QuEChERS結合高效液相色譜串聯質譜法測定飼料中氯霉素

陳其煌

摘 要：建立QuEChERS結合高效液相色譜串聯質譜法測定飼料中氯霉素方法。樣品經水相分散后用乙腈提取，經QuEChERS方法凈化后，采用高效液相色譜串聯質譜法測定，外標法定量。以超純水和甲醇作為流動相，用Hypersil GOLD C18色譜柱（1.9 μm，2.1 mm×100 mm）進行梯度洗脫，采用電噴霧離子源（ESI-）、負離子掃描多反應監測（MRM）模式進行定性和定量分析。結果表明：氯霉素在5.0～200.0 ng·mL-1的范圍內線性關系良好（r=0.9992）。在10.0、20.0、50.0 μg·kg-1添加水平下的回收率為84.2%～89.7%，相對標準偏差（n=6）為6.5%～8.8%，檢出限（以信噪比>3計）為0.2 μg·kg-1，定量限（以信噪比>10計）為0.6 μg·kg-1。該方法精密度好，靈敏度高，能簡便地準確測定飼料中的氯霉素。

關鍵詞：QuEChERS;高效液相色譜串聯質譜法;氯霉素;飼料

中圖分類號：S 816.17 文獻標志碼：A 文章編號：0253-2301（2021）03-0046-07

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2021.03.010

Abstract： This study aimed to establish a method for the determination of chloramphenicol in feed by using QuEChERS combined with the high performance liquid chromatographytandem mass spectrometry method. After water dispersion， the samples were extracted with acetonitrile. And then after the purification by QuEChERS method， the samples were determined by high performance liquid chromatographytandem mass spectrometry and quantified by external standard method. By using the ultrapure water and methyl alcohol as mobile phases， the gradient elution was carried out by Hypersil GOLD C18 column （1.9 μm， 2.1 mm×100 mm）. And then the qualitative and quantitative analysis was carried out by using the electrospray ionization （ESI-） and anion scanning multiple reaction monitoring （MRM） modes. The results showed that the linear relation of chloramphenicol was good in the range of 5.0-200.0 ng·mL-1 （r=0.9992）. The recoveries at the adding levels of 10.0， 20.0 and 50.0 μg·kg-1 ranged from 84.2% to 89.7%， the relative standard deviations （n=6） were 6.5%-8.8%， the limits of detection （based on S/N>3） were 0.2 μg·kg-1， and the limits of quantitation （based on S/N>10） were 0.6 μg·kg-1. The method had good precision， high sensitivity and could be used to determine the chloramphenicol in feed simply and accurately.

Key words： QuEChERS;High performance liquid chromatographytandem mass spectrometry;Chloramphenicol;Feed

氯霉素（Chloramphenicol，分子式：C11H12Cl2N2O5，分子量：323.14，CAS：56757）屬于酰胺醇類抗生素，是一種廣譜抑菌性抗生素，對多種病原菌具有較強的抑制作用，被廣泛應用在水產、畜禽養殖上。氯霉素會抑制骨髓細胞中蛋白質的合成，對人類和動物的骨髓細胞和肝細胞具有毒性作用，不僅可引起細胞減少性貧血、血小板減少和再生障礙性貧血，還可導致嚴重的胃腸道反應、二重感染等，對人體產生毒性[1-2]。為進一步規范養殖用藥行為，保障動物源性食品安全，2019年12月27日，農業農村部發布第250號公告，將氯霉素列入食品動物中禁止使用的藥品及其他化合物清單。因此，加強對飼料中氯霉素殘留的檢測具有非常重要意義。

目前，飼料中氯霉素的檢測方法主要有酶聯免疫吸附測定法（ELISA）[3-5]、氣相色譜法[6]、氣相色譜質譜聯用法[7-8]、高效液相色譜法（HPLC）[9-10]和高效液相色譜串聯質譜法（HPLCMS/MS）[11-19]，大多采用固相萃取或液液分配萃取凈化，前處理操作比較復雜煩瑣，溶劑消耗量大。QuEChERS（Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、Safe）方法是由Anastassiades等于2003年提出[20]，該方法在農藥殘留、獸藥殘留及非法添加物測定等領域得到廣泛應用，并在應用中不斷改善，已成為農藥獸藥等殘留定性定量的方法之一[21-26]。采用QuEChERS方法測定飼料中氯霉素尚未見研究報道，本研究建立的QuEChERS結合高效液相色譜串聯質譜法測定飼料中氯霉素的方法，操作快捷、簡便、實用，靈敏、準確可靠，可為檢測飼料中是否非法添加氯霉素提供可靠手段，滿足飼料中氯霉素的快速測定要求。

1 材料與方法

1.1 試驗儀器

SHIMADZU 30A（CBM30ACTO30ALC30ADSIL30ACDGU20A5R，日本Shimadzu公司）;Triple Quad 5500三重四極桿質譜儀（美國AB Sciex公司）;KQ500DE型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）;MilliQ去離子水發生器（美國MILLIPORE公司）;CF16RXⅡ高速冷凍離心機（日本HITACHI公司）; PL602S電子天平[梅特勒托利多（上海）有限公司];VORTEX GENIUS 3 旋渦混合器（德國IKA公司）;VXⅢ多管渦旋振蕩器[安簡（北京）科技有限公司]。

1.2 試驗試劑

氯霉素標準品（Chloramphenicol）（德國 Dr.Ehrenstorfer GmbH 公司，純度99.9%）;甲醇、乙腈為色譜純試劑（美國TEDIA公司）;甲酸為分析純（國藥集團化學試劑有限公司）;氯化鈉為分析純（國藥集團化學試劑有限公司）;實驗室用水為MilliQ高純水;QuEChERS萃取鹽包（Part No.59827555，內含1.5 g NaCl、6.0 g MgSO4，美國Agilent公司）;QuEChERS凈化管A（Part No.5982

5421CH，2 mL，內含50 mg PSA、50 mg C18EC、150 mg MgSO4，美國Agilent公司）;QuEChERS凈化管B（Part No.59825421CH，2 mL，內含50 mg PSA、50 mg C18EC、50 mg GCB、150 mg MgSO4，美國Agilent公司）;有機相針式濾器（尼龍，13 mm，0.22 μm，上海安譜實驗科技股份有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品前處理 （1）樣品制備。按照GB/T 14699.1-2005/ISO 6497：2002進行采樣[27]，按GB/T 20195-2006/ISO 6498：1998[28]要求對樣品進行制樣處理，飼料樣品粉碎后過1 mm 孔徑的分析篩，混勻后裝入密閉封口塑料袋中，避光冷藏保存，備用。（2）提取與凈化。準確稱取2 g（精確到0.01 g）飼料樣品于50 mL離心管內，加入超純水4 mL，浸泡渦旋充分混勻，再準確加入乙腈4.0 mL和4 g氯化鈉，渦旋混勻并振蕩5 min后，8000 r·min-1離心10 min，取出上層有機相1 mL至QuEChERS凈化管A內，渦旋混勻并振蕩2 min，于15000 r·min-1高速離心10 min，取上清液適量過0.22 μm有機相濾膜，供高效液相色譜串聯質譜儀測定。同步做空白提取液和空白添加試樣。

1.3.2 標準溶液配制 精密稱取氯霉素標準品10 mg至100 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即含氯霉素100 μg·mL-1標準儲備液，于-18℃避光保存備用，有效期6個月。量取儲備液用甲醇稀釋到1 μg·mL-1，作為氯霉素標準中間液，于-18℃避光保存備用，有效期3個月。精密稱取適量的氯霉素標準中間液用同類基質空白樣品提取液配制，制得5.0、10.0、20.0、50.0、100.0、200.0 ng·mL-1對照溶液，供高效液相色譜串聯質譜儀測定。

1.3.3 提取溶劑和提取方式選擇 分別采用乙腈、0.1%甲酸乙腈溶液、0.2%甲酸乙腈溶液、0.5%甲酸乙腈溶液、1.0%甲酸乙腈溶液作為提取溶劑，其余步驟均按1.3.1

（2）提取與凈化進行，添加氯霉素標準溶液進行提取回收率試驗，確定最佳提取溶劑。

取陰性飼料樣品添加氯霉素標準溶液后，在加入水和乙腈后，分別同步采用渦旋振蕩和超聲2種方式進行提取，其余步驟均按1.3.1（2）提取與凈化進行，比較考察2種提取方式的回收率情況。

1.3.4 凈化條件優化 試驗進行QuEChERS凈化管A和QuEChERS凈化管B兩種凈化管的加標回收率和凈化效果對比試驗，分別采用A、B兩種凈化管凈化樣品提取液，其他步驟均按1.3.1（2）操作進行。

1.3.5基質效應 取陰性飼料樣品按1.3.1（2）提取與凈化制備空白樣品提取液配制基質標準曲線與溶劑標準曲線進行上機分析，比較考察氯霉素的響應強度。

1.4色譜與質譜條件

1.4.1 色譜條件 色譜柱：Hypersil GOLD C18色譜柱（1.9 μm，2.1 mm×100 mm）;流動相：A相為超純水，B相為甲醇;流速：0.30 mL·min-1;洗脫程序：0～0.5 min維持10% B，0.5～4 min線性變化至95% B，4～7 min維持95% B，7.0～7.1 min線性變化至10% B，并維持到10 min。柱溫30℃。進樣量：1.0 μL。

1.4.2 質譜條件 電噴霧離子源（ESI-），負離子掃描模式，掃描方式為多反應監測（MRM）;電噴霧電壓（IS）為-4500 V，輔助氣溫度（TEM）550℃，霧化氣（GS1）壓力50 psi，輔助氣（GS2）壓力50 psi，氣簾氣（CUR）壓力35 psi。

1.5 定性與定量分析

在相同試驗條件下，檢出物質的色譜峰保留時間與標準品的保留時間偏差在±2.5%之內，并且樣品譜圖中定性離子的相對豐度與同等條件下得到的標準溶液譜圖相比，允許偏差符合歐盟2002/657/EC《質譜分析方法鑒定點數》中的規定，則可判定樣品中存在對應的被測物。基質標準工作溶液注入儀器檢測，獲得質量濃度與響應值（色譜峰面積）線性相關的標準工作曲線，外標法定量。

2 結果與分析

2.1 色譜條件優化

甲醇和乙腈常被用于反相液相色譜的流動相，本試驗分別以乙腈和甲醇作為液相洗脫流動相考察氯霉素的分離度和靈敏度。結果表明以乙腈和甲醇2種有機試劑作為流動相都能達到分離度要求，靈敏度差別不大。從經濟方面考慮，本研究選擇甲醇作為洗脫流動相。以甲醇和超純水為流動相，優化梯度洗脫方法，縮短分析時間，確保保留時間穩定，獲得理想的峰形和靈敏度。圖1為5.0 ng·mL-1氯霉素標準溶液的MRM色譜圖。

2.2 質譜條件優化

氯霉素由于其化學結構中羥基、酰胺鍵的存在，具有很強的極性，在負離子模式下有較高的響應[14]。 在電噴霧離子源負離子模式（ESI-）下進行全掃描，采用質量濃度1.0 μg·mL-1的氯霉素標準溶液以10.0 μL·min-1的流速針泵連續注入質譜儀進行全掃描，獲得[MH]的準分子離子峰，以其作為母離子進行轟擊，獲得碎片子離子，選擇信號較強的兩個碎片子離子和母離子組成兩對監測離子對，在多反應監測（MRM）模式下，進一步優化去簇電壓（DP）、碰撞能量（CE）、入口電壓（EP）和碰撞室出口電壓（CXP）等參數。優化獲得的MRM離子對及質譜條件見表1。

2.3 提取溶劑和提取方法的確立

飼料基質復雜，含有大量的干擾物，會干擾目標化合物的分析，這就要求前處理必須能夠凈化飼料復雜基質， 同時又要能夠提取出目標化合物。氯霉素易溶于乙腈、甲醇和乙酸乙酯，考慮到甲醇和乙酸乙酯的鹽析效果較差，不利于分層，因此選用乙腈作為主提取溶劑做進一步考察優化。試驗結果表明，用乙腈、0.1%甲酸乙腈溶液、0.2%甲酸乙腈溶液、0.5%甲酸乙腈溶液、1.0%甲酸乙腈溶液提取的添標回收率分別為83.5%～89.4%、82.1%～86.3%、81.3%～90.2%、68.7%～76.6%、65.3%～75.2%，前三者差別不大，均比用后二者提取的回收率高。綜合考慮選擇乙腈作為提取溶劑。

試驗還考察比較渦旋振蕩和超聲2種提取方式對回收率的影響。結果表明，渦旋振蕩和超聲2種提取方式的回收率分別為84.6%～87.2%、83.8%～85.6%，綜合考慮操作簡便和時耗等因素，最終確定選用渦旋振蕩提取方式。

2.4 凈化條件優化

試驗結果表明，凈化管A凈化后的樣品加標回收率在80%～110%，而凈化管B凈化后的樣品加標回收率在65%～80%，兩種凈化管凈化后的樣品色譜圖雜峰不多，均有較好的凈化效果，因此選擇凈化管A作為前處理凈化管。

2.5 基質效應分析

取陰性飼料樣品按1.3.1（2）提取與凈化制備空白樣品提取液配制基質標準曲線與溶劑標準曲線進行比較分析。試驗結果表明，在相同儀器條件下，相同濃度的氯霉素基質標準溶液的質譜響應值均比溶劑標準溶液的響應值高，表明氯霉素在飼料基質中有較強的基質增強效應。為降低基質效應影響，提高準確性，本方法采取基質匹配標準曲線定量分析。

2.6 方法學考察

2.6.1 方法的線性范圍 采用本研究建立的方法獲得的基質匹配標準曲線線性良好，在5.0～200.0 ng·mL-1的質量濃度范圍內，氯霉素質量濃度X與其峰面積Y的標準曲線線性方程為Y=5.43×103X+8.43×103，線性相關系數r為0.9992。圖2為氯霉素基質匹配標準曲線圖。

2.6.2 方法的靈敏度 以空白樣品低水平加標測試方法的檢出限（LOD）和定量限（LOQ），以3倍信噪比（S/N=3）對應的濃度為方法的檢出限，以10倍信噪比對應的濃度為方法的定量限。通過計算，該方法檢出限為0.2 μg·kg-1，定量限為0.6 μg·kg-1。參考GB/T 21108-2007《飼料中氯霉素的測定 高效液相色譜串聯質譜法》中氯霉素的方法最低檢出限為5 μg·kg-1，定量限為10 μg·kg-1[11]，農業部2483號公告-8-2016《飼料中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考的測定液相色譜串聯質譜法》中氯霉素的方法檢出限為0.3 μg·kg-1，定量限為1 μg·kg-1[19]，本方法的靈敏度能夠滿足檢測要求。

2.6.3 方法的精密度和準確度 分別添加適量的標準溶液至空白飼料樣品中，制得10.0、20.0、50.0 μg·kg-1 3種添加水平的樣品各6個，按照建立的方法處理樣品并進行HPLCMS/MS分析測定，圖3～4為空白飼料樣品和加標水平為50.0 μg·kg-1的飼料樣品MRM色譜圖。結果（表2）表明，氯霉素的回收率為84.2%～89.7%，相對標準偏差（n=6）為6.5%～8.8%，本方法具有良好的準確性，能夠滿足獸藥殘留的分析要求。

2.7 實際樣品檢測

用本方法對12份來自飼料樣品進行檢測，所測樣品均未檢出氯霉素殘留。樣品譜圖本底干凈沒有干擾峰，質控樣品添加氯霉素標準溶液回收率為85.7%，符合GB/T 27417-2017《合格評定 化學分析方法確認和驗證指南》的相關規定[29]。

3 結論與討論

本研究采用QuEChERS方法前處理用于飼料中氯霉素的測定，結果表明，氯霉素在5.0～200.0 ng·mL-1的范圍內線性關系良好（r=0.9992）。在10.0、20.0、50.0? μg·kg-1添加水平下的回收率為84.2%～89.7%，相對標準偏差（n=6）為6.5%～8.8%，檢出限（以信噪比>3計）為0.2 μg·kg-1，定量限（以信噪比>10計）為0.6 μg·kg-1。試驗過程中發現，石墨化碳黑（GCB）對色素有較強的吸附作用，在用含有GCB的凈化管凈化后，樣品顏色較淺，但氯霉素添標回收率降低，表明GCB對樣品中的氯霉素有吸附損失，本試驗進樣量較少，因此綜合考慮選擇不添加GCB。如遇樣品色素較深且需要大體積進樣時，建議在確?；厥章实耐瑫r，優化適量添加GCB。本研究建立了高效液相色譜串聯質譜法測定飼料中氯霉素的方法，樣品經水相分散后，用乙腈提取QuEChERS方法凈化，以基質配制標準溶液外標法定量。樣品前處理簡單，消耗有機溶劑較少，線性范圍寬，方法的定量限低，精密度和準確度高，符合方法學要求。該方法適合于批量實際樣品的快速檢測，能夠滿足藥物殘留分析要求，可用于飼料中氯霉素非法添加的檢測監控。由于條件等限制，本試驗未將同屬于酰胺醇類抗生素的甲砜霉素和氟甲砜霉素同時進行考察試驗，下一步將進行深入考察探究，以滿足樣品多項目同時測定的需要。

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（責任編輯：林玲娜）