Pdots-RVG-Curcumin納米復合物穿透體外血腦屏障模型的研究*

文欣宜，蘇炳銀，李淑蓉△，韓玉萍△

1.成都醫學院 發育與再生四川省重點實驗室(成都 610500)；2.成都醫學院 病理學與病理生理學教研室(成都 610500)；3.成都醫學院 組織胚胎學教研室(成都 610500)

血腦屏障(blood brain barrier，BBB)是存在于血液和中樞神經系統之間的屏障結構，由腦微血管內皮細胞及內皮細胞間的緊密連接、星形膠質細胞足突、基底膜和周細胞組成[1]。BBB一方面起神經保護作用，保證中樞神經系統較少被外來物質侵擾，維持高度的穩態，同時為腦內輸送營養物質；另一方面，BBB也阻礙了用于腦部疾病診斷和治療的藥物通過非侵入性給藥方式進入腦內。因此，通過各種手段對藥物進行結構等方面的修飾，使藥物能夠穿越BBB[2]，進入腦組織發揮藥效，是近些年研究者重點關注的方向。腦靶向生物相容性高的納米生物載體可以在分子水平上解決這個問題。

理想的腦靶向藥物系統包括治療性藥物、藥物載體、靶向分子三部分。姜黃素(curcumin, Cur)是從姜黃根莖中提取的一種多酚類物質，有著廣泛的藥理作用，如抗炎、抗氧化，抗腫瘤、抗動脈粥樣硬化等[3-6]，近年來逐漸用于神經退行性疾病的治療。然而，由于Cur在體內半衰期短、口服吸收差、化學性質不穩定，導致其生物利用度較低，限制了Cur在臨床上的運用。半導體聚合物量子點(semiconducting polymer dots, Pdots)經修飾后可用作靶向藥物載體，提高藥物的靶向運輸能力，延長藥物的半衰期，增強藥物的治療作用，同時減小藥物的毒性。Pdots的疏水性使其具有載體屏蔽作用，藥物被包覆在Pdots內部，或者與Pdots共價連接[7]。狂犬病病毒衣殼中包含有嗜神經性蛋白質(rabies virus glycoprotein, RVG)，能被神經元表面表達的尼古丁乙酰膽堿受體特異性識別。在RVG的作用下，狂犬病病毒很容易越過BBB，侵襲腦組織和神經中樞，引起狂犬病發作[8]。本研究通過構建Pdots-RVG-Cur納米復合物以及體外BBB模型，探討Pdots-RVG-Cur穿透BBB靶向神經元的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

小鼠中腦多巴胺能神經元細胞系(MN9D)、小鼠腦微血管內皮細胞系(b.End3)由中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫提供，高糖DMEM、DMEM/F12培養基、胎牛血清、雙抗(青霉素+鏈霉素)、0.25%胰酶均購自美國Gibco公司，超濾離心管(0.5 mL/100 kd)、0.22 μm親水PVDF微孔濾膜、懸掛式細胞培養小室(PET 3 μm, 24-well)均購自美國Millipore公司，二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)、9,9-二辛基聚芴苯并噻二唑交替共聚物(F8BT)、四氫呋喃(tetrahydrofuran,THF)、Cur、多聚甲醛、聚苯乙烯-馬來酸酐 (poly styrene-co-maleic anhydride, PSMA)均購自德國sigma-aldrich公司，RVG29-Cys購自上海吉爾生化公司，抗熒光淬滅劑(4′,6-二氨基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)、羥乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)購自上海碧云天公司，CCK-8試劑盒購自日本同仁公司，不含酚紅DMEM高糖培養基購自美國博士德公司，熒光素鈉購自上海阿拉丁公司，鼠尾Ⅰ型膠原、細胞培養皿均購自美國Corning公司。

1.2 材料制備

1.2.1 Pdots的制備 采用納米共沉淀的方法制備Pdots。將0.75 mg共軛聚合物F8BT、0.187 mg兩親性聚合物PSMA溶解于3 mL THF，將混合液迅速加入正在超聲的雙蒸水中，繼續超聲20 min直至溶液澄清透亮。將溶液置于通風櫥，通風過夜以蒸發溶液中多余的THF。將得到的溶液用100 KDa超濾管離心提純。最后，將提純后的溶液通過0.22 μm的膜過濾得到濃度為250 mg/L的Pdots原液。密封，置于4 ℃冰箱避光保存。

1.2.2 Pdots-RVG的制備 將Pdots與RVG按照1∶1 000 mol/L比例混合，若要配置1 mL含Pdots-RVG的培養基，按照以下比例混合：Pdots原液100 μL、HEPES(1 mol/L) 15 μL、RVG(1 mmol/L)8.8 μL、含2% FBS的細胞培養基876.2 μL。按照順序依次加入，每步充分混合。其中，加入RVG后要充分混合20 min后再加入培養基。Pdots-RVG混合液現用現配，盡量避光操作。

1.2.3 Cur母液及Pdots-RVG-Cur的配制 Cur溶解于無水乙醇中，配制成濃度為10 g/L的Cur溶液。將合成好的Pdots-RVG與一定量的Cur溶液混合，室溫下搖床輕微搖晃2 h以充分混勻，制備Pdots-RVG-Cur。

1.3 材料的表征

1.3.1 透射電子顯微鏡(transmission electron microscope, TEM)下觀察納米顆粒的形態 取50 μL樣品滴加到銅網上，干燥后在TEM下對其形貌進行表征。其中Pdots-RVG、Pdots-RVG-Cur經過磷鎢酸染色。

1.3.2 動態光散射技術(dynamic light scattering, DLS)檢測納米顆粒粒徑及穩定性分析 將樣品稀釋到合適的倍數，用納米粒度儀測量，采集數據，獲得其平均水力學直徑及多分散系數(particle dispersion index, PDI)。將樣品室溫放置24、48 h后采集數據。

1.4 CCK-8檢測細胞存活率

MN9D細胞和b.End3細胞培養至對數生長期后分別接種于96孔板，分為空白組、對照組、實驗組，空白組不含細胞。實驗組分別加入含不同濃度Pdots-RVG混合液(Pdots濃度為10～50 mg/L，RVG的濃度按照方法1.2.2相應增加)的培養基，37 ℃，5%CO2培養箱孵育48 h。吸除培養基，每個孔內加入含10% CCK-8試劑的培養基，避光孵育1.5 h。用酶標儀測定450 nm處的吸光度值，根據公式計算細胞存活率。細胞存活率(%)=(A給藥-A空白)/(A對照-A空白)×100%。

1.5 BBB體外模型的建立

取足夠數量的懸掛式細胞培養小室置于24孔板內。小室上層加100 μmol/L鼠尾膠原Ⅰ，濕潤小室20 min后吸出，超凈工作臺1級風干6 h，風干成膠。將b.End3接種在涂有鼠尾膠原Ⅰ的小室的PET膜上，小室下層加500 μL高糖DMEM培養基以高過PET膜水平面。接種細胞當天，12 h后更換小室上層培養基，以后隔天換液。

1.6 BBB體外模型的評價

1.6.1 4 h滲漏實驗 細胞貼附在PET膜上后，在小室上層加入300 μL高糖DMEM細胞培養基，在小室下層加入500 μL高糖DMEM細胞培養基以高過上層液面(具有>0.5 cm的液面差)。置于細胞培養箱培養4 h，取出觀察小室上、下層液面差變化。當4 h后液面差沒有明顯變化時，說明形成了較為致密的細胞層，行下步熒光素鈉(fluorescein sodiu,FLU)通透性實驗。

1.6.2 FLU通透性實驗 測定1.000、0.500、0.250、0.125、0.063 g/L FLU溶液在530 nm處的吸光度值，繪制FLU標準曲線。細胞小室上層加300 μL含1 g/L FLU的無酚紅DMEM培養基，下層加入無酚紅DMEM培養基，加入的量以保持上、下液面相平為準。培養2 h后，分別從上、下室中取100 μL溶液，加入到96孔板中，酶標儀測溶液在530 nm處的吸光度，利用標準曲線計算FLU濃度。以未加入b.End3細胞的小室作為空白對照組，4 h試漏實驗成功的b.End3細胞小室為模型組，比較兩組FLU通透率差異。小室FLU通透率=(下室FLU濃度×下室培養液體積)/(上層FLU濃度×上室培養液體積)×100%。

1.7 觀察BBB模型中MN9D細胞對藥物的攝取情況

將MN9D細胞接種于帶有細胞爬片的24孔板內，將成功建立BBB體外模型的懸掛式細胞小室移至其內(圖1)向小室上層分別加入DMEM/F12培養基、含20 μmol/L Cur的培養基、含相同Cur濃度的Pdots-RVG-Cur的培養基，共孵育48 h。培養結束后，移去小室，MN9D細胞爬片PBS洗3次。4%多聚甲醛避光固定細胞20 min。將細胞爬片有細胞的一面朝下蓋在滴有抗熒光淬滅劑(含DAPI)的載玻片上，通風櫥避光通風，風干后后立即用激光共聚焦顯微鏡(confocal laser scanning microscope,CLSM)觀察。

圖1 體外BBB模型圖

1.8 統計學方法

2 結果

2.1 Pdots、Pdots-RVG、Pdots-RVG-Cur的表征

2.1.1 TEM下觀察納米顆粒的形貌 TEM下觀察Pdots的外貌呈相對均勻的球形，粒徑在0.10 μm左右。Pdots-RVG、Pdots-RVG-Cur同樣呈球形，粒徑分別在0.20、0.33 μm左右(圖2), 表明Pdots-RVG載藥結構具有穩定性。

圖2 TEMF觀察Pdots、Pdots-RVG、Pdots-RVG-Cur的形態

2.1.2 DLS測試納米顆粒粒徑及及穩定性分析 PDI表示粒徑分布的離散程度，PDI越小，說明粒子大小分布越集中，粒徑表征時PDI的最佳范圍為0.08～0.70。測量Pdots、Pdots-RVG、Pdots-RVG-Cur的PDI分別為0.206、0.217、0.308,納米粒子分散均勻，粒徑測量結果可靠。Pdots平均粒徑為98.4 nm, Pdots-RVG平均粒徑為214.8 nm, Pdots-RVG-Cur平均粒徑為317.2 nm(圖3)。這與TEM下觀察到的粒子粒徑相符合。24、48 h再進行DLS測量。結果顯示，隨著時間推移，Pdots、Pdots-RVG、Pdots-RVG-Cur的粒徑分別相對穩定在95、250、320 nm左右，說明三者在溶液中穩定性均良好(表1)。

圖3 Pdots、Pdots-RVG、Pdots-RVG-Cur的粒徑分布圖

表1 Pdots、Pdots、Pdots-RVG-Cur不同時間點的粒徑(nm)

2.2 納米材料的生物相容性

為了研究Pdots-RVG作為載藥體的細胞毒性，用濃度梯度的Pdots-RVG處理MN9D細胞和b.End3細胞48 h,用CCK-8分別檢測兩種細胞的存活率。結果發現，隨著藥物濃度的增加，兩種細胞的存活率均下降。在10 mg/L時，MN9D細胞和b.End3細胞的存活率分別為95.1%、94.8%，均高于90.0%。當藥物濃度達到50 mg/L時，MN9D細胞和b.End3細胞的存活率分別為84.5%、80.2%，仍高于80.0%(圖4)。Pdots-RVG表現出較低的細胞毒性。

圖4 不同濃度Pdots-RVG對細胞的損傷作用

2.3 BBB體外模型的建立與評價

將b.End3細胞以每孔8×104個/cm2的密度接種在涂有鼠尾膠原Ⅰ的小室的PET膜上,12 h后光鏡下觀察到小室內無懸浮細胞，說明細胞已貼附生長在PET膜上，此后每隔24 h行一次4 h試漏實驗。

2.3.1 4 h試漏實驗 細胞貼膜生長后，每隔24 h行1次4 h試漏實驗。觀察到在細胞接種第96 h時，4 h試漏實驗結果顯示，模型組小室內外液面差在4 h后能保持相對穩定，且>0.5 cm, 而未接種細胞的空白對照組4 h后，小室內、外液面差消失，內外液面齊平(圖5)。結果說明此時細胞已生長融合足夠緊密，形成了致密的細胞層，對液體有一定的屏障作用，阻隔了液體間的流動。將此小室用于下步FLU通透性檢測。

圖5 4 h試漏實驗

2.3.2 FLU通透性檢測 由FLU標準曲線可知， FLU濃度與其吸光度值有較好的相關性，可以通過吸光度值間接反映FLU的濃度(圖6 A)。根據標準曲線及通透率計算公式計算兩組的通透率，模型組FLU通透率48.52%，對照組FLU通透率90.67%(圖6 B)。模型組通透性明顯低于空白對照組(P<0.001)，說明模型對小分子物質具有一定的阻隔作用，模型組具有較低的通透性，體外BBB模型建立成功，用于下步細胞攝取Cur、Pdots-RVG-Cur的實驗。

圖6 熒光素鈉通透性測試

2.4 藥物透過BBB體外模型被神經元攝取情況

將成功建立BBB體外模型的細胞小室移至種植有MN9D細胞的24孔板內。向小室上層分別加入培養基、含Cur的培養基、含相同Cur濃度的Pdots-RVG-Cur的培養基，孵育48 h后，于CLSM下觀察MN9D細胞對藥物的攝取情況(圖7)。Cur和Pdots-RVG-Cur均能穿過BBB模型進入小室下層被MN9D細胞攝取，且Pdots-RVG-Cur組細胞顯示出比相同濃度游離的Cur組細胞更強的紅色熒光。結果表明Pdots-RVG-Cur和游離的Cur均能透過體外BBB模型，用Pdots-RVG包裹Cur相比于游離Cur更容易被細胞攝取，Pdots-RVG增加了Cur的生物利用度；這可能是因為Pdots的包裹提高了疏水性Cur的溶解度和分散性，而RVG不僅能與神經元上特異受體結合，使納米顆粒進入神經元，還可以介導納米顆粒穿過BBB。

圖7 CLSM下觀察體外BBB模型中MN9D細胞對藥物的攝取情況

3 討論

隨著我國人口老齡化程度逐年加重，阿爾茲海默病、帕金森病、肌萎縮側索硬化等神經退行性疾病的發病人群逐年增加[9-10]。中樞神經系統疾病的治療進展緩慢，主要的障礙之一是由于血腦屏障限制了治療藥物向中樞神經系統的有效遞送。因此，開發各種載藥系統，使藥物能穿過血腦屏障進入腦部病灶部位發揮療效是神經系統疾病治療的研究熱點。

在靶向腦藥物的開發領域中，納米材料由于其生物學特性而具有獨特的優勢。Pdots作為一種新型的納米探針，擁有作為藥物載體的開發潛力。首先，Pdots具有低毒性，較高的生物相容性，保證了其藥物安全性。其次，Pdots具有疏水性，可利用載體的屏蔽作用包裹并保護藥物。除此之外，Pdots表面帶電荷，使得其易于與藥物結合。同時，Pdots還擁有較高比表面積(即單位質量物料所具有的總面積)，提示其作為藥物載體能獲得較高的藥物載量[11-18]。然而將其作為藥物載體的研究目前并不多。本研究選用Pdots作為藥物載體裝載靶向分子RVG以及治療性藥物Cur，通過本實驗驗證了Pdots具有較穩定的載藥結構、較低的細胞毒性以及較好的BBB穿透性。

開發有效的穿透BBB靶向腦的藥物遞送系統，除了要有藥物載體之外，還要有腦靶向遞送策略。藥物遞送入腦主要有以下3種方式：1)吸附介導的跨血腦屏障轉運;2)細胞穿膜肽介導的跨BBB轉運；以上兩種方法都并不是特異靶向到腦部。3)受體或轉運體介導的轉胞吞實現跨BBB轉運。RVG29是近年來新發現的一種存在于狂犬病毒糖蛋白上一段29個氨基酸序列的多肽，該段多肽能被神經元表面表達的尼古丁乙酰膽堿受體特異性地識別最終使得狂犬病毒穿過BBB[19-20]。本研究構建的Pdots-RVG-Cur載藥系統中，RVG29作為靶向遞送分子，發揮了協助藥物穿透BBB，并增強神經元對藥物的攝取的作用。

本研究通過構建上層為BBB模型，下層為MN9D細胞的體系，探究向上層加藥物后，下層細胞內是否能觀察到此藥物，以此模擬藥物在人體內透過血腦屏障進入神經元的過程。本實驗結果表明，Pdots-RVG-Cur和游離的Cur均能透過體外BBB模型，但用Pdots-RVG包裹Cur后，相比于游離Cur，穿透BBB并被細胞攝取Cur的量更多。這說明Pdots-RVG作為載藥體，提高了Cur的生物利用度，揭示Pdots的包裹提高了疏水性Cur的溶解度和分散性，從而提高Cur在溶液中的穩定性。并且，RVG作為腦靶向分子，能夠增加藥物系統穿透BBB效率。

綜上所述，選用RVG29作為腦靶向分子，將其與作為載體的Pdots相連接，建立Pdots-RVG藥物遞送系統，并裝載神經保護性藥物Cur，利用RVG29與BBB上受體結合介導的穿胞作用以及Pdots的藥物包封作用，實現將Cur載藥系統轉運至腦部的效果，為后續開發Cur類神經治療性藥物提供新的思路。