外排泵抑制劑對泛耐藥鮑曼不動桿菌生物被膜的影響*

王清會，藺 飛，袁明勇，凌保東△

1.成都醫學院 結構特異性小分子藥物研究四川省高校重點實驗室(成都 610500)； 2.成都醫學院 藥學院(成都 610500)；3.成都醫學院臨床醫學院·第一附屬醫院(成都 610500)

細菌主要以浮游態和生物被膜態兩種形態存在于環境中，臨床上80%的細菌感染性疾病的持續與生物被膜的形成有關[1]，由于臨床抗菌藥物的廣泛使用，促進了細菌生物被膜的形成，導致細菌的耐藥性、致病性不斷提升，慢性感染、反復感染率不斷增加[2-3]; 研究[4-5]表明，外排泵在生物分子的細胞間信號傳遞中起重要作用，以協助生物被膜形成，通過對胞外多糖(exopolysaccharide，EPS)或群體感應(quorum-sensing，QS)因子的外排，調控參與生物被膜形成的基因；阻止生物被膜中細菌的黏附等作用方式影響生物被膜的形成，是導致細菌耐藥的主要機制之一。對抗耐藥性的一種可能機制是采用外排泵抑制劑阻斷外排泵的相關功能，最終阻礙生物被膜的形成[6-7]。本研究擬探討泛耐藥鮑曼不動桿菌浮游狀態與生物被膜狀態下外排泵基因表達是否存在差異和外排泵抑制劑對生物被膜形成是否存在影響。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

從成都醫學院第一附屬醫院收集9株2018—2019年住院患者臨床標本的非重復泛耐藥鮑曼不動桿菌菌株(extensivelydrugresistantAcinetobacterbaumannii,XDRAB)，經過法國Bio-merieux公司Vitek32全自動微生物分析系統鑒定。質控菌株鮑曼不動桿菌ATCC19606購自美國ATCC標準菌株數據庫，金黃色葡萄球菌ATCC29213、大腸埃希菌ATCC25922、銅綠假單胞桿菌ATCC27853為本實驗室留存。

1.2 實驗儀器

恒溫培養箱(上海一恒)、生物安全柜、恒溫搖床、酶標儀(SpectraMa190)、熒光定量PCR儀(biorad)；96孔細胞培養板(科茲莫)、6孔細胞培養板(科茲莫)等。

1.3 抗菌藥物

美西林、氨芐西林鈉、美羅培南、亞胺培南、頭孢噻肟、頭孢他定、慶大霉素、阿米卡星、環丙沙星、左氧氟沙星、多西環素、米諾環素、替加環素、氨芐西林舒巴坦、頭孢哌酮舒巴坦、磺胺甲惡唑、多粘菌素B均購自大連美侖生物公司。試劑：維拉帕米(大連美侖生物公司)、奧美拉唑(上海源葉生物)、PAβN、CCCP購自上海皓元生物醫藥科技有限公司。胰酪大豆胨液體培養基(trypticase soy broth,TSB)、CAMHB肉湯培養基購自青島海博生物技術有限公司。酵母提取物、胰蛋白胨、瓊脂(英國OXOID公司)；二甲基亞砜(成都市科龍化工試劑廠)、氯化鈉、無水乙醇、異丙醇(成都市科龍化工試劑廠)。

1.4 實驗方法

1.4.1 最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration,MIC)測定實驗 參照美國臨床實驗室標準化協會(clinical and laboratory standards institute,CLSI) 2019標準采用微量肉湯稀釋法測定浮游狀態下9株XDR AB對17種抗菌藥物的MIC值;參照文獻[6-8]測定生物被膜狀態下的最低抑菌濃度，即在96孔細胞培養板中加入190 μL TSB培養基和OD600為0.1的鮑曼不動桿菌重懸液10 μL，37 ℃孵育24 h，移除浮游菌，加入200 μL PBS洗滌3次，再加入CAMHB肉湯培養基和抗菌藥物的混合培養基，在37 ℃下孵育16～20 h，記錄結果。

1.4.2 外排泵抑制劑工作濃度的確定 PAβN、奧美拉唑、維拉帕米對9 株XDR AB的MIC值均>512 mg/L，CCCP的MIC值為16 mg/L，最終確定PAβN、奧美拉唑、維拉帕米選取128 mg/L，CCCP選取8 mg/L，在該工作濃度下均不影響細菌的生長。

1.4.3 生物被膜形成實驗 結晶紫染色法：9株XDR AB菌株解凍后接種在LB固體培養基中過夜，用0.9%生理鹽水調整其OD600=0.1。然后，接種到96孔細胞培養板，平板在37 ℃靜置培養24 h。用1×PBS清洗3遍去除浮游細菌，靜置30 min晾干96孔板；每孔加入200 μL 0.1%結晶紫，染色15 min。移除結晶紫，無菌PBS輕輕洗3次，靜置30 min使96孔板晾干；在每孔中加入200 μL 95%的乙醇溶液，靜置15 min，使結晶紫完全溶解，測定OD570。

1.4.4 實時定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR) 測定9株XDR AB浮游狀態與生物被膜狀態下外排泵基因adeB、adeG、adeJ的表達情況.以16S rRNA基因作為內參基因，進行RNA提取(高純RNA分離試劑盒，生工生物)和cDNA合成(cDNA合成試劑盒，諾維贊)。使用熒光染料SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(諾維贊)，一式三份測量參與外排泵基因的表達水平。qRT-PCR總反應體積為10 μL反應條件：95 ℃預變性2 min, 95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s共40個循環，融解曲線95 ℃ 5 s，60 ℃ 5 s，95 ℃ 50 s。16S rRNA作內部對照，以標準化每個基因轉錄本的水平，統計學分析采用配對樣本t檢驗。內參基因及外排泵基因引物序列如下(表1)。

表1 qRT-PCR檢測外排泵基因表達引物情況

1.5 統計學方法

2 結果

2.1 17種抗菌藥物對浮游狀態下 9 株XDR AB的 MIC 值

參照CLSI 2019標準， 浮游狀態下9 株 XDRAB除對替加環素、多黏菌素 B敏感外，對包括碳青霉烯類、 β-內酰胺類、氨基糖苷類、氟喹諾酮類、 四環素類等抗菌藥物均耐藥(表2)。

表2 17種抗菌藥物對9株 XDR AB浮游狀態下的 MIC值

2.2 17種抗菌藥物對生物被膜狀態下 9 株XDR AB的 MIC 值

生物被膜狀態下, 9 株XDR AB對 17種抗菌藥物的 MIC進一步增加,其中多黏菌素B的MIC值上升了4～16倍，替加環素的MIC值上升了8～32倍(表3)。

表3 17種抗菌藥物對9株XDR AB生物被膜狀態下的MIC值

2.3 9株XDR AB生物被膜形成前后的MIC值比較

對浮游狀態與生物被膜狀態下 9株XDR AB的MIC50和MIC90進行了比較，除氨芐西林舒巴坦外,抗菌藥物在生物被膜狀態下MIC50和MIC90均呈現不同程度的上升(表4)。

表4 9株XDR AB生物被膜形成前后的MIC值比較(mg/L)

2.4 4種EPIs對XDR AB生物被膜形成的影響

在工作濃度下4種EPIs對XDR AB生物被膜的形成均有不同程度的抑制作用,與對照組(1.39±0.06)相比，PAβN(0.74±0.04)的抑制作用最強，其次分別為CCCP(0.78±0.04)、維拉帕米(0.93±0.10)和奧美拉唑(0.95±0.09)，生物被膜形成的減少量差異有統計學意義(P<0.05)(圖1)。

圖1 4種外排泵抑制劑對XDR AB生物被膜形成的影響

2.5 浮游與生物被膜狀態外XDR AB排泵基因表達結果

qRT-PCR測定9株XDR AB的實驗結果表明，在生物被膜狀態下，3種外排泵基因中除adeG表達量無明顯變化外,adeB和adeJ的表達量分別為(0.95±0.03)、(1.99±0.27),與浮游狀態adeB(0.21±0.01)、adeJ(0.87±0.04)相比差異有統計學意義(P<0.05)(圖2)。

圖2 9株XDR AB的浮游狀態與生物被膜狀態外排泵基因表達情況

3 討論

目前，國內外對XDR AB生物被膜形成前后耐藥性變化與外排泵的關系研究不多。本研究實驗結果顯示，與浮游菌相比較,生物被膜狀態下鮑曼不動桿菌對于抗菌藥物的耐藥性呈倍數增加，與藺飛等[9]的研究結果一致。XDR AB生物被膜狀態下外排泵基因adeB表達水平增強了4倍，adeJ表達水平增強了2倍。本研究應用的4種外排泵抑制劑均能不同程度減少XDR AB生物被膜的形成，以PAβN的抑制效果最明顯，其次是CCCP、維拉帕米和奧美拉唑。有研究[10]表明,細菌的生物被膜形成后，其耐藥性和黏附性進一步增強,使其能夠不可逆地附著于生物或者非生物的表面，表現出相對于浮游菌在結構、基因表型和生化特性的改變[11];而PAβN是一種廣譜的外排泵抑制劑，能夠增加生物被膜狀態下細菌外膜的通透性[12]，使抗菌藥物更容易進入細菌細胞發揮作用[13-15]。在生物被膜細菌中，外排泵抑制劑與外排泵結合發揮作用時，其作用機制主要包括，EPIs可與底物結合在同一位點，發揮競爭性抑制的作用，當外排泵表達時，優先排出EPIs，減少了抗菌藥物的流失；另一方面，EPIs可通過阻礙外排泵的功能起作用。 EPIs還能通過影響生物被膜細菌的 QS系統和毒力基因的表達，減少生物被膜的產生，同時降低細菌毒性[16-18]。外排泵抑制劑通過以上方式影響著生物被膜的形成及細菌的耐藥性，不失為一種減少細菌生物被膜形成與降低細菌耐藥性的有效方式。