花旗參茶對(duì)小鼠免疫功能的影響

李雅琦,陳斯琪,余孝云,尚 強(qiáng),3,伍 彪,聶 克,*

(1.廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院,廣東廣州 510006; 2.健康藥業(yè)(中國(guó))有限公司,廣東珠海 519090; 3.國(guó)家中藥現(xiàn)代化工程技術(shù)研究中心,廣東珠海 519090)

西洋參又名花旗參,為五加科植物西洋參(PanaxquinquefoliumL.)的干燥根,具有補(bǔ)氣養(yǎng)陰、清熱生津等功效,臨床用于治療氣虛陰虧、虛熱煩倦、咳喘痰血、內(nèi)熱消渴、口燥咽干等癥[1-2]。西洋參作為藥食兩用的中藥材,其飲片常被用來(lái)泡水當(dāng)茶飲用,以達(dá)到養(yǎng)生保健等目的。

花旗參茶是用西洋參飲片經(jīng)現(xiàn)代工藝提取后制成的顆粒劑,與飲片泡水服用相比,具有有效成分利用率高、便于攜帶、即沖即飲等優(yōu)點(diǎn)。前期研究發(fā)現(xiàn)[3],花旗參茶具有較好的抗氧化活性,可保護(hù)乙醇誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷。為進(jìn)一步闡明花旗參茶營(yíng)養(yǎng)與保健功能的作用機(jī)制,本文采用原國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局《增強(qiáng)免疫力功能評(píng)價(jià)方法(征求意見稿)》中規(guī)定的正常小鼠實(shí)驗(yàn)方案[4],觀察了花旗參茶對(duì)小鼠免疫功能的影響,并與西洋參飲片泡水服用對(duì)免疫功能的影響進(jìn)行了比較。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作為一門新興學(xué)科,因其整體性和系統(tǒng)性的分析特點(diǎn)與中醫(yī)藥防治疾病的整體觀相吻合[5],近年來(lái)被廣泛應(yīng)用于闡明中藥的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)、配伍規(guī)律、作用機(jī)制等研究[6-7]。本文同時(shí)利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法進(jìn)一步探究了花旗參茶的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

SPF級(jí)BALB/c小鼠 300只,雄性,16～18 g,購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(粵)2018-0002;花旗參茶、西洋參飲片 健康藥業(yè)(中國(guó))有限公司;刀豆蛋白(Concanavalin A,ConA) 美國(guó)sigma公司;2-巰基乙醇 美國(guó)Gibco公司;新生牛血清 浙江天杭生物科技股份有限公司;2,4-二硝基氟苯(1-fluoro-2,4-dinitrobenzene,DNFB) 上海麥克林生物科技有限公司;印度墨汁 大連美侖生物;羧酸基修飾熒光微球 美國(guó)Invitrogen公司;無(wú)菌脫纖維綿羊血 北京索萊寶科技有限公司;都氏試劑 上海羽朵生物科技有限公司;SA緩沖液 北京雷根生物技術(shù)有限公司;乳酸脫氫酶細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒和MTT 碧云天生物技術(shù)有限公司;YAC-1小鼠淋巴瘤細(xì)胞 中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。

CLM-170B-8-NF型CO2培養(yǎng)箱 新加坡Esco公司;Eppendorf 5811型高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司;UV-2310 II型紫外可見分光光度計(jì) 上海天美科學(xué)儀器有限公司;CytoFlex流式細(xì)胞儀 澳大利亞Beckman Coulter公司;CKX41型倒置相差顯微鏡 日本奧林巴斯株式會(huì)社。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 西洋參飲片泡水樣品凍干粉的制備 參考文獻(xiàn)[3],取西洋參飲片200 g,加適量沸水浸泡3次,每次5 min,合并三次浸泡液,過(guò)濾濃縮,冷凍干燥,得凍干粉40 g。

1.2.2 動(dòng)物分組與給藥 小鼠分5批飼養(yǎng),每批60只,分別用于:①遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng);②小鼠碳廓清實(shí)驗(yàn);③小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬熒光微球?qū)嶒?yàn);④ConA誘導(dǎo)的小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化和NK細(xì)胞活性測(cè)定實(shí)驗(yàn);⑤抗體生成細(xì)胞檢測(cè)和半數(shù)溶血值HC50測(cè)定實(shí)驗(yàn)。小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周,隨機(jī)分為5組:陰性對(duì)照組、花旗參茶低、中、高劑量組和西洋參飲片泡水組,每組12只,各組分別灌胃給以蒸餾水、花旗參茶1.5、3、6 g/kg和泡水凍干粉0.1 g/kg(給藥劑量換算方法同文獻(xiàn)[3],成人體重以60 kg計(jì),參茶成人每日推薦用量為9 g,則人的用量為0.15 g/kg體重,依據(jù)藥效研究中人與小鼠給藥劑量的換算方法[8],小鼠參茶給藥劑量分別相當(dāng)于人用藥量的10、20、40倍,每3 g花旗參茶顆粒相當(dāng)于原生藥0.55 g,則分別相當(dāng)于0.275、0.550、1.100 g生藥/kg體重;西洋參飲片成人每日用量為3 g[1],則人用量為0.5 g/kg體重,小鼠給藥劑量相當(dāng)于人用量的10倍,1 g凍干粉相當(dāng)于5 g原生藥,則相當(dāng)于0.500 g生藥/kg體重)。各組小鼠灌胃容積均為20 mL/kg,每天1次,連續(xù)灌胃4周。每周稱量動(dòng)物體重,并根據(jù)體重調(diào)整灌胃劑量。

1.2.3 臟器系數(shù)測(cè)定 連續(xù)灌胃給藥28 d,稱量體重后脫頸椎處死小鼠,取胸腺和脾臟并稱重,計(jì)算臟器質(zhì)量與體重的比值分別作為胸腺系數(shù)和脾臟系數(shù)。

1.2.4 細(xì)胞免疫功能測(cè)定

1.2.4.1 ConA誘導(dǎo)的小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn) 灌胃至28 d,頸椎脫臼處死小鼠,無(wú)菌取脾,制備脾細(xì)胞懸液,用Hank’s液洗2次(1000 r/min,10 min),用完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度為3×106cell/mL,分兩孔(1 mL/孔)加至24孔板中,試驗(yàn)孔加入75 μL ConA液(0.1 mg/mL),對(duì)照孔不作處理。置于CO2培養(yǎng)箱5% CO2、37 ℃培養(yǎng)68 h后,每孔吸去上清0.7 mL,加入RPMI 1640培養(yǎng)液0.7 mL和MTT(5 mg/mL)50 μL,繼續(xù)培養(yǎng)4 h。培養(yǎng)結(jié)束后每孔加入1 mL酸性異丙醇,吹打至紫色結(jié)晶完全溶解后分裝至96孔板中,570 nm處測(cè)定吸光度,以試驗(yàn)孔與對(duì)照孔的吸光度差值表示淋巴細(xì)胞的增殖能力。

1.2.4.2 DNFB誘導(dǎo)的遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng) 灌胃至23 d,每鼠腹部皮膚用硫化鋇飽和水溶液脫毛,范圍約3 cm×3 cm,用50 μL DNFB溶液(10 mg/mL)均勻涂抹腹部皮膚致敏。5 d后,取10 μL DNFB溶液均勻涂抹于小鼠右耳兩面進(jìn)行攻擊。24 h后頸椎脫臼處死小鼠,用打孔器取下直徑8 mm的耳片,稱重后計(jì)算耳腫脹率。

1.2.5 體液免疫功能測(cè)定

1.2.5.1 抗體生成細(xì)胞檢測(cè) 灌胃至28 d,腹腔注射2%綿羊紅細(xì)胞(Sheep red blood cell,SRBC)免疫小鼠,0.2 mL/只。5 d后,無(wú)菌取脾制備脾細(xì)胞懸液,調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106cell/mL。向六孔板中加入含0.5%瓊脂糖的生理鹽水制備底層培養(yǎng)基。將含0.5%瓊脂糖的Hank’s液以0.5 mL/管加至50 ℃的恒溫試管中備用。取50 μL 20% SRBC及200 μL脾細(xì)胞懸液先后加入恒溫試管中,立即混勻,倒入六孔板中,鋪平后放入CO2培養(yǎng)箱中孵育1 h,每孔加入500 μL以完全培養(yǎng)基稀釋11倍的補(bǔ)體,繼續(xù)培養(yǎng)2 h,吸除上層液體,拍照,用Image J軟件統(tǒng)計(jì)每孔溶血空斑數(shù),結(jié)果以空斑數(shù)/106脾細(xì)胞表示[9]。

1.2.5.2 半數(shù)溶血值HC50的測(cè)定 灌胃至28 d,腹腔注射2% SRBC免疫小鼠,0.2 mL/只。4 d后,眼眶取血制備血清,取SA緩沖液稀釋200倍后的血清1 mL于試管內(nèi),依次加入0.5 mL 10%SRBC,1 mL SA液稀釋9倍的補(bǔ)體。對(duì)照管以SA液代替血清。37 ℃恒溫水浴20 min,冰浴終止反應(yīng)。2000 r/min離心10 min,取1 mL上清液,加3 mL都氏試劑,同時(shí)取0.25 mL 10%SRBC加3.75 mL都氏試劑作為半數(shù)溶血對(duì)照管,充分混勻,靜置10 min后,以對(duì)照管作空白,540 nm波長(zhǎng)處,測(cè)定各管吸光度。

1.2.6 單核-巨噬細(xì)胞功能測(cè)定

表1 花旗參茶對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響(g)Table 1 The effects of American Ginseng tea on the body weight of mice(g)

1.2.6.1 碳廓清實(shí)驗(yàn) 灌胃至30 d,從小鼠尾靜脈注入以生理鹽水稀釋4倍的印度墨汁,0.1 mL/10 g體質(zhì)量。墨汁注入后2 min(t1)、10 min(t2),先后從眼內(nèi)眥取血20 μL,立即加至2 mL 0.1% Na2CO3溶液中,混勻。以0.1% Na2CO3溶液作空白,用分光光度計(jì)在600 nm波長(zhǎng)處分別測(cè)得光密度值(OD1、OD2)。頸椎脫臼處死小鼠,取肝臟和脾臟,稱重,以吞噬指數(shù)表示小鼠碳廓清能力[10]。

式中:t1、t2表示墨汁注入時(shí)間,min;OD1、OD2表示在t1、t2時(shí)間點(diǎn)取樣測(cè)得的光密度值

1.2.6.2 腹腔巨噬細(xì)胞吞噬熒光微球?qū)嶒?yàn) 灌胃至24 d時(shí),每只小鼠腹腔注射0.2 mL 2% SRBC以激活小鼠巨噬細(xì)胞,4 d后頸椎脫臼處死小鼠,剪開腹部皮膚暴露腹膜,腹腔注射含5%小牛血清的Hank’s液3 mL/只,輕揉腹部20次,將腹膜剪開一個(gè)小口,吸取2 mL腹腔液經(jīng)200目篩過(guò)濾至試管內(nèi),調(diào)整巨噬細(xì)胞數(shù)為4×105～6×105cell/mL。將稀釋好的細(xì)胞懸液以1 mL/孔加至6孔板中,加入1%BSA預(yù)調(diào)理過(guò)的熒光微球(1×107/板),置于CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育90 min,用預(yù)冷的PBS緩沖液輕輕洗滌2次(1000 r/min,5 min),加入PBS緩沖液0.3 mL,用細(xì)胞刮刮下貼壁細(xì)胞,吹打均勻,經(jīng)200目篩過(guò)濾后用流式細(xì)胞儀檢測(cè),用CytExpert2.0軟件分析統(tǒng)計(jì)未吞噬熒光微球和吞噬不同數(shù)量熒光微球的巨噬細(xì)胞的比例,計(jì)算熒光微球吞噬百分率和吞噬指數(shù)[11]。

1.2.7 NK細(xì)胞活性測(cè)定 灌胃至28 d,脫頸椎處死小鼠,無(wú)菌取脾,制備單細(xì)胞懸液。經(jīng)200目篩過(guò)濾至10 mL離心管中,Hank’s液洗2次(1000 r/min,10 min),棄上清,裂解紅細(xì)胞后加入8 mL Hank’s液,1000 r/min離心10 min,棄上清,用完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為2×107cell/mL。按50∶1的效靶比將靶細(xì)胞(YAC-1細(xì)胞,實(shí)驗(yàn)前24 h傳代)和效應(yīng)細(xì)胞(脾細(xì)胞)各100 μL,加至U型96孔培養(yǎng)板中,靶細(xì)胞自然釋放孔和靶細(xì)胞最大釋放孔中均加入靶細(xì)胞和完全培養(yǎng)液各100 μL;背景空白孔中加入完全培養(yǎng)液200 μL。上述各項(xiàng)均設(shè)三個(gè)復(fù)孔,于37 ℃ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h后,向靶細(xì)胞最大釋放孔中加入20 μL LDH釋放試劑,吹打混勻,繼續(xù)培養(yǎng)1 h。將培養(yǎng)板靜置10 min,每孔吸取100 μL加至平底96孔板中,同時(shí)加入LDH檢測(cè)工作液50 μL,避光反應(yīng)30 min,在酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度(OD)[12]。按下式計(jì)算NK細(xì)胞活性:

NK細(xì)胞活性(%)=(反應(yīng)孔OD值-自然釋放孔OD值)/(最大釋放孔OD值-自然釋放孔OD值)×100

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 花旗參茶對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響

在實(shí)驗(yàn)周期各時(shí)間點(diǎn),花旗參茶低、中、高劑量組及西洋參飲片泡水組小鼠體質(zhì)量與陰性對(duì)照組相比均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。說(shuō)明花旗參茶和西洋參飲片泡水在實(shí)驗(yàn)劑量范圍內(nèi)對(duì)體重均無(wú)顯著影響。具體數(shù)值見表1。

2.2 花旗參茶對(duì)小鼠臟器系數(shù)的影響

胸腺系數(shù)和脾臟系數(shù)反映了免疫器官的發(fā)育情況,間接體現(xiàn)了機(jī)體的免疫水平[13]。由表2可知,給予受試物4周,花旗參茶三個(gè)劑量及參片泡水組小鼠的胸腺系數(shù)在數(shù)值上均有升高趨勢(shì),但與陰性對(duì)照組比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。花旗參茶三個(gè)劑量及參片泡水組小鼠脾臟系數(shù)在數(shù)值上均有升高,其中僅花旗參茶高劑量組與陰性對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。說(shuō)明花旗參茶可以在一定程度上提高脾臟系數(shù)。

表2 花旗參茶對(duì)小鼠臟器系數(shù)的影響Table 2 Effects of American Ginseng tea on the organ coefficient of mice

2.3 花旗參茶對(duì)小鼠細(xì)胞免疫功能的影響

有絲分裂原ConA刺激T淋巴細(xì)胞增殖產(chǎn)生效應(yīng)T細(xì)胞,發(fā)揮細(xì)胞免疫功能[14]。遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)是由效應(yīng)T細(xì)胞介導(dǎo)的以單核細(xì)胞損傷為主的炎癥反應(yīng),炎癥反應(yīng)的強(qiáng)度可間接體現(xiàn)細(xì)胞免疫能力[15]。

花旗參茶三個(gè)劑量組小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖能力均高于陰性對(duì)照組,其中花旗參茶中、高劑量組與陰性對(duì)照組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。西洋參飲片泡水組小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖能力也高于陰性對(duì)照組,但與陰性對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

花旗參茶三個(gè)劑量組小鼠耳腫脹率均高于陰性對(duì)照組,且呈明顯的量效關(guān)系。其中花旗參茶中、高劑量、西洋參飲片泡水組與陰性對(duì)照組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(分別為P<0.05,P<0.01,P<0.05)。具體數(shù)值見表3。

以上結(jié)果表明,花旗參茶可劑量依賴性地提高小鼠細(xì)胞免疫功能,其中參茶中劑量(0.500 g生藥/kg)的作用效果優(yōu)于西洋參飲片泡水(0.550 g生藥/kg)的作用效果,說(shuō)明在同等劑量下,花旗參茶對(duì)細(xì)胞免疫的增強(qiáng)作用優(yōu)于西洋參飲片泡水服用。

表3 花旗參茶對(duì)小鼠細(xì)胞免疫功能的影響Table 3 Effects of American Ginseng tea on cellular immunity of mice

2.4 花旗參茶對(duì)小鼠體液免疫功能的影響

B細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫是機(jī)體特異性免疫的重要組成部分,抗體生成細(xì)胞數(shù)及血清溶血素含量是反應(yīng)機(jī)體體液免疫能力的重要指標(biāo)[16]。由表4可知,所有給藥組的溶血空斑數(shù)均高于陰性對(duì)照組,但只有花旗參茶高劑量和低劑量組的溶血空斑數(shù)與陰性對(duì)照組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(分別P<0.01,P<0.05)。與陰性對(duì)照組相比,僅花旗參茶高劑量組可極顯著提高血清溶血素水平(P<0.01)。說(shuō)明只有高劑量的花旗參茶可以同時(shí)提高抗體生成細(xì)胞數(shù)及血清溶血素含量,具有增強(qiáng)體液免疫的能力。

表4 花旗參茶對(duì)小鼠體液免疫功能的影響Table 4 Effects of American Ginseng tea on the humoral immunity of mice

2.5 花旗參茶對(duì)小鼠單核-巨噬細(xì)胞功能的影響

單核-巨噬細(xì)胞是機(jī)體非特異性免疫防御的重要細(xì)胞,小鼠碳廓清實(shí)驗(yàn)和腹腔巨噬細(xì)胞吞噬熒光微球?qū)嶒?yàn)是測(cè)定小鼠單核-巨噬吞噬功能經(jīng)典實(shí)驗(yàn),其結(jié)果反映了機(jī)體非特異性免疫應(yīng)答的能力[17]。

花旗參茶各劑量組小鼠的碳廓清能力均高于陰性對(duì)照組,其中花旗參茶中劑量組、高劑量組與陰性對(duì)照組比較具有極顯著差異和顯著性差異(分別為P<0.01,P<0.05)。泡水組小鼠的吞噬指數(shù)也高于陰性對(duì)照組,但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

花旗參茶各劑量組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞熒光微球吞噬百分率均高于陰性對(duì)照組,且呈明顯的量效關(guān)系,其中花旗參茶中、高劑量組與陰性對(duì)照組比較差異極顯著(P<0.01)。西洋參飲片泡水組小鼠吞噬百分率也高于陰性對(duì)照組,但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。計(jì)算各組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞熒光微球吞噬指數(shù),與吞噬百分率結(jié)果相似,花旗參茶中、高劑量組與陰性對(duì)照組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(分別為P<0.05,P<0.01)。具體數(shù)值見表5。

以上結(jié)果提示,花旗參茶可通過(guò)增強(qiáng)單核-巨噬細(xì)胞的吞噬功能,提高機(jī)體非特異性免疫力,且在同等劑量下的作用效果優(yōu)于西洋參飲片泡水服用。

2.6 花旗參茶對(duì)小鼠NK細(xì)胞活性的影響

NK細(xì)胞是介導(dǎo)非特異性免疫的主要效應(yīng)細(xì)胞,具有抗原非特異性殺傷能力[14]。由表6可知,給予受試物4周,花旗參茶三個(gè)劑量組及西洋參飲片泡水組小鼠NK細(xì)胞活性在數(shù)值上均高于陰性對(duì)照組,其中僅高劑量組與陰性對(duì)照組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01),表明高劑量的花旗參茶可增強(qiáng)NK細(xì)胞活性。

表5 花旗參茶對(duì)小鼠單核-巨噬細(xì)胞功能的影響Table 5 Effects of American Ginseng tea on the monouclear macrophage function of mice

表6 花旗參茶對(duì)小鼠NK細(xì)胞活性的影響Table 6 Effects of American Ginseng tea on the NK cell activity of mice

2.7 作用機(jī)制分析

采用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)[18](http://tcmspw.com/tcmsp.php)檢索花旗參茶的原料藥西洋參中的活性成分及作用靶點(diǎn),以藥物口服利用度OB≥30%,類藥性DL≥0.18為篩選標(biāo)準(zhǔn),得到9種活性成分,含β-谷甾醇和人參皂苷Rh2等(見表7)。

表7 花旗參茶增強(qiáng)免疫功能的物質(zhì)基礎(chǔ)Table 7 The material basis of American Ginseng tea to enhance immune function

將化合物的作用靶點(diǎn)在Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)[19](https://www. uniprot. org)統(tǒng)一規(guī)范后得到56個(gè)藥物作用靶基因。以“Immunocompromised”和“hypoimmunity”為檢索詞,挖掘GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)[20](https://www. genecards. org)、OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www. omim. org)和DRUGBANK 5.0數(shù)據(jù)庫(kù)[21](https://www. drugbank. ca)疾病相關(guān)靶點(diǎn),共得到免疫力低下相關(guān)靶點(diǎn)1188個(gè),其中藥物-疾病共同靶點(diǎn)20個(gè)。將共有靶點(diǎn)提交至STRING 11.0數(shù)據(jù)庫(kù)[22](https://string-db. org)構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(PPI),利用Cytoscape 3.7.2軟件[23]實(shí)現(xiàn)可視化(見圖1),刪去游離的節(jié)點(diǎn)后,PPI網(wǎng)絡(luò)中共有19個(gè)節(jié)點(diǎn),86條邊,平均節(jié)點(diǎn)連接度為8.6,平均局部聚類系數(shù)為0.74,其中對(duì)網(wǎng)絡(luò)影響最大的基因?yàn)镃ASP3(degree=16)、JUN(degree=16)和TNF(degree=14)。將藥物-疾病共同靶點(diǎn)輸入Metascape平臺(tái)[24](https://metascape.org),以P<0.01,最小計(jì)數(shù)為3,富集因子>1.5為條件,進(jìn)行GO和KEGG功能富集分析,富集顯著性最強(qiáng)的通路如表8所示。西洋參對(duì)機(jī)體免疫力的調(diào)節(jié)作用對(duì)半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性參與凋亡信號(hào)通路的分子功能影響最大,涉及了4個(gè)基因;對(duì)凋亡的生物過(guò)程影響最大,涉及13個(gè)基因;對(duì)細(xì)胞中膜筏相關(guān)組分影響最大,涉及5個(gè)基因;對(duì)IL-17、NOD樣受體信號(hào)通路和細(xì)胞凋亡等信號(hào)通路有顯著影響。通過(guò)Cytoscape 3.7.2構(gòu)建花旗參茶成分-免疫力低下靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò),并利用Network Analyzer分析西洋參調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力的核心成分及核心作用靶點(diǎn)。結(jié)果表明,β-谷甾醇(degree=14,Betweenness Centrality=0.3844,Closeness Centrality=0.5738)和人參皂苷Rh2(degree=8,Betweenness Centrality=0.0476,Closeness Centrality=0.4430)為西洋參調(diào)控免疫功能的關(guān)鍵活性成分;CASP3、TNF、CASP8、NFKBIA和JUN為西洋參增強(qiáng)免疫力的重要靶點(diǎn)(見圖2)。

表8 花旗參茶增強(qiáng)免疫功能的作用機(jī)制Table 8 Mechanism of American Ginseng tea to enhance immune function

圖1 花旗參茶-免疫力低下靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)Fig.1 PPI Network of American Ginseng tea-immunocompromised targets注:節(jié)點(diǎn)大小和顏色亮暗代表節(jié)點(diǎn)連通度, 面積越大、顏色越鮮艷說(shuō)明該節(jié)點(diǎn)越重要。

圖2 花旗參茶成分-免疫力低下靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 Network of Ginseng tea ingredients- immunocompromised targets-pathways注:圓形節(jié)點(diǎn)為花旗參茶的活性成分, 矩形為靶點(diǎn),倒三角為相關(guān)通路;節(jié)點(diǎn)大小 代表節(jié)點(diǎn)連通度,面積越大說(shuō)明該節(jié)點(diǎn)越重要。

3 討論與結(jié)論

目前的研究主要是針對(duì)西洋參成分的藥理作用研究,對(duì)花旗參茶的藥理藥效作用機(jī)制研究較少。據(jù)報(bào)道,西洋參中的皂苷類成分可有效增強(qiáng)雷帕霉素誘導(dǎo)的免疫力低下模型斑馬魚的免疫力[25];西洋參花多糖可增強(qiáng)小鼠巨噬細(xì)胞RAW246.7的免疫活性[26]。本研究從細(xì)胞免疫、體液免疫、單核巨噬細(xì)胞功能及NK細(xì)胞活性等方面全面探究了花旗參茶對(duì)小鼠特異性免疫及非特異性免疫功能的影響,結(jié)果表明,花旗參茶中劑量和高劑量均可顯著增強(qiáng)機(jī)體的脾淋巴細(xì)胞增殖、遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)、碳廓清及腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力,高劑量可極顯著增加抗體生成細(xì)胞數(shù)(P<0.01),低劑量可顯著增加抗體生成細(xì)胞數(shù)(P<0.05),高劑量還可顯著提高脾臟系數(shù)(P<0.05),極顯著提高NK細(xì)胞活性和免疫小鼠體內(nèi)血清溶血素水平(P<0.01),說(shuō)明花旗參茶具有較好的免疫功能增強(qiáng)作用。另外,觀察到西洋參飲片泡水組(與花旗參茶中劑量所含生藥量相近)對(duì)免疫力的增強(qiáng)效果只與花旗參茶低劑量作用效果相當(dāng),說(shuō)明在同等劑量下,其免疫力增強(qiáng)作用優(yōu)于西洋參飲片泡水服用。

利用網(wǎng)路藥理學(xué)技術(shù),通過(guò)數(shù)據(jù)挖掘,對(duì)花旗參茶增強(qiáng)免疫力的作用機(jī)制進(jìn)行了探究。PPI結(jié)果顯示,Caspase家族蛋白相應(yīng)基因中CASP3、CASP8、CASP9和CASP1基因均為PPI網(wǎng)絡(luò)的重要節(jié)點(diǎn)。Caspase8和Caspase9參與細(xì)胞凋亡的起始,Caspase3參與細(xì)胞凋亡的執(zhí)行,炎性的Caspase1不直接參與凋亡信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo),但與自身免疫性疾病有關(guān)[27-28]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果表明,花旗參茶調(diào)節(jié)免疫功能的活性成分為β-谷甾醇和人參皂苷Rh2。研究表明,β-谷甾醇及其糖苷在體內(nèi)外均具有良好的免疫調(diào)節(jié)活性[29],它們可以靶向增殖輔助型T細(xì)胞(Th),促進(jìn)Th1增殖從而促進(jìn)白細(xì)胞介素(IL)-2和干擾素-γ的釋放,而對(duì)Th2的增殖及IL-4的釋放沒(méi)有明顯影響。此外,β-谷甾醇還可改善T淋巴細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞的活性[30-31],降低腫瘤壞死因子(TNF)-α和IL-1β水平發(fā)揮抗炎作用[32]。錢穎等[33]的研究表明人參皂苷Rh2通過(guò)促進(jìn)天然免疫細(xì)胞的分化及免疫效應(yīng)細(xì)胞的增殖,促進(jìn)IL-2和TNF-α等Th1型細(xì)胞因子的分泌,提高放療及甲氨蝶呤誘導(dǎo)免疫低下小鼠的免疫力。研究發(fā)現(xiàn),人參皂苷Rh2對(duì)阿爾茲海默癥和變態(tài)反應(yīng)等炎癥相關(guān)免疫性疾病具有療效[34]。水溶性基團(tuán)修飾人參皂苷Rh2后得到的衍生物Rh2-B2可通過(guò)抑制p38、c-Jun 氨基端激酶和細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白酶的磷酸化及NF-κB通路的傳導(dǎo),抑制促炎因子TNF-α、IL-1β和IL-6的過(guò)表達(dá),改善脂多糖誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞RAW264.7的炎癥反應(yīng)[35]。

綜上,花旗參茶對(duì)小鼠免疫力具有較好的增強(qiáng)作用,本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析發(fā)現(xiàn),β-谷甾醇和人參皂苷Rh2等為花旗參茶調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力的主要藥效物質(zhì)基礎(chǔ),其作用機(jī)制涉及IL-17信號(hào)通路和NOD樣受體信號(hào)通路等炎癥相關(guān)信號(hào)及細(xì)胞凋亡信號(hào)通路,為我們進(jìn)一步闡明花旗參茶的作用機(jī)制提供了新的思路。