸發、肉色進而變為暗紅色有關，也可能與微球菌數量降低，致使產生可破壞由乳酸菌類形成的過氧化氫（H2O2）的過氧化氫酶數量和活性的下降，未能阻斷H2O2對血紅素色素的氧化所致[11]。成熟結束，CO、LSS兩組紅度值相差1.90個單位，差異較小。說明，發酵劑對肉干的色澤在發酵和成熟第一階段影響較大。

圖3 發酵劑對發酵牛肉干發酵成熟過程紅度變化的影響Fig.3 Effect of starter cultures on red color of fermented beef jerky in fermentation and ripening process

2.5 發酵劑對發酵牛肉干生物胺組成的影響

發酵劑對發酵牛肉干中生物胺的影響如圖4，共檢出苯乙胺、色胺、腐胺、尸胺、組胺及酪胺六種生物胺。其中苯乙胺是一種芳香胺，會被單胺酶氧化分解，可有效防止其在人體腦部集中。由圖4A可知，發酵肉干中苯乙胺含量呈現先上升后下降的變化趨勢，CO組在5 d末含量顯著高于其他階段（P＜0.05），LSS組整個過程中含量變化微小，且均未超過1 mg/kg。色胺是色氨酸經氨基酸脫羧酶脫羧后形成，其具有血管收縮的作用，整個過程含量變化均未超過2 mg/kg；對于色胺的變化，2～9 d LSS組含量均高于CO組，說明添加清酒乳桿菌、戊糖片球菌及木糖葡萄球菌有利于色胺的小幅積累。尸胺和腐胺被用作衡量紅肉和食品衛生的重要指標[34]，最終含量均低于美國食藥局毒性最高限量指導標準（100 mg/kg）[35]。由圖4C～D可知，腌制結束0 d肉中腐胺、尸胺含量較低，說明原料肉比較新鮮；隨著進入發酵和成熟過程，CO組中腐胺和尸胺含量急劇增加，各階段含量差異顯著（P＜0.05），特別是腐胺含量在成熟結束時增長到95.92 mg/kg，顯著高于同期的LSS組腐胺含量19.05 mg/kg（P＜0.05）；LSS組中尸胺和腐胺含量變化為先上升后下降，在發酵結束時含量達到最高，均低于40.00 mg/kg。據Baka等[11]報道稱，尸胺和腐胺的形成與腸桿菌科和假單胞菌的脫羧酶活性有關，Suzzi等[36]研究報道稱腸桿菌科是腐胺和尸胺的形成和積累的主要微生物，具有較高脫羧酶活性。綜合表明，接種的清酒乳桿菌、戊糖片球菌及木糖葡萄球菌復合發酵劑可強烈抑制腸桿菌等產胺菌活性，進而可大幅控制肉干中尸胺和腐胺含量變化，對提高肉干衛生質量具有重要的貢獻作用。從毒性角度看，組胺是毒性最高的生物胺，尸胺、腐胺、酪胺等胺類的存在對其毒性具有輔助作用，可增強其毒性[24,37]。0～9 d，兩組肉干中酪胺含量變化微小，且成熟結束時LSS組含量低于CO組。而肉干中組胺含量大幅上升，發酵結束時CO、LSS組分別為60.62、50.50 mg/kg；后期成熟過程中，兩組組胺含量大幅下降，說明產組胺菌受溫度變化影響較大，成熟結束LSS組含量（22.56 mg/kg）低于CO組（47.00 mg/kg）。說明添加上述復合發酵劑對產組胺菌產生較強抑制作用，結合溫度的變化，接種上述發酵劑制作發酵肉干可顯著提高其安全性能。

圖4 發酵劑對發酵牛肉干中生物胺組成的影響Fig.4 Effects of starter cultures on biogenic amine composition in fermented beef jerky

2.6 發酵牛肉干感官評定

通過對成熟后發酵牛肉干感官評價，衡量消費者對發酵牛肉干的可接受度，評價結果如表3所示。可能由于添加發酵劑促使肉干pH的快速下降，改變了肌肉蛋白與水分的結合能力，促進肉干內部水分不斷向外部擴散，使得發酵組肉干內外干燥程度一致，使發酵劑組外觀優于對照組。隨著pH的下降，肉干中硝酸鹽與肌紅蛋白逐漸結合形成呈現鮮紅色的亞硝肌紅蛋白，使得LSS組紅度色澤明顯高于CO組。發酵成熟過程中，牛肉干肌肉和脂質可能被添加的微生物發酵劑分解為小分子物質—游離氨基酸和脂肪酸，這部分氨基酸和脂肪酸在發酵劑和酶的作用下，可生成特殊風味物質，使得肉干在成熟過程中風味物質不斷積累。這可能是造成發酵劑組與對照組風味差異的原因。隨著肌肉蛋白質的分解，大分子蛋白被分解成多肽，從而改善了肉干的質構。綜合以上指標的變化，使得發酵劑組牛肉干的整體可接受度高于對照組。

表3 感官評價Table 3 Sensory evaluation

3 結論

接種清酒乳桿菌、戊糖片球菌及木糖葡萄球菌復合發酵劑促使肉干中乳酸菌成為優勢菌，5 d時LSS組乳酸菌與葡萄球菌數量迅速增加至9.78、8.83 CFU/g，高于CO組；加快產品酸化速率，降低肉干的水分活度，顯著抑制了腸桿菌數量，致使成熟結束后LSS組腸桿菌數量（2.04 CFU/g）僅占CO組的2/5；接種復合發酵劑降低了肉干中尸胺、腐胺、組胺含量，成熟結束LSS生物胺總量為66.02 mg/kg，遠低于CO組的212.14 mg/kg。因而，添加上述復合發酵劑有利于縮短肉干加工周期，改善產品紅度色澤，提高產品品質和安全性能。