液相色譜質譜法測定貝類水產品中氯霉素的不確定度評定

王 婷,王 儒,趙曉野,梁 瓊,張 樂

(海南省食品藥品檢驗所海口分所,海南海口 570311)

氯霉素(chloramphenicol)屬抑菌性廣譜抗生素,由委內瑞拉鏈絲菌產生,主要用于治療動物由傷寒桿菌、流感桿菌、痢疾桿菌、大腸桿菌等引起的感染,是近幾年《國家食品安全監督抽檢實施細則》中規定可食性動物肌肉、肝臟、水產品、禽蛋中需要檢測的獸藥殘留[1]。氯霉素對眼睛有刺激性和腐蝕性,容易引起呼吸道和皮膚過敏,接觸后易出現頭痛、惡心、嘔吐等癥狀[2]。2019年12月27日,中華人民共和國農業農村部發布第250號公告,將氯霉素列入食品動物中禁止使用的藥品及其他化合物清單[3]。氯霉素的檢測方法主要分為微生物法、色譜法、酶聯免疫法[4-10]。其中液相色譜串聯質譜法精確度和靈敏度較高、重現性好、方法檢出限可低至0.1 μg/kg,所以最為常用,為得到更加真實客觀的檢測結果,避免因檢測標準的完善性及實驗人員操作的準確性不足對檢測結果造成影響,提高檢測結果的準確度,需要對檢測過程中可能存在的不確定度進行評估。

本文根據不確定度的不同來源,依據JJG 646-2009《移液器檢定規程》、JJG 196-2006《常用玻璃器具檢定規程》、JJG 10-2005《常用玻璃器具檢定規程》以及《化學分析中不確定度的評估指南》[11-16]運用數學模型,評估分析不同來源的不確定度分量對測量結果的影響,通過對不確定度分量的量化結果,計算出各個分量的標準不確定度,再得到合成標準不確定度及擴展不確定度。評估各個不確定度分量,找出對測量不確定度影響較大的來源,并在實驗過程中加以控制和避免,提高檢側結果的準確性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

貝類 主要為海南島近岸海域,包含海南島東線和西線及南海海域和北部灣海域的方斑東風螺、牡蠣、血螺、櫛孔扇貝、螺魁蚶等,樣品由海口、文昌、澄邁等海鮮市場采購獲得;乙酸乙酯、正己烷 色譜純,德國Meker公司;氫氧化銨、無水硫酸鈉 分析純,廣州化工公司;氯霉素標準物質 貨號為IST9248-100M,濃度為100 μg/mL,擴展不確定度為±5%(K=2),阿爾塔科技有限公司;氯霉素-D5標準物質 貨號為21033XB,濃度為100 μg/mL(±3%),曼哈格生物科技有限公司。

LC-MS-8040液質聯用儀 島津公司;QUINTX224-1CN電子分析天平 賽多利斯貿易有限公司;Multi Reax(EU)渦旋振蕩器 德國Heidolph;3-18K離心機 Sigma公司;TTL-DCII氮吹儀 北京同泰;milli-Q IQ7000超純水機 密理博中國有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品預處理 實驗環境溫度控制在20±5 ℃范圍內,稱取5 g經過攪碎處理的貝類可食用組織,精確至0.01 g。置于50 mL聚丙烯離心管中,加入500 μL內標使用液,濃度為100 ng/mL,加入5 g無水硫酸鈉,0.45 mL氫氧化銨和15 mL 乙酸乙酯,渦旋振蕩10 min,離心5 min(4000 r/min),將上清液轉移至50 mL容量瓶中。在殘渣中再加入15 mL乙酸乙酯,重復上述操作,合并全部上清液至50 mL容量瓶中,用乙酸乙酯定容至刻度。搖勻后用刻度吸管吸取10 mL至另一離心管中,氮吹至干。用2 mL水復溶,加入5 mL正己烷渦旋混合30 s,離心5 min(10000 r/min),取下層溶液,過0.22 μm濾膜后,上機檢測。

1.2.2 氯霉素測定 依據GB/T 20756-2016《可食動物肌肉、肝臟和水產品中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考殘留量的測定液相色譜質譜法》測定樣品中的氯霉素殘留量。

液相色譜條件:色譜柱:Waters C18,1.7 μm,2.1 mm×100 mm;柱溫:40 ℃;流動相:甲醇+水(40+60);流速:0.3 mL/min;進樣量:10 μL。

質譜條件:離子源:ESI;掃描方式:負離子掃描;檢測方式:MRM;離子源溫度:300 ℃。

1.2.3 不確定度來源分析 根據實驗過程分析可知,不確定度來源可以分為以下幾個部分:天平稱取試樣質量m0引入的標準不確定度u(m0);試料溶液中被測物氯霉素的濃度引入的標準不確定度u(cc),主要包括氯霉素標準物質的相對不確定度urel(ucs)、氯霉素標準溶液配制時引入的標準不確定度u1(cc)、用內標校正的氯霉素標準曲線引入的不確定度u2(cc);測定用樣液體積V1引入的標準不確定度u(V1);試樣處理液吸取體積V2引入的標準不確定度u(V2);試樣處理液定容體積V引入的標準不確定度u(V);內標加入體積引入的標準不確定度u(V3);測量結果重復性引入的標準不確定度u(rep);回收率引入的標準不確定度u(Rec)。根據以上不確定度的來源,對各個分量進行量化。根據GB/T 27418-2017測量不確定度評定和表示[27]的規定與公式,按照不確定度引入的來源不同,分別計算各個不確定度分量。

1.2.4 建立數學模型 氯霉素含量計算公式如下:

式中,X-試樣中被測物殘留量,μg/kg;Cs-基質標準工作溶液中被測物的濃度,ng/mL;A-試樣溶液中被測物的色譜峰面積;As-基質標準工作溶液中被測物的色譜峰面積;Ci-試樣溶液中內標物的濃度,ng/mL;Csi-基質標準工作溶液中內標物的濃度,ng/mL;Asi-基質標準工作溶液中內標物的色譜峰面積;Ai-試樣溶液中內標物的色譜峰面積;V-樣液最終定容體積,mL;m-試樣溶液所代表試樣的質量,g。

為分析不確定度的來源,減少變量,將uf1表示為As/Asi的比值;將uf2表示為A/Ai的比值;因前處理存在分取過程,所以將試樣溶液所代表試樣的質量m,按照測定用樣液體積V1與試樣處理液吸取體積V2的稀釋比例轉化為實際樣品的稱樣量為m0單位為克(g)。則上述公式可改寫成:

2 結果與分析

2.1 天平稱取試樣質量m0引入的不確定度u(m0)

2.2 試料溶液中被測物的氯霉素濃度引入的不確定度u(cc)

表1 第一次稀釋過程中容量器具引入的不確定度Table 1 Uncertainty introduced by the volumetric apparatus during the first dilution

表2 第二次稀釋過程中容量器具引入的不確定度Table 2 Uncertainty introduced by the volumetric apparatus during the second dilution

2.2.1 氯霉素標準物質相對標準值的不確定度u(ucs) 氯霉素標準物質濃度為100 μg/mL,證書上標注擴展不確定度為±5%(K=2),氯霉素標準物質的相對標準不確定度為[18-22]:

2.2.2 稀釋過程引入的不確定度u1(cc)

2.2.2.1 第一次稀釋 移取1.00 mL濃度為100 μg/mL的氯霉素標準溶液,用甲醇定容至10.00 mL,得到濃度為10 μg/mL標準儲備液。采用1000 μL移液槍和10.00 mL容量瓶進行稀釋。

表3 第三次稀釋過程中容量器具引入的不確定度Table 3 Uncertainty introduced by the volumetric apparatus during the third dilution

標準溶液第一次稀釋時引入的相對標準不確定度為:

2.2.2.2 第二次稀釋 移取100 μL濃度為10 μg/mL標準儲備液,用甲醇定容至10.00 mL,得到濃度為100 ng/mL標準使用液。采用100 μL移液槍和10.00 mL容量瓶進行稀釋。

標準溶液第二次稀釋時引入的相對標準不確定度為:

2.2.2.3 第三次稀釋 移取1.00 mL濃度為100 ng/mL標準使用液定容至10.00 mL,得到濃度為10 ng/mL標準使用液。采用1000 μL移液槍和10.00 mL容量瓶進行稀釋。

標準溶液第三次稀釋時引入的相對標準不確定度為:

2.2.2.4 第四次稀釋 分別吸取10、50、100 μL濃度為10 ng/mL的標準使用液,定容到1 mL,再分別吸取20、50、100 μL濃度為100 ng/mL標準使用液定容到1 mL。得到系列為0.1、0.5、1、2、5、10 ng/mL的標準曲線。采用100 μL移液槍和1.00 mL容量瓶進行稀釋。

表4 第四次稀釋過程中容量器具引入的不確定度Table 4 Uncertainty introduced by the volumetric apparatus during the fourth dilution

表5 標準曲線的的建立Table 5 Establishment of standard curve

標準溶液第四次稀釋時引入的相對標準不確定度為:

綜合四次稀釋,得到標準溶液稀釋過程引入的相對標準不確定度為

2.2.3 用內標校正的氯霉素標準曲線引入的不確定度u2(c) 在系列為0.1、0.5、1、2、5、10 ng/mL的標準曲線中加入50 μL濃度為100 ng/mL的內標使用液,得到內標上機濃度為5 ng/mL。因使用內標校正,則以待測物峰面積和內標物峰面積的比值為縱坐標,以待測物濃度和內標物濃度比值為為橫坐標,建立標準曲線。

進行工作曲線校準擬合,得到的標準曲線為A=aρ+b,斜率為a=1.01767,截距為b=0.00454660,相關系數r=0.9974327。

根據以上數據求得,s=0.041;所以,工作曲線擬合時引入的標準不確定度u(ρ)=0.25,相對標準不確定度為:urel(ρ)=0.25/1.3552=3.7%。

由于ρ為待測物濃度(Cs)/內標濃度的比值,本實驗中內標濃度保持常數為5 ng·mL-1,則用內標校正的標準曲線引入的待測物濃度的相對標準不確定度為:u2(cc)=urel(ρ)=3.7%

因此,最終得到試料中氯霉素質量濃度的相對標準不確定度為:

2.3 測定用樣液體積V1引入的不確定度u(V1)

樣品前處理中,加入乙酸乙酯進行提取,用50 mL容量瓶定容至刻度。此過程引入的相對不確定度計算如表6所示。

表6 相對標準不確定度urel(V1)Table 6 Relative standard uncertainty u(V1)

表7 相對標準不確定度u(V2)Table 7 Relative standard uncertainty urel(V2)

表8 相對標準不確定度urel(V)Table 8 Relative standard uncertainty u(V)

表9 相對標準不確定度u1(V3)Table 9 Relative standard uncertainty u1(V3)

2.4 試樣處理液吸取體積V2引入的不確定度u(V2)

樣品前處理中,用刻度吸管吸取10 mL提取液進行氮吹,此過程引入的相對不確定度計算如表7所示。

2.5 試樣處理液定容體積V引入的不確定度u(V)

由定容體和V引起的不確定度urel(V)。

2.6 內標加入體積引入的標準不確定度u(V3)

表10 相對標準不確定度u2(V3)Table 10 Relative standard uncertainty u2(V3)

表11 重復性測定結果Table 11 Repeatability test results

內標使用液濃度為100 ng/mL,標準曲線定容體積均為1 mL,標曲中內標加入量為50 μL,樣品溶液中內標加入量為500 μL,樣品經分取定容處理后,標曲和樣品上機濃度均為5 ng/mL。當內標維持在同一濃度水平時,母液配置這一步因稀釋過程產生的不確定度帶來的影響可以忽略不計,只考慮標準曲線中內標加入帶來的不確定度u1(V3)和樣品中內標加入帶來的不確定度u2(V3)。

所以,內標加入體積引入的標準不確定度為:

2.7 測量結果重復性引入的不確定度u(rep)

本實驗室樣品測試通常為2個平行樣品,因此由測量結果重復性引入的相對不確定度為:

2.8 回收率不確定度u(Rec)

表12 回收率結果Table 12 Results of recovery

根據GB/T 20756可食動物肌肉、肝臟和水產品中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考殘留量的測定液相色譜質譜法所示,分別做0.10、0.50、1.00 μg/kg三個水平的加標回收,每個水平做6個重復,回收率計算結果如表12所示。

2.9 合成標準不確定度及擴展不確定度

如表12所示,各個分量的不確定度相對獨立,將表中的相對標準不確定度分量合成,即得:

表13 不確定度分量明細Table 13 Uncertainty component details

urel=(0.0000822+0.0492+0.00402+0.00422+0.00582+0.0182+0.00242+0.00122)-1=0.053

不確定度為:u(X)=13.51×0.053=0.716 μg/kg。

擴展不確定度為:U=K×u(X)=2×0.716=1.43 μg/kg(95%置信概率下,取包含因子K=2)

所以,用液相色譜質譜法測定貝類水產品中氯霉素的含量時,擴展不確定度為1.43 μg/kg,K=2,則樣品中氯霉素含量表示為[24-26]:(13.5±1.5) μg/kg,K=2。

3 結論

綜上所述,依據各個分量的相對標準不確定度,不同來源對不確定度影響從大到小為試料溶液中被測物的氯霉素濃度、內標加入體積、試樣處理液定容積V、試樣處理液吸取V2、測定用樣液體積V1、測量結果重復性、天平稱取試樣質量。為完善該方法檢測貝類水產品中氯霉素含量的質量控制體系,實驗人員在進行檢測的過程中應規范操作,尤其注意標準溶液的配制,標準曲線范圍的選擇;實驗過程中溶液的定量加入應盡可能準確,降低其不確定度的影響,提高結果的準確性和可靠性。