紅松松塔抗癌成分、存在問題及對策的研究進展

辛 超,張艷東,王振宇

(哈爾濱工業大學化工與化學學院,黑龍江哈爾濱 150090)

癌癥嚴重地危害著人類健康,是2017年全球第二大致死因素[1],其治療方式有手術、化療、放療、中藥治療或者多種方法聯合治療等,其中,化療因其可發揮全身效果,被作為腫瘤治療的首選。然而,高效低毒藥物的缺乏極大地限制了該療法的發展。解決這一問題的一條有效途徑是從天然產物中發現新型化合物,并開發適合其發揮藥效的給藥方式。紅松(Pinuskoraiensis),又名韓松、果松、海松、朝鮮松,廣泛分布于我國東北部、日本、朝鮮、韓國等[2]。紅松松子是一種具有多種保健功能的食品,表現出良好的護肝、降血脂、降血壓等生物活性,而收取松子后的多數松塔被當作燃料,甚至丟棄,造成了較大的浪費[3]。近年來,研究者發現,紅松松塔提取物呈現出較好的抗腫瘤效果,其抗癌功效物質基礎呈現出了多樣性和復雜性。本文對近幾年針對紅松松塔抗癌成分的研究進行概述,提出了存在問題及對策。

1 紅松松塔抗癌化學成分

1.1 多酚

多酚類化合物是指化學結構中存在一個或多個苯環且苯環上有一個或多個酚羥基的一類化合物,可分為黃酮類及非黃酮類多酚[4-5]。黃酮類多酚是由兩個中間通過雜環吡喃酮C環連接苯環組成;非黃酮類多酚是由復雜的分子如苯甲酸、羥基肉桂酸酯、芪類、沒食子單寧、木質素、棓單寧組成。多酚類化合物廣泛的存在于水果、茶、堅果、蔬菜、咖啡、啤酒中[6-10],存在多種生理功能如抗氧化、抗感染、抗癌、神經保護、抗炎等[11]。

紅松松塔60%乙醇(V/V)提取物,經過大孔樹脂吸附、63%乙醇(V/V)洗脫可以獲得的主要成分為兒茶素、甲基槲皮素、鄰香蘭素、木犀草素和冠狀酸,多酚純度為27.93%(M/M)的提取物,MTT實驗表明該提取物可壓制多種腫瘤細胞的增殖,尤其可在較低EC50下抑制LOVO細胞的活力[12]。吸附紅松松塔醇提物的大孔樹脂不同濃度的乙醇(20%,40%,60%,V/V)洗脫物,多酚含量差異較大,其中40%乙醇洗脫物,多酚含量高達57.25%(M/M),細胞活力實驗表明此部分(PPP-40)對LOVO細胞的抑制作用最強,其EC50低至0.21 mg/mL。PPP-40體外抗腫瘤機制研究表明,LOVO細胞經該多酚處理后,同時表現出線粒體及外源性凋亡的特點,ROS活性氧、細胞色素C水平升高、ATP與線粒體膜電位降低、DNA損傷出現、caspase 3,8,9激活等[13]。肉瘤S180荷瘤小鼠經過PPP-40灌胃給藥后,腫瘤生長可被有效地抑制,分子機制可能涉及多種;通過改變Bax、Bcl-2等蛋白表達量并激活caspase 3誘導線粒體凋亡;提高超氧化物歧化酶,谷胱甘肽過氧化物酶活性及谷胱甘肽水平,進而增加胞內抗氧化能力;促進脾細胞的增殖,抑制其凋亡并增加脾T淋巴細胞及相關細胞因子產生,最終提高荷瘤小鼠免疫力[14-15]。紅松多酚抗腫瘤呈現出多靶點、多通路的特點,可有效地抑制腫瘤多重耐藥(MDR)的發生,保證化療效果[16],此外,不同于多數化療藥物,該多酚表可同時殺滅腫瘤細胞和提高機體免疫力,可能會是新型低毒高效化療藥的來源,值得深入研究。

1.2 萜類

紅松松塔中的萜類化合物主要存在于揮發油等脂溶性部位中,主要由單帖、倍半萜、二萜及萜類的含氧衍生物組成。水蒸餾法提取的紅松松塔精油主要由α蒎烯、檸檬烯、β蒎烯等揮發性單萜構成,可在較低濃度通過激活HIPPO/YAP通路抑制胃癌細胞MGC-803細胞增殖[17]。紅松松塔中非揮發型抗腫瘤萜類化合物主要為松香烷類二萜化合物,研究發現,不同于水提物,紅松松塔95%乙醇、乙酸乙酯、氯仿萃取物均能高效地抑制多種癌細胞系生長,其中氯仿萃取物尤甚,經多種分離純化手段后,得到兩種單體化合物——脫氫樅酸與紅松二萜酸A,后者對結腸癌細胞HCT-8的IC50低至10.25 μg/mL[18-19]。此外,Lee等[20-21]的研究表明紅松松塔水提物能不依賴P53狀態,通過激活caspase 3誘導肺癌的四種細胞系A549、H1264、H1299、Calu-6凋亡,IC50為 0.62～1.73 mg/mL,其主要成分可能為萜類化合物與酚酸,其中,7α,15-二羥基脫氫樅酸可下調VEGF,p-Akt和p-ERK信號通路抑制人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)的血管生成。

1.3 多糖

松塔多糖可分為酸性多糖(木質素與多糖的復合物)與中性多糖,其提取方式略存差異。中性多糖粗提物的提取通常包括醇或醚除脂、熱水浸提、離心或過濾、提取液濃縮、乙醇分級沉淀、離心干燥等過程[22-23],而酸性多糖的提取涉及醇或醚除脂、水提(或不經水提)、堿液浸提、酸化、提取液濃縮、乙醇分級沉淀、離心干燥等步驟[24]。研究發現除脂后的紅松松塔多糖含量高達38%,而熱水浸提法提取多糖的得率為1.52%[22-23],膜分離技術表明紅松松塔多糖由分子量分別為6～10 kDa(17.1%)、10～50 kDa(3.2%)、50～100 kDa(70.2%)、>100 kDa(9.5%)的多糖組成[24]。紅松松塔酸性多糖對胃腸道腫瘤有一定的抑制作用,并可誘導人骨髓白血病細胞分化為成熟的巨噬細胞[25],通過激活capsase家族蛋白,誘導人乳腺癌細胞MCF-7的凋亡[26]。Zou等[27]通過醇沉方法將紅松松塔多糖分成五部分PKP A-E,并研究了它們對HepG2細胞的作用,發現PKP-A(6881.6 kDa)、PKP-E(5120.1 kDa)抗腫瘤效果尤為顯著,作者認為單糖組成與分子量是影響多糖組分活性的最重要因素。

2 存在問題

紅松松塔可能是新型抗癌化合物的廉價來源之一,但其抗癌功效物質基礎存在一些不足,需要考慮。首先,類似于許多天然產物,紅松松塔中的抗癌成分效果不足,如何增效是急需解決的問題;其次,一些化合物如多酚在生理條件下不穩定,易與體內氧化性物質發生反應而失活[28];再次,多糖分子量大,難以被細胞直接攝入發揮作用;最后,活性部位可能是多單體協同作用,合用的抗癌效果優于其某一單體[29],然而適合多單體又高效的體內遞送系統較少。解決以上問題,可從兩方面入手:通過化學修飾改變化合物自身結構,實現增效目的;選擇合適的活性成分遞送系統,搭載多組分,彌補活性成分低效、穩定性差、生物利用度低的缺陷。

3 對策

3.1 化學修飾

萜類化合物化學穩定性好、易于修飾,因此,改變其自身結構實現增效是較為理想的方法。松香烷型二萜化合物是紅松松塔中一類重要的抗腫瘤物質,其結構中的三環二萜結構是主要的功能基團[30],且環上取代基的位置、種類亦可影響其活性[31]。近年來研究顯示，通過化學反應在脫氫樅酸的三環結構上引入含氮和(或)芳香基團，如硫脲、呋喃、酰胺、咪唑萘和磺酰脲等，可顯著提高化合物對腫瘤細胞的毒性[32-34],表明引入正電性及疏水性取代基是增強此類先導化合物抗腫瘤活性的有效手段。目前松香烷二萜類化合物化學修飾多數是針對其三環上的取代基,可控性較差,且步驟繁瑣、試劑不穩定、反應條件苛刻,限制了此類方法在紅松松塔二萜化合物的改性運用,但可提供一定的理論參考。松香烷型二萜化合物中的三環結構兼有抗腫瘤活性與強疏水性,多個環結構的“疊加”可能是增強藥效重要途徑[35-36]。鑒于羧基存在于大部分的紅松松塔二萜化合物中,縮醛結構可通過酰胺反應被修飾到環結構,并在氫離子的參與下發生水解-縮合反應生成三環二萜結構的寡聚體(圖1),從而達到活性基團“相加”的目的。該合成路線簡單、反應條件溫和,控制反應2中的含水量,便可有效控制聚合度,按需合成[37]。

圖1 相關化合物的合成路線Fig.1 Synthetic pathway to related compounds

3.2 活性成分的納米遞送

不同于萜類化合物,多糖與多酚化學可修飾性較差,化學改性并非為改進紅松松塔多酚與多糖活性的較好選擇,但可通過兩類物質遞送系統的納米化提高其活性。

納米遞送系統是指以納米材料為載體,通過非化學鍵如氫鍵、范德華力、π-π堆積等或化學鍵如共價鍵、金屬鍵等或物理形式如包裹、包埋等與具有腫瘤治療作用的兩種或多種活性成分形成的納米遞送“共同體”。此“共同體”區別于簡單成分的物理疊加,是一種“同呼吸,共命運”系統,活性物質之間或與納米載體之間往往具有協同作用,可在腫瘤治療中起到更好的效果,且納米遞送系統可使劑量得到準確地控制,避免多種成分簡單混合引起的劑量不確定性[38]。此外,該系統能高效地增強活性成分的血清穩定性及體內控釋性,減少非特異性細胞的攝取,延長其體內半衰期[39]。更重要的是,此遞送系統可改善化療藥物缺乏靶向性、易觸發腫瘤細胞MDR的缺陷。

多酚類化合物可通過多靶點抗腫瘤且對正常細胞的毒性較弱,但較差的化學穩定性與較弱的活性限制了它們的應用。近年來,研究者利用多酚能通過非共價鍵與蛋白質可逆性結合的性質[40],將蛋白藥物赫賽汀或蜂毒肽與兒茶素型多酚組裝為粒徑100 nm左右的納米顆粒,用于小鼠腫瘤的治療,結果表明多酚可短暫屏蔽但不損害藥物蛋白的活性,提高藥物半衰期,靶向瘤部釋藥；更重要的是,多酚與主藥協同抗腫瘤,呈現出增效減毒作用[41-42]。此外,多酚因結構中存在芳香環可通過π-π堆積力、疏水力等作用力可逆結合阿霉素,自組裝為高載藥量、強穩定性、靶向控釋的納米粒子,該粒子抗腫瘤作用強于多酚與阿霉素,多酚的加入不僅減弱了阿霉素的心臟毒性,而且有效逆轉了腫瘤細胞的耐藥性,提高預后[43-44]。具有抗腫瘤活性的多糖,分子量通常較大,難以直接被細胞攝入發揮作用[45],故效果不佳。為了打破這種局限,研究者利用多糖易絡合金屬的性質,將其與抗腫瘤藥物順鉑及靶向劑葉酸組裝為粒徑約為200 nm左右的配合物,用于小鼠腫瘤的治療,結果顯示配合物中的順鉑與多糖發揮了協同抗腫瘤作用,療效顯著,且高生物利用度的多糖可顯著提高患病小鼠的機體免疫力,減輕順鉑對正常細胞的損傷,延長荷瘤小鼠的生存期[45-46]。簡而言之,多糖或多酚與主流化療藥納米自組裝實現了活性成分與藥之間的優勢互補,并改善了各組分的不足。在這些“藥輔合一”的納米粒子中,多酚與多糖既作為粒子載體又充當了活性成分,與藥物組成一個整體發揮作用,減毒增效。因此,活性成分與抗腫瘤藥物納米化聯用是改善紅松松塔多酚、多糖活性不足的重要手段之一。

如前文所述,紅松松塔的某些抗腫瘤活性部位,可能是多單體協作,整體發揮作用,因此,想要通過改變遞送方式提高其活性,就必須選擇適合搭載多組分的遞送系統。近年的研究表明水凝膠與包裹型納米粒是較理想的候選者。水凝膠是一類由天然或合成高分子構成的吸水性強的膨脹網絡,適合充當水溶性成分的載體,具有生物相容性好、載藥量大的特點,且可實現多組分如中藥提取物的同步遞送及控釋[47]。水凝膠中眾多親水基團的存在使其不易包裹疏水性成分,因此,該載體難以滿足某些強疏水性物質的遞送需求。此外,水凝膠通常作為膜劑“貼敷”使用,不適合作為注射或口服劑型,存在一定的局限性。包裹型納米粒,顧名思義就是使載體材料形成空腔用于裝載活性組分,適合裝載多種活性物質,且能通過被動靶向或主動靶向將各組分較準確地遞送到病變部位,提高療效,降低副作用。常見的載體材料有脂質體與PLGA。Wang等[48]制備了粒徑為94.3 nm、包封率為61.4 wt%的黃芩70%乙醇提取物的脂質體,考察了它的皮膚抗炎性,結果顯示,區別于未包裹提取物,該納米粒能高效地滲透到人成纖維細胞中,產生明顯的抗炎作用。PLGA是一種FDA批準用于臨床的醫用高分子材料,具有生物相容性高、體內易降解的特點[49]。研究者制備了以PLGA為載體,以商陸、鉤吻、肉桂皮、薰衣草等提取物(醇提或水提物)為活性組分的包裹型納米粒子,并探究相關納米粒在抗腫瘤、抗菌、抗衰老等方面應用,發現PLGA包裹可有效規避游離植物提取物生物利用度低、藥效與靶向性差、副作用大的缺點[50-53]。基于以上實例,通過水凝膠與包裹型納米粒遞送紅松松塔活性部位是增效的合適之選。

含多種單體的活性成分能通過復雜多樣的機制起效,避免耐藥,但目前適合遞送多組分的納米系統較少,主要是因為單體之間的化學性質往往差別較大,而能同時與各種化合物產生非共價鍵作用力的載體缺乏。最近,多種適合遞送多級藥物的納米載體被提出,其中,天然黑色素應用前景頗佳。黑色素廣泛存在于生物體內,由吲哚衍生物聚合而成,主要分為真黑色素與脫黑色素,前者構成單體為5,6-二羥基吲哚(DHI)和5,6-二羥基吲哚-2-羧酸(DHICA),而后者為苯并噻嗪和苯并噻唑[54],其自身及其降解產物無毒[55]。天然黑色素表面具有眾多的活性位點如羧基、氨基、鄰醌、兒茶酚結構,化學可修飾性強,能與多種化合物結合[56]并可通過π-π堆積、疏水力、氫鍵等非共價鍵吸附不飽和鍵多或疏水性強的化合物[56-57]。鑒于紅松松塔中的活性物質如兒茶素型多酚與松香烷型萜類化合物中雙鍵及疏水基團較多,天然黑色素可能是遞送紅松松塔相關活性物質的理想載體,當然,進一步的驗證實驗是必不可少的。

總的來說,解決紅松松塔抗癌成分中存在的問題可從活性成分“自身”與“外界”兩方面著手,化學修飾較適合松香烷類二萜化合物,而對多糖與多酚來講,納米遞送或許是理想的選擇。

4 結論與展望

紅松是我國東北地區重要的松科植物,資源十分豐富,紅松松塔是具有抗腫瘤藥效的物質,研究表明其抗癌化學成分可能為多酚、萜類、多糖類化合物,然而,準確藥效物質基礎尚未闡明,因此采用多種分離純化手段結合活性篩選,探明相關化合物是后續其它研究的基礎。類似于眾多天然活性成分,松塔的抗癌成分雖優勢明顯,但不足的活性、較差的穩定性與生物利用度等缺點限制了它們的利用。為此,本文針對松塔抗癌活性成分的自身結構特點,提出了兩種對策即化學修飾與納米遞送,區別于化學方法,納米遞送操作簡單、靈活可控且可實現多組分遞送,有望成為一條彌補松塔抗癌成分不足的有效途徑。天然成分納米遞送系統開發的關鍵是尋找低毒、智能化、載藥量大、可搭載多組分的新型載體材料,遺憾的是,這類材料目前并不多,主要有水凝膠、脂質、PLGA、蛋白多肽等。天然黑色素作為一種神秘的生物大分子,可通過疏水作用、靜電力、π-π堆積等作用力與多類化合物產生聯系,化學可修飾性強,無毒易降解,天然來源廣,可能是一類適合搭載松塔抗腫瘤成分理想載體材料,但此類研究寥寥無幾。綜上,實現紅松松塔抗腫瘤活性物質的利用,既要探尋準確的活性化合物,又要借助其它方法實現增效減毒的目的,可謂任重而道遠。