錦鯉昏睡病(KSD)的實(shí)驗(yàn)室診斷分析(上)

劉 群，王 菁，劉桐山，王 鋼，韓進(jìn)剛，馮守明

(1.天津市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，天津 300402；2.天津市水產(chǎn)研究所，天津 300221)

錦鯉昏睡病(KSD)具有發(fā)病率高、死亡率高的特點(diǎn)，且呈現(xiàn)逐年上升態(tài)勢。本研究應(yīng)用流行病學(xué)調(diào)查、病理學(xué)觀察、分子生物學(xué)檢測等多種方法對(duì)天津地區(qū)一養(yǎng)殖場不明原因錦鯉死亡病例進(jìn)行診斷及分析，確診為由鯉浮腫病毒(Car p edema vir us，CEV)感染引起的錦鯉昏睡病(KSD)。現(xiàn)將其實(shí)驗(yàn)室診斷與分析結(jié)果報(bào)道如下。

一、材料與方法

1.樣品取樣

疾病暴發(fā)時(shí)，深入現(xiàn)場調(diào)查養(yǎng)殖水溫、養(yǎng)殖密度、魚齡、發(fā)病率、死亡率等情況，觀察病魚活動(dòng)狀態(tài)。取癥狀典型的發(fā)病魚活體置于解剖盤中，檢查其體表癥狀，解剖并剪取鰓、肝胰臟、脾、腎、腦組織，用于組織病理觀察的組織塊(不超過0.5厘米3)置于Davidson's AFA固定液固定；用于超微病理觀察的組織塊(厚度小于2毫米)置于TEM電鏡固定液中固定，并做好記錄。

2.寄生蟲檢查

觀察病魚活動(dòng)情況，用顯微鏡檢查病魚有無寄生蟲。鰓絲、體表黏液采取水浸片法，腦、肝胰臟、脾、腎組織采用壓片法，血液用涂片法。制片后置于顯微鏡下觀察發(fā)病魚體表、鰓和其他內(nèi)臟組織病變情況。

3.石蠟切片制備與觀察

用于組織病理觀察的組織塊固定24小時(shí)后置于70%(體積分?jǐn)?shù))乙醇，浸泡36小時(shí)后即可制備病理切片。經(jīng)脫水、浸蠟、石蠟包埋、切片、展片、烤片、脫蠟、染色、封片等步驟后，使用ZEISS光學(xué)顯微鏡對(duì)制備好的病理切片進(jìn)行顯微觀察，并用Axio Cam數(shù)字?jǐn)z像頭結(jié)合Axio Vision圖像分析軟件進(jìn)行拍照和測量。

4.透射電鏡切片制備與觀察

用于超微病理觀察的組織塊于4℃固定24小時(shí)后，0.1摩/升磷酸緩沖液沖洗，再經(jīng)1%鋨酸固定1.5小時(shí)，置于梯度乙醇脫水，經(jīng)包埋劑包埋后制作超薄切片，透射電子顯微鏡下觀察并拍照有無疑似病毒顆粒、形態(tài)特征等超微病理變化。

5.細(xì)菌分離培養(yǎng)

使用75%(體積分?jǐn)?shù))乙醇對(duì)病魚體表消毒，無菌環(huán)境下采集病魚腦、肝胰臟、脾、腎組織，于LB瓊脂平板劃線接種，28℃培養(yǎng)24小時(shí)，觀察細(xì)菌生長情況。

6.分子生物學(xué)鑒定

(1)核酸提取。切取瀕死病魚鰓組織并研磨，于1.5毫升RNase-f r ee離心管中挑取少量研磨液，用全自動(dòng)核酸提取純化移液工作站(M5073，Eppendor f)提取樣品核酸，并使用超微量核酸測定儀(IMPLEN，Ger man)測定其純度及濃度。

(2)病毒PCR檢測。參考鯉春病毒血癥病毒(SVCV)、錦鯉皰疹病毒(KHV)、鯉皰疹病毒II型(CyHV-II)、鯉浮腫病毒(CEV)相關(guān)檢測方法進(jìn)行相對(duì)應(yīng)病毒分子生物學(xué)檢測，同時(shí)以健康錦鯉基因組DNA作為陰性對(duì)照，相關(guān)檢測所用引物序列及檢測方法信息見表1。

表1 PCR檢測所用引物序列

7.人工感染試驗(yàn)

取患病錦鯉鰓組織，按1∶10(質(zhì)量體積比)加入無菌生理鹽水，研磨勻漿并反復(fù)凍融，經(jīng)差速離心收集上清液，以0.22微米濾膜過濾，采用注射終濃度2×10-2克/升組織液方式進(jìn)行人工感染試驗(yàn)。隨機(jī)取2組健康錦鯉進(jìn)行腹腔注射，每組10尾；實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組分別注射0.2毫升/尾組織懸液與等劑量無菌生理鹽水；(25±2)℃下水箱連續(xù)飼養(yǎng)31天，觀察發(fā)病情況，做好記錄，并及時(shí)剖檢實(shí)驗(yàn)魚和檢測病原體。

二、結(jié)果

1.現(xiàn)場調(diào)查及臨床癥狀檢查

錦鯉病例樣品取自于2018年7月末，養(yǎng)殖池塘水溫為26～29℃，起初錦鯉個(gè)別死亡，但病情進(jìn)展迅速。第1天僅死魚100余尾，第2天死魚便達(dá)500余尾，日死亡率為5%～8%。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，發(fā)病錦鯉為9月齡，全長為(14±5)厘米，體質(zhì)量為(48±10)克，養(yǎng)殖密度約400尾/米3水體。發(fā)病魚普遍表現(xiàn)為橫臥漂浮于養(yǎng)殖池淺水區(qū)水面，聚集于池角、岸邊及進(jìn)水口等處，體表無明顯損傷；活力明顯下降，初看似已死亡，一旦有聲音刺激便游動(dòng)，刺激結(jié)束后再次橫臥，發(fā)病死亡率介于50%～80%。體表臨床癥狀為頭部上方顱骨軟組織皺縮，眼球凹陷(圖1)。觀察病魚體表、體內(nèi)器官，其臨床癥狀表現(xiàn)為鰓黏臟，黏液分泌增多，有的鰓絲不完整，肝胰臟呈現(xiàn)白色，大部分發(fā)病魚脾腫大，其他組織器官無明顯異常。

圖1 發(fā)病錦鯉體表臨床癥狀

2.病理切片觀察結(jié)果

通過顯微病理觀察，患病錦鯉各組織器官出現(xiàn)不同程度病理變化，表現(xiàn)為多器官病變病理特征。其中，鰓絲末端細(xì)胞增生，呈腫大狀并黏附，有融合；鰓小片上皮細(xì)胞增生且其之間隙縫被上皮細(xì)胞填滿，可觀察到疑似包涵體存在(圖2A)。腎組織可見腎小管上皮細(xì)胞脫落水腫，部分水腫至空泡化，腎小球結(jié)構(gòu)清晰可見，組織可見少量炎癥細(xì)胞浸潤和疑似包涵體存在(圖2B)。肝細(xì)胞胞漿疏松，可見廣泛水腫，部分水腫至空泡化，并可見疑似包涵體(圖2C)。脾組織整體結(jié)構(gòu)正常，紅髓與白髓界限不清，無明顯壞死，組織可見疑似包涵體、多核巨細(xì)胞和大量黑色素巨噬細(xì)胞，未見明顯粒細(xì)胞浸潤(圖2D)。腦組織整體結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞排列緊密整齊，分界明顯，未見血管充血及炎癥細(xì)胞浸潤。

圖2 患病錦鯉鰓、腎、肝胰臟和脾組織病理變化

3.超微病理觀察結(jié)果

透射電鏡觀察結(jié)果顯示，病魚脾組織中可見大量晶格狀排列的病毒粒子積聚(圖3)，細(xì)胞結(jié)構(gòu)遭破壞；此次病魚樣品觀察鰓、腎、肝胰臟和腦組織中未見明顯病毒粒子，故未將圖片列出。

圖3 發(fā)病錦鯉樣品脾組織中的病毒粒子(箭頭)

(待 續(xù))