三陰型乳腺癌中PD-L1的表達與上皮-間質轉化的關系及意義

黃淅睿，楊承綱

乳腺癌是嚴重威脅我國女性生命健康的惡性腫瘤，而三陰型乳腺癌(triple-negative breast cancer, TNBC)是乳腺癌中極具侵襲性的一種亞型，占乳腺癌的10%～20%[1]。其復發、轉移率高，由于具有高度侵襲性和較低的治療反應，預后比其他乳腺癌亞型更差[2-3]。隨著免疫治療的不斷進展，越來越多的腫瘤患者從中獲益。研究表明，在許多癌癥類型中程序性死亡-配體1(programmed cell death-ligand 1，PD-L1)的表達與更差的預后相關，表明PD-L1的分泌促進腫瘤逃避免疫系統[4]。目前PD-L1抑制劑(Atezolizumab)用于TNBC治療的臨床研究，評估PD-L1的表達在臨床實踐中的療效預測價值日益凸顯[5]。上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是腫瘤惡性表型轉化的啟動過程，E-cadherin表達的缺失被認為是乳腺癌EMT發生的關鍵步驟，vimentin與細胞侵襲能力呈正相關，是EMT的晚期事件[6]。本文著重探討TNBC中PD-L1和EMT標志蛋白分子的關系及其臨床意義，為PD-L1用于TNBC的免疫治療及預后評估提供參考。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2018年9月～2020年6月云南省腫瘤醫院病理科存檔的125例TNBC組織和50例癌旁組織，125例TNBC患者均為女性，年齡26～82歲，中位年齡50歲，>50歲者58例，≤50歲者67例，已絕經者61例，未絕經者64例，腫瘤直徑≤2 cm者26例，>2 cm者99例，淋巴結轉移者57例，發生遠處轉移者5例。病理組織學WHO分級Ⅰ級4例，Ⅱ級59例，Ⅲ級62例；CK5/6陽性者72例，陰性者53例；Ki-67增殖指數≤14%者17例，>14%者108例；TNBC患者按第8版AJCC乳腺癌分期系統分期，Ⅰ+Ⅱ期者99例，Ⅲ+Ⅳ期者26例。125例患者均有完整臨床資料，病理類型均為浸潤性導管癌，其中119例行手術切除，術前均未接受放、化療、靶向治療等。

1.2 試劑PD-L1(SP142)兔單克隆抗體購自Abcam公司，E-cadherin、vimentin兔抗人多克隆抗體均購自福州邁新公司，免疫組化檢測試劑盒和DAB顯色劑均購自福州邁新公司，PD-L1檢測所需擴增增強二抗(Optiveiw)購自Roche公司。

1.3 免疫組化標本均經4%多聚甲醛固定，常規石蠟包埋，切片4 μm厚。PD-L1抗體為濃縮液，按1 ∶100比例稀釋，使用Ventana自動免疫組化染色平臺，選擇扁桃體組織作為陽性對照，PBS代替一抗作為陰性對照，操作步驟嚴格按試劑盒說明書進行。E-cadherin、vimentin采用免疫組化色EnVision兩步法染色，具體操作步驟嚴格按試劑盒說明書進行。

1.4 結果判讀

1.4.1PD-L1判讀標準 在HE切片中評估腫瘤區域，納入PD-L1評估范圍的區域包括浸潤性癌組織腫瘤內和瘤周間質中的免疫細胞，包括淋巴細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞和粒細胞等(圖1)，導管原位癌及腫瘤壞死區域不納入評分范圍。采用免疫細胞IC評分計算法：任何強度PD-L1染色的免疫細胞所占區域/腫瘤區域×100%。評分結果<1%為IC0，≥1%且<5%為IC1，≥5%且<10%為IC2，≥10%為IC3。免疫細胞染色區域占腫瘤區域≥1%(IC1、IC2、IC3)表示PD-L1陽性。此評分標準來源于IMpassion130研究設計，為FDA批準的首個采用免疫細胞評分計算PD-L1評分方法[7]。

圖1 TNBC浸潤性癌組織及分布在瘤內間質及瘤周間質中的淋巴細胞 圖2 TNBC腫瘤浸潤性免疫細胞中PD-L1呈陽性，Ventana法 圖3 TNBC中E-cadherin呈陽性，EnVision兩步法 圖4 TNBC中vimentin呈陽性，EnVision兩步法

1.4.2E-cadherin、vimentin判讀標準 E-cadherin陽性細胞定位于細胞膜上含有黃色或暗褐色顆粒，vimentin陽性定位于細胞質。高倍鏡下隨機選取10個視野，按陽性細胞所占百分比及著色深淺進行結果判定。(1)按陽性細胞著色評分：不著色為0分，弱著色或淡黃色為1分，中等著色或棕黃色為2分，強著色或棕褐色為 3 分。(2)按陽性細胞百分比評分：陽性細胞<25%為1分，25%～50%為2 分，51%～75%為3分，>75%為4分。兩項得分相加：0～4分為陰性，>4分為陽性。

1.5 統計學分析采用SPSS 25.0軟件進行統計學分析，計量資料兩組間行t檢驗，計數資料行χ2檢驗，采用Pearson列聯系數對PD-L1表達與 EMT 標志蛋白的免疫組化結果行相關性分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TNBC中PD-L1的表達PD-L1在正常乳腺組織中不表達，本組125例TNBC中，PD-L1在腫瘤浸潤性免疫細胞中表達IC0 67例，IC1 27例，IC2 12例，IC3 19例，PD-L1在TNBC中的陽性率為46.40%(58/125)(圖2)。

2.2 TNBC、癌旁組織中E-cadherin、vimentin的表達TNBC中E-cadherin呈陽性(圖3)，陽性率為52.80%(66/125)；癌旁組織中E-cadherin呈陽性，陽性率為90.00%(45/50)；TNBC組織中的E-cadherin陽性率低于癌旁組織，差異有統計學意義(χ2=21.306，P<0.01)。TNBC組織中vimentin呈陽性(圖4)，陽性率為41.60%(52/125)；癌旁組織中vimentin呈陽性，陽性率為16.00%(8/50)；TNBC組織中的陽性率高于癌旁組織，差異有統計學意義(χ2=10.388，P=0.001，表1)。

表1 TNBC、癌旁組織中E-cadherin、vimentin的表達 [n(%)]

2.3 TNBC中PD-L1與 E-cadherin、vimentin表達的相關性本組結果顯示，TNBC中PD-L1與E-cadherin蛋白呈負相關(χ2=17.440，P<0.01)；PD-L1與vimentin蛋白表達呈正相關(χ2=6.253，P=0. 012，表2)。

表2 TNBC中PD-L1與E-cadherin、vimentin表達的相關性

2.4 TNBC中PD-L1、E-cadherin、vimentin表達與臨床病理特征的關系本組結果顯示：PD-L1、E-cadherin、vimentin的表達與淋巴結轉移、Ki-67增殖指數、組織學分級有關(P<0.05)；與患者年齡、月經狀態、腫瘤大小、遠處轉移、TNM分期均無關(P>0.05，表3)。本組依據TNBC中CK5/6表達分為基底細胞亞型及非基底細胞亞型，PD-L1在兩者中的表達差異無統計學意義(P>0.05)。

表3 TNBC中PD-L1、E-cadherin、vimentin表達與臨床病理特征的關系

3 討論

PD-L1是程序性死亡因子-1(programmed cell death-1, PD-1)的配體之一，在多種腫瘤中表達，PD-L1與腫瘤浸潤淋巴細胞表面的受體PD-1結合，可抑制T細胞遷移、增殖及分泌細胞毒性介質，從而阻斷抗腫瘤免疫應答[8]，PD-L1在TNBC患者中過表達，盡管其機制尚不清楚，但已被認為與更強的侵襲力和較差的預后有關[9-10]。靶向PD-1/PD-L1途徑可能阻止抑制性T細胞信號轉導過程，并重新激活T細胞介導腫瘤殺傷功能，從而增強抗腫瘤免疫效應[11]。隨著免疫治療研究的不斷推進，目前全球已有5種PD-1/PD-L1抑制劑獲批上市。近年研究發現，針對PD-L1的單克隆抗體Atezolizumab安全、可耐受，在TNBC中顯示持續的抗腫瘤效果[12-13]。因此，PD-L1(SP142)作為Atezolizumab的伴隨診斷，檢測其在TNBC中的表達對臨床治療的意義日益顯著。本組PD-L1在TNBC中的陽性率為46.4%(88/125)，PD-L1的表達與淋巴結轉移、Ki-67增殖指數、組織學分級有關(P<0.05)，可證實TNBC中PD-L1參與免疫細胞的抗腫瘤免疫效應。本組結果顯示PD-L1與TNBC臨床分期及遠處轉移無相關性(P>0.05)，與PD-L1的表達促進腫瘤的侵襲、轉移的結論相悖，可能與本組Ⅲ、Ⅳ期TNBC病例量較少有關：(1)當代女性的健康意識廣泛提高，體檢意識增強，腫瘤的早發現、早治療得到了更好的實施；(2)隨著新輔助化療的廣泛應用，越來越多的晚期乳腺癌患者術前接受新輔助化療縮小腫瘤、延緩腫瘤進展，從而獲得手術機會。

EMT是腫瘤細胞突破基膜獲得侵襲及轉移能力的第一步。EMT過程對腫瘤細胞骨架排列變化起促進作用[14]，使細胞的黏附功能降低，原發病灶中的細胞更容易脫離，從而侵襲或轉移到周圍或遠處組織[15]。E-cadherin是典型的上皮細胞標志物，對維持細胞間黏附和個體上皮的完整起關鍵作用，與腫瘤的浸潤、侵襲能力呈負相關[16]。vimentin是間質細胞的標志物，可維持間質細胞特性，與細胞侵襲能力呈正相關。當腫瘤細胞發生EMT時，E-cadherin表達減少，角蛋白為主的細胞骨架轉變為vimentin為主的細胞骨架，從而引起細胞形態發生變化[17-18]，使腫瘤細胞擺脫細胞間的連接，并更具侵襲性，因此部分TNBC細胞因發生EMT呈間質表型[19]。本組癌組織中E-cadherin的陽性率明顯低于癌旁組織，而vimentin的陽性率顯著高于癌旁組織，且E-cadherin和vimentin的表達均與與淋巴結轉移、Ki-67增殖指數、組織學分級有關(P<0.05)，與以往研究報道中隨著腫瘤的發展呈E-cadherin表達降低，而vimentin表達增高的結果相符。實驗顯示TNBC中E-cadherin和vimentin的表達與遠處轉移及臨床分期無關，與文獻報道有差異，可能與本組晚期TNBC病例數少有關。

已有研究表明，在多種腫瘤中PD-L1的表達水平與EMT呈正相關。Asgarova等[20]證實在肺癌中EMT被TNF-α/TGF-β1誘導，并伴隨PD-L1的表達水平增加，提示可以通過DNA甲基化和NF-κB信號同時控制PD-L1的表達。Alsuliman等[21]的實驗中，使用EMT轉錄因子Snail在乳腺癌細胞中誘導EMT，促進癌細胞逃避CD8+毒性T細胞介導的T細胞裂解過程，支持EMT在乳腺癌細胞免疫逃逸中的作用，且證明EMT誘導的PD-L1上調是依賴PI3K/AKT和ERK/MEK途徑，表明EMT狀態是乳腺癌細胞PD-L1表達的重要調節因子。部分學者提出EMT還通過腫瘤逃避免疫監視的機制促進癌癥進展[22]，間充質細胞被證明能夠誘導調節性T細胞，在體外和體內通過TSP1的產生損害樹突狀細胞，并逃避T細胞介導的裂解；免疫組化標記如CD8+T細胞可以刺激乳腺癌細胞進行EMT[23]。當前各項研究表明PD-L1的表達及EMT均可促進腫瘤細胞的浸潤和遷移，并且靶向PD-1/PD-L1途徑將逆轉腫瘤細胞中的EMT[24]。本實驗可見TNBC中PD-L1與E-cadherin蛋白呈負相關，與vimentin表達呈正相關，可初步證實PD-L1的表達在發生EMT時上調，與文獻報道相符。EMT通過改變腫瘤細胞的表型進而增加侵襲能力，由此猜測在EMT過程中各種調控因子可通過促進PD-L1 的表達，促進腫瘤細胞的免疫逃逸。

綜上所述，PD-L1在TNBC中呈異常高表達，與癌細胞EMT表型有關，其具體調控機制還有待更深入的分析。目前TNBC治療手段較局限，雖然對化療敏感，但短期內易出現復發轉移，因此尋找TNBC有效的治療手段具有重要臨床意義。靶向PD1/PD-L1途徑將可能成為更精準抗擊腫瘤的策略，2019年Atezolizumab經批準可聯合化療用于無法切除的局部晚期或轉移性TNBC患者，因此檢測TNBC中PD-L1的表達有益于為免疫治療的應用奠定基礎，且聯合評估TNBC中的PD-L1表達水平與EMT狀態可為探索腫瘤發展過程及判斷腫瘤的預后提供依據。