蟲草素的抗腫瘤與抗轉移作用的研究進展

崔琳琳,袁 甜,王 洋,李 洋,申光煥

(1.哈爾濱商業大學藥學院,黑龍江哈爾濱 150076; 2.黑龍江省預防與治療老年病藥物研究重點實驗室,黑龍江哈爾濱 150076)

蟲草素最早于1951年被德國科學家Cunningham等人[1]從蛹蟲草發酵菌絲體的培養液分離得到,是由腺苷和脫氧戊糖組成的核苷酸[2],為腺苷類似物(圖1),亦被稱為3′-脫氧核苷(3-deoxyadenosine)。具有抑制mRNA聚腺苷酸化,調節各種細胞過程,抗癌、抗炎、抗氧化劑、抗白血病、抗高血脂、抗肝毒性、抗纖維化和神經保護活性,改善皮膚老化,骨骼肌疲勞抑制,殺蟲,防止缺血再灌注引起的損傷和骨骼保護等藥理作用。近年來文獻多集中在構建蟲草素納米復合材料[3]、腺苷酸脫氨酶(ADA)抑制劑聯用來改善蟲草素在體內半衰期短的問題。

蟲草素抗腫瘤涉及到苷酸活化蛋白激酶(AMPK)、核因子激活的B細胞的κ-輕鏈增強(NF-κB)、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、PI3K/Akt、金屬蛋白酶(MMP)和半胱氨酸蛋白酶(caspase)等信號通路。蟲草素會激活AMPK信號通路,關閉mTOR信號通路,終止蛋白翻譯。蟲草素會抑制蛋白α激酶γ亞基泛素化,抑制蛋白IKBα的磷酸化及降解,抑制NF-κB通路(促進腫瘤轉移),最終抑制MMP-9的表達。MAPK有4個亞族:ERK、P38、JNK、ERK5,蟲草素會激活c-Jun氨基端激酶(c-Jun Nterminal kinase,JNK)蛋白激酶和P38蛋白激酶并誘導Bcl-2家族中的促凋亡蛋白表達誘導細胞凋亡,胱天蛋白酶3(MMP-3)表達會激活多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶(PARP)共濟失調毛細血管擴張突變基因蛋白(ataxia telangiectasia mutated,ATM),啟動PARP蛋白促凋亡作用。PI3K/Akt信號通路負調節,最終抑制MMP-9的表達。蟲草素會抑制基質金屬蛋白酶(MMP)的表達,從而降低腫瘤細胞的侵襲。

圖1 腺苷及蟲草素的結構式Fig.1 Structural formula of adenosine and cordycepin

1 蟲草素抑制腫瘤生長繁殖

1.1 誘導腫瘤細胞凋亡

圖2 蟲草素誘導腫瘤細胞凋亡Fig.2 Cordycepin induces tumor cell apoptosis

蟲草素抗腫瘤機制可以分為直接和間接兩種方式[4]來誘導腫瘤細胞自噬或凋亡。蟲草素可以通過激活死亡受體3(DR3)、腺苷G蛋白偶聯受體(GPCRs)、腫瘤p53抑制因子、促凋亡蛋白(Bax和caspases),抑制抗凋亡蛋白(BCL-2和BCL-xL)和PI3K/Akt來誘導腫瘤細胞凋亡;還可以通過介導c-FLIP L(凋亡調節因子)、PI3K/AKT/mTOR途徑、AMPK/mTOR通路來誘導細胞自噬。具體機制如(圖2)。Hsu等[5]研究證實了蟲草素通過caspase途徑(選擇切割蛋白質)來誘導小鼠口腔癌(4NAOC-1)細胞凋亡。Wang等[6]通過qRT-PCR和Western blot證實了蟲草素介導促凋亡激活蛋白caspase-3和抑制抗凋亡蛋白(Bcl-2)的表達來誘導細胞凋亡。Yu等[7]研究蟲草素誘導人非小細胞肺癌細胞(NSCLC)的凋亡與自噬作用機制,發現蟲草素不僅可以介導c-FLIP L(凋亡調節因子)來促進caspase-8誘導細胞凋亡,還可以抑制肺癌中的mTOR(哺乳動物雷帕霉素靶蛋白)信號通路來促使細胞自噬,加快誘導癌細胞凋亡進程。Shao等[8]用蟲草素治療HepG2細胞分別24、48、72和96 h的IC50值是735±3.67、497.5±2.49、385±1.93和307.5±1.54 mol/L,發現蟲草素誘導HepG2(人肝癌細胞)凋亡有兩條途徑:分別是FADD(死亡區域蛋白)和Bcl-2,而FADD途徑也可以促使Bcl-2(促凋亡蛋白)家族蛋白調節,使線粒體膜通透性增加,導致細胞色素c的釋放,從而誘導HepG2凋亡。Zeng等[9]發現蟲草素(20、40 mg/kg)可改善亞硝基二乙胺(NDEA)刺激引起的肝癌轉移酶活性并通過Western blot證實蟲草素通過經典的PI3K/AKT/mTOR途徑來治療NDEA誘導的肝癌(HCC)凋亡。Hwang等人[10]發現蟲草素通過抑制c-FLIPL表達,激活(絲裂原活化蛋白激酶)MKK7-JNK信號通路來觸發腎癌細胞的凋亡機制。Huang等[11]發現蟲草素可以激活p38來誘導切割caspase-3和PARP(DNA修復酶)活化，使P53依賴ROS(活性氧)累積,選擇性誘導MA-10小鼠間質瘤細胞凋亡;還可以抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路,使細胞自噬。該文獻弄清了中等濃度以下的蟲草素不會導致初級小鼠間質細胞死亡,蟲草素在MA-10小鼠間質瘤細胞的作用通路可能是未來研究蟲草素作用機制的典范。鄭慶委等[12]發現蟲草素通過AMPK/mTOR通路誘導細胞自噬,促使Tca-8113(人舌癌細胞)凋亡。綜合以上可知,蟲草素在誘導癌細胞凋亡過程中caspase-3起著關鍵性的作用,蟲草素還可以誘導B細胞淋巴瘤,胰腺癌細胞,前列腺癌細胞凋亡。目前對MAPK通路級聯反應的一些上游調節激酶和下游作用底物等尚未完全清楚,例如P38蛋白激酶該位點活化機制尚不清楚,因此需要學者進行更深入的研究。

1.2 細胞周期阻滯

蟲草素可以促進PI3K/Akt、p53等通路磷酸化,造成腫瘤細胞周期停滯在G1、S和M、G2/M期,從而抑制腫瘤的發生與發展,如(圖3)。Cao等[13]研究蟲草素對人膀胱癌(T24)細胞存活的影響,對培養的T24細胞給予蟲草素的劑量為0、10、30和90 μg/mL,對細胞進行分析,發現蟲草素呈劑量依賴性地降低膀胱癌細胞的存活率,G1、S 和M 期的細胞存活數量減少。通過激活A3腺苷受體使Akt(細胞生存生長傳導途徑,過度激增可促進癌細胞繁殖)通路失活,誘導膀胱癌細胞(T24細胞)凋亡。Chen等[14]發現60 μmol/L的蟲草素使C6膠質細胞存活率下降到65%,發現60、80 μmol/L的蟲草素可以誘導p53的磷酸化和表達,以及下游的caspase-7和PARP裂解來誘導細胞凋亡,為靶向研究A2AR(腺苷A2aR受體)或p53(抑癌基因)治療藥物提供了依據。廖園洪[15]闡明了蟲草素激活ATR-Chk2-Cdc25A信號通路,促進Cdc25A的降解,使得CDK2不能被去磷酸化激活,最終造成S期的阻滯,發揮抗急性髓細胞白血病(AML)作用;并從Sesterstatin 4/5(二倍半萜化合物)類似物及中間體中篩選出能夠有效抑制白血病細胞株HL-60 生長的海洋化合物,這為海洋化合物的開發提供了契機與先河。Zhang等[16]發現蟲草素阻斷了人胰腺癌細胞(MIApaca-2和capan-1)周期蛋白A的合成,DNA復制失敗,導致S期細胞周期停滯。有節律的蟲草素治療會抑制OSCC(人口腔鱗狀細胞癌細胞)中的EMT(上皮細胞-間充質轉化)致使細胞周期停滯。Su等[17]進一步發現蟲草素聯合放療(RT)可降低p-ATM(共濟失調-毛細血管擴張癥突變)和p-CHK2(檢查點激酶2)表達,誘導使G2/M期阻滯。Lee等[18]發現,200 μmol/L蟲草素可以激活人膀胱癌細胞中c-Jun 氨基末端激酶來誘導p21WAF1(周期依賴性激酶抑制因子)表達上調,P53通路減弱,使細胞周期停滯在G2/M期。Nasser等[19]通過流式細胞術方法,分別用蟲草素的濃度為0、20、40、80 μmol/L處理胃癌SGC7901細胞系24 h,S期百分比上升至45.29±2.13、53.315±2.54、71.092±2.24和71.203±3.1,使細胞停滯在S期,其機制是蟲草素促進PI3K/Akt磷酸化生成ROS使人胃癌(SGC-7901)細胞停滯。綜上所述,蟲草素可以通過線粒體介導的內源性半胱天冬酶途徑誘導癌細胞周期阻滯,也可以通過多途徑結合阻滯腫瘤細胞周期[20]。

圖3 蟲草素誘導腫瘤細胞周期阻滯Fig.3 Cordycepin-induced tumor cell cycle arrest

1.3 腫瘤干細胞的抗性

圖4 蟲草素抗腫瘤轉移與侵襲Fig.4 Cordycepin resists tumor metastasis and invasion

腫瘤干細胞本質上是腫瘤細胞群自我更新,無限增殖保持旺盛生命力的元兇。Li等[21]通過建立閉合性股骨骨折的大鼠模型,使用骨髓源性MSC(BMMSC)進行治療,利用茜素紅S(ARS)染色和成骨標記基因的表達來評估蟲草素對體外BMMSC的影響,發現10 μg/mL蟲草素可以通過低氧反應途徑來促進成骨骨髓間充質干細胞(MSCs)愈合,并提出蟲草素低氧反應途徑可能成為骨折的潛在治療途徑。Yang等[22]用100 μmol/L蟲草素處理卵巢癌細胞(SKOV-3)48 h,發現Akt是腫瘤細胞存活和凋亡的關節點,p-JNK是SKOV-3細胞凋亡關鍵的關鍵介質,明確了蟲草抑制CCL5(趨化因子)介導Akt/NF-kB磷酸化來抑制SKOV-3(人體細胞卵巢癌細胞)的遷移。Wnts是成年哺乳動物中大多數組織干細胞的關鍵驅動因素和調節因子,核心Wnt/β-連環蛋白信號通路激活是CSC生存關鍵[23],Ko等[24]用50～200 μmol/L的蟲草素處理懸浮液癌細胞4～24 h,發現蟲草素呈劑量依賴性降低β-catenin的表達,蟲草素可能通過PI3K/AKT依賴機制調控GSK-3β/β-catenin,從而抑制人體中的LSCs(白血病干細胞)的存活或更新,為蟲草素與其他藥物協同根除LSCs來治療白血病提供了新策略。

2 蟲草素對腫瘤微環境的調控作用

高侵襲的腫瘤細胞不一定具有高轉移能力,但是高侵襲是腫瘤細胞高轉移的必要條件。癌癥轉移是癌癥死亡的主要原因,因此針對腫瘤生態微環境治療癌癥轉移是目前新興的一種方法[25]。

2.1 抑制腫瘤細胞的遷移和侵襲

腫瘤細胞的侵襲轉移是一個多基因參與、多因素影響的復雜過程,蟲草素通過調控(絲裂原活化蛋白激酶)MAPK、NF-κB、PI3K/Akt、P-Akt和P-Fak等信號轉導通路干預MMP(線粒體電位)表達,上調內源性MMP-3和caspase-9的表達,阻斷EMT(上皮細胞-間充質轉化),調控E-cadherin/N-cadherin蛋白平衡,從而抑制腫瘤細胞的遷移與侵襲,具體如(圖4)。王多等[26]證明了蟲草素通過(絲裂原活化蛋白激酶)MAPK、NF-κB和PI3K/Akt等信號轉導通路干預MMP(線粒體電位)表達,從而抑制腫瘤細胞的侵襲和轉移。劉特思等[27]通過實驗得出蟲草素可以抑制EMT(上皮細胞-間充質轉化)和靶向DEK蛋白調控Akt和Erkl/2信號通路來抑制膽管癌細胞遷移。Kan等人[28]通過體外實驗研究發現,蟲草素可以上調內源性MMP-3和Caspase-9的表達,逆轉DRGn(髓背根神經元神經節)的神經毒性作用,證實了蟲草素(CDC)50 μmol/L對利多卡因誘導DRGNs(脊髓背根神經元神經節)毒性起到挽救作用,MMP-3很可能是蟲草素直接下游底物,CDC/MMP-3信號級聯可能是一種降低神經毒性的方法。最新Lee等人[29]發現冬蟲夏草中(富含蟲草素)的WIB-801C抑制MMP-9的表達和活性,減輕了BSCB(血-脊髓屏障)在血細胞浸潤后的破壞,抑制損傷后小膠質細胞對p38MAPK的激活,改善了脊髓損傷后的細胞調亡，為以后WIB-801C作為脊髓損傷后的治療藥物奠定基礎。Choi等[30]發現蟲草素在(0、5、10、15、20和25 μg/mL)呈劑量依賴性的抑制PC-3(人前列腺癌細胞)的運動和侵襲。蟲草素在調控緊密連接(TJ)的基礎上,抑制基質金屬蛋白酶MMP-2和MMP-9的表達和活性,還同時提高了(金屬蛋白酶組織抑制劑)TIMP-1和TIMP-2的水平。在腫瘤轉移過程中金屬蛋白酶MMP-2和MMP-9發揮主要作用,這為靶向治療腫瘤研發新藥奠定基礎。

2.2 腫瘤轉移阻滯

Hueng等[31]在傷口愈合實驗中發現蟲草素用80～100 μmol/L處理人膠質母細胞瘤細胞株(U87MG),60～80 μmol/L處理人膠質母細胞瘤細胞株(LN229),24 h后,傷口面積較對照組明顯增加,蟲草素可以降低整合素α1、AKT、P-FAK、白細胞介導的蛋白表達,從而抑制人膠質母細胞瘤細胞株U8MG7和LN229的遷移,蟲草素介導的P-Akt、P-Fak,這些靶點可能是今后抑制人膠質母細胞瘤細胞遷移的有效靶點[32]。Wang等[33]發現蟲草素通過調節TGF-β(轉化生長因子-β)來阻斷EMT(上皮細胞-間充質轉化),達到抑制卵巢癌細胞的遷移,該實驗解決了蟲草素在卵巢癌細胞中癌癥轉移和線粒體活性之間關聯不清楚的問題。Yang等[34]實驗表明10 μg/mL蟲草素在孵育Caki-1(腎癌)細胞24和48可顯著細胞的遷移,通過調節microRNA-21/PI3k/AKT通路,阻滯腎癌細胞遷移。蟲草素通過溶酶體降解和蛋白磷酸酶活化來抑制人膠質母細胞瘤細胞的遷移,多機制聯合抑制黑色素瘤的轉移。

2.3 癌細胞與間質干細胞(MSCs)的粘附

間充質干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是有具有多向分化潛能的原始細胞,但在炎癥[35-36]微環境中受到抑制,腫瘤壞死因子(TNF-a)是抑制成骨細胞分化成熟的主要通路,間充質干細胞可以增強腫瘤細胞對化療藥物的抵抗[37-38]。劉建兵等[39]通過體外實驗初步探討蟲草素呈濃度時間依賴性的激活p53、caspase-3信號通路與逆轉腫瘤細胞EMT(上皮-間質轉化),E-cadherin和N-cadherin蛋白分別是上皮表型和間質表型的標志分子,E-cadherin表達降低,N-cadherin表達升高是細胞EMT轉化的一個重要機制,蟲草素通過調控E-cadherin/N-cadherin蛋白的平衡來抑制胰腺癌干細胞的轉移,這一發現為胰島素靶向胰腺癌干細胞提供了理論基礎,具體E-cadherin和N-cadherin的相關機制和信號分子還需要進一步摸索。目前,大量基因組學和流行病學表明炎癥在腫瘤發展過程中扮演至關重要的角色[40-41]。楊建平等[42]發現蟲草素直接減少IkBa磷酸化,抑制TNF-α來激活NF-kB信號通路,因此得出蟲草素除了抑制TNF-α減少炎癥,還促進人脂肪干細胞成骨分化。Liang等[43]用50 μmol/L蟲草素處理骨髓白血病U937和K562細胞24 h破壞了白血病與間充質干細胞MSCs的聯系,下調白血病中的N-鈣粘蛋白和骨髓間充質干細胞中的VCAM-1(血管細胞粘附因子),抑制白血病細胞與骨髓間充質干細胞的粘附。Su等[44]發現有節律的蟲草素給藥上調了E-鈣粘蛋白的表達,下調了N-鈣粘蛋白的表達,抑制了上皮間充質轉換(EMT)可以有效地控制腫瘤的發展。

3 結論與展望

筆者經查閱國內外文獻,發現蟲草素抗腫瘤機制[45]涉及到多基因[46-48]表達調控,具體可歸結為以下幾種原因[49]:蟲草素磷酸化與ATP(三磷酸腺苷)結構高度相似,酶會錯誤地將蟲草素識別為腺苷,導致嘌呤代謝異常,抑制腫瘤細胞DNA的合成[50-51]；蟲草素取代ATP,抑制靶向蛋白激酶；蟲草素直接激活蛋白激酶,例如AMPK,AMP/ATP比率增加；PolyA(聚合酶)錯誤識別為ATP,中斷mRNA聚腺苷酸化；作為配體抑制RNA延伸和轉錄。就國內外進展而言:目前國外在研究蟲草素抗腫瘤[52-53]Akt/p38、NF-KB、AMPK上下游靶點比較成熟,而國內剛剛起步;國外在神經修復,脂肪分化等方面已有新的突破,國內多集中在肝癌肺癌方面;國外在蟲草素抗腫瘤[54]方面已進入到臨床試用階段,國內多集中在提取培養[55-57]這方面。面對這一情形,我們可采取的措施有:就蟲草素快代謝這方面,可以通過結構改造,材料包埋技術[58]延長其在體內作用時間[59-60];就作用機制這方面,我們可以通過計算機網絡模擬結合代謝組學[61]整體挖掘蟲草素的調控機制。我國應該積極與國際接軌,結合現代技術反復驗證蟲草素抗病機理[62-63],加快研究其作用機制過程,將蟲草素開發利用到最大限度。