高效液相色譜法測定食品中維生素K1和維生素K2的含量

孔凡華,郭 倩,白沙沙,徐佳佳,李 東,王 竹,張雪松,崔亞娟,*

(1.北京市營養源研究所,北京 100069; 2.中國疾病預防控制中心營養與健康所,北京 100050)

自然界中維生素K主要以維生素K1和維生素K2兩種形式存在。維生素K1廣泛存在于綠色蔬菜和動物內臟中,維生素K2主要由微生物代謝產生,少量存在于肉類發酵性食品中,在納豆中較豐富[1]。根據側鏈上異戊二烯基團數量的不同,維生素K2分為不同的亞型,表示為 n烯甲萘醌(MK-n),四烯甲萘醌(MK-4)、七烯甲萘醌(MK-7)、九烯甲萘醌(MK-9)是常見的類型。近些年的臨床研究發現,維生素K具有重要的生物活性和藥用價值,維生素K1是血液凝固的重要因素,維生素K2具有抗骨質疏松和抗動脈鈣化的健康效應[2-3]。維生素K2的安全性已得到中國食品藥品監督管理局、美國FDA、美國藥品研究所及歐洲議會和歐盟理事會的權威認定。2016年,原國家衛生和計劃生育委員會發布2016年第8號公告《關于海藻酸鈣等食品添加劑新品種的公告》[4],批準維生素K2(發酵法,主要成分為MK-7)為食品營養強化劑新品種,可以用在兒童和孕產婦調制乳粉中。

國內檢測維生素K1的標準方法是《GB 5009.158-2016食品安全國家標準 食品中維生素K1的測定》[5],第一法為高效液相色譜-熒光檢測法,第二法為液相色譜-串聯質譜法,均適用于各類配方食品、植物油、水果和蔬菜中維生素K1的測定,尚未建立食品中維生素 K2檢測的標準方法。文獻報道維生素 K檢測的方法主要有高效液相色譜-紫外檢測法[6-8]、毛細管電泳法[9]、高效液相色譜-質譜法[10-11]等。高效液相色譜-紫外檢測法[12]前處理方法主要有直接萃取法和薄層純化法,直接萃取法容易受到食品基質干擾,導致萃取不完全;薄層純化法前處理復雜,不適于高通量檢測。維生素K2在食物中含量較少,紫外檢測器的選擇性和靈敏度無法滿足食物中維生素K2檢測的需求[13]。毛細管電泳法步驟繁瑣、重現性差,無法滿足批量檢測工作的要求。高效液相色譜-質譜法雖然靈敏度高,但儀器復雜、價格昂貴,不易推廣。

目前,維生素K1的檢測技術比較成熟,國家標準方法[5]和AOAC Official Method 999.15法[14]都是利用維生素K1能被鋅粉還原產生具有熒光的產物氫鯤,用熒光檢測器測定,方法靈敏度高、特異性強。隨著GB14880-2012[15]已經許可來自納豆的維生素 K2(MK-7)作為食品營養強化劑使用且其安全性已得到認定[16],建立食品中維生素K共性檢測技術成為食品行業發展需求。如何精準測定食品中維生素K的含量既是企業、科研機構亟需解決的問題,也是保障公眾健康的基礎。考慮到維生素K1與維生素K2都是萘醌衍生物,被鋅粉還原后可以產生熒光物質,可以嘗試用高效液相色譜-熒光檢測法同時測定維生素K1和維生素K2的含量。因為食品中維生素K含量差異較大,且與脂質共存,對堿比較敏感,所以提取條件是影響實驗結果的關鍵因素。脂肪酶可以有效降解食品中的脂質成分,利于維生素K的提取,并且可以減少提取過程中對維生素K的破壞[17]。Manoury等[18]嘗試采用鹽酸水解方法對奶酪等試樣進行處理,結果表明酸水解和酶解的提取效果相當。正相色譜烷基柱對脂溶性維生素的保留力太強,運行時間過長,所以,反相色譜法在維生素K的檢測中應用更廣泛[19-20]。本研究參考GB 5009.158-2016[5]、AOAC[14]和文獻方法[21],高脂樣品經脂肪酶酶解,異丙醇分散后,用正己烷提取樣品中的維生素K1和K2,高效液相色譜C18柱將維生素K1和K2與其他雜質分離,鋅柱柱后還原,使非熒光化合物維生素K1和K2產生熒光,熒光檢測器檢測,外標法定量,建立食物中維生素K1和維生素K2同時分析檢測技術,以期為食品中維生素K1和K2的檢測、應用和監管提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

配方奶粉、酸奶、納豆凍干粉和雞胗凍干粉 廣東雙駿生物科技有限公司贈送;VK1、MK-4、MK-7、MK-9標準儲備溶液 中國疾病預防控制中心營養與健康所贈送;大豆、納豆、凍干納豆粉、納豆膠囊、青稞苗粉、奶酪、益生菌發酵液、多維?維生素D維生素K片 市購;正己烷 分析純,福晨(天津)化學試劑有限公司;冰醋酸、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀 分析純,天津市科密歐化學試劑有限公司;四氫呋喃、甲醇 色譜純,美國Fisher公司;無水碳酸鉀、氯化鋅 分析純,天津市光復精細化研究所;異丙醇 分析純,北京化工廠;無水乙酸鈉、氫氧化鉀 分析純,北京市通廣精細化工公司;脂肪酶 美國Sigma公司。

BS224S分析天平 德國賽多利斯科學儀器(北京)有限公司;EYELA N-1100旋轉蒸發儀 東京理化株式會社;ZHWY-110X30往復式恒溫水浴搖床 上海智誠分析儀器制造有限公司;安捷倫1260高效液相色譜儀,配熒光檢測器和ChemStation for LC systems(版本序列號:Rev.B.04.03-SP2[105])色譜工作站 美國Agilent公司;Thermo AcclaimTM120 C18色譜柱(150 mm×4.6 mm,5 μm) 美國 Thermo 公司;鋅粉還原柱(50 mm×4.6 mm,填料為鋅粉) 上海安譜實驗科技股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品前處理 準確稱取適量配方奶粉、酸奶、納豆凍干粉、雞胗凍干粉于50 mL離心管中,用溫水溶解,加入pH=8.0的磷酸鹽緩沖液混勻,加入0.2 g脂肪酶,渦旋混勻后于37 ℃恒溫水浴搖床中振蕩2 h,使其充分酶解。酶解完成后冷卻至室溫,加入10 mL異丙醇和1 g碳酸鉀混勻,向混勻后的樣液中加入10 mL正己烷,渦旋提取后離心,轉移上清液至旋轉旋蒸瓶中,重復提取三次,合并上清液至旋轉旋蒸瓶中,旋蒸至干,立即用5 mL甲醇-四氫呋喃(9∶1)溶液定容,過 0.45 μm濾膜后上機測定。

1.2.2 色譜測定條件 色譜柱:Thermo AcclaimTM120 C18色譜柱(150 mm×4.6 mm,5 μm);鋅粉還原柱(50 mm×4.6 mm,填料為鋅粉);柱溫:25 ℃;流動相:甲醇-四氫呋喃(9∶1)溶液(1 L溶液中添加冰醋酸0.3 mL,氯化鋅1.5 g,無水乙酸鈉0.5 g);流速:1 mL/min;激發波長為243 nm,發射波長為430 nm;進樣量:10 μL。

1.2.3 維生素K含量的計算

1.2.3.1 標準曲線的制作 分別取VK1、MK-4、MK-7、MK-9標準儲備液,配制成20、50、100、200、500、1000 μg/L的系列混合標準工作液,搖勻,現用現配。將混合標準系列工作液分別注入高效液相色譜儀中,測定相應的峰面積,以峰面積為縱坐標,以標準系列工作液濃度為橫坐標繪制標準曲線,計算線性回歸方程和相關系數。

1.2.3.2 結果計算 試樣中VK1、MK-4、MK-7、MK-9的含量按下式計算:

式中:X-試樣中VK1、MK-4、MK-7、MK-9的含量,μg/100 g;c-根據標準曲線計算得到的試樣中VK1、MK-4、MK-7、MK-9的濃度,μg/L;m-試樣的稱樣量,g;V-定容液的體積,mL。

1.2.4 方法學驗證 按照《GB/T 27404-2008 實驗室質量控制規范 食品理化檢測》[22]方法學要求,建立校準曲線及校準曲線的工作范圍;逐步稀釋樣品上機測定,R(S/N)=3時的測定濃度作為檢出限,R(S/N)=10時的測定濃度作為定量限;

分別稱取配方奶粉、酸奶、納豆凍干粉和雞胗凍干粉,按照實驗建立的方法,平行測定6次,計算VK1、MK-4、MK-7、MK-9的含量,并計算相對標準偏差;采用樣品加標試驗進行方法準確度驗證,向配方奶粉和酸奶中添加25、50、100 μg/100 g 三個水平VK1、MK-4、MK-7、MK-9標準溶液,向納豆凍干粉中添加4000、8000、16000 μg/100 g三個水平VK1、MK-4、MK-7、MK-9標準溶液,按照實驗建立的方法,測定VK1、MK-4、MK-7、MK-9的含量,每個加標水平平行測定6次,計算回收率及相對標準偏差。

1.2.5 實際樣品的測定 按照實驗方法,對大豆、納豆、凍干納豆粉、納豆膠囊、青稞苗粉、奶酪、益生菌發酵液、多維?維生素D維生素K片8個樣品進行VK1、MK-4、MK-7、MK-9定量測定,所有樣品平行測定3次,結果以均值±標準差表示。

1.3 數據處理

通過與儀器配套的ChemStation for LC systems(版本序列號:Rev.B.04.03-SP2[105])工作站軟件完成數據的采集與處理。

2 結果與分析

2.1 線性關系、檢出限及定量限

將VK1、MK-4、MK-7、MK-9的混合標準工作溶液,按照實驗色譜條件依次進樣,根據濃度與峰面積的關系繪制標準曲線,結果表明,在20～1000 μg/L范圍內,VK1、MK-4、MK-7、MK-9的濃度與峰面積有良好線性關系,結果見表1,VK1、MK-4、MK-7、MK-9標準溶液高效液相色譜圖見圖1。

圖1 VK1、MK-4、MK-7、MK-9標準色譜圖Fig1 HPLC-FLD chromatograms of VK1,MK-4,MK-7,MK-9

檢出限和定量限分別以3倍和10倍信噪比(S/N)計,結果表明,當取樣量為2 g,定容體積為5 mL時,VK1、MK-4、MK-7、MK-9的檢出限分別為0.02、0.01、0.05、0.1 μg/100 g,定量限分別為0.07、0.04、0.2、0.4 μg/100 g。

2.2 精密度實驗

配方奶粉、酸奶稱樣量為2 g,雞胗凍干粉稱樣量為0.5 g,納豆凍干粉稱樣量為0.5 g,并稀釋20倍(取0.5 g納豆凍干粉加水定容至100 mL,超聲10 min后,搖勻,取5 mL),按照實驗方法測定,平行測定6次,計算VK1、MK-4、MK-7、MK-9的含量及相對標準偏差,考察方法的精密度(表2)。結果表明:配方奶粉中VK1、MK-4、MK-7的含量分別是1.0842、1.1440、55.5368 μg/100 g,RSD分別為3.60%、4.08%、1.96%,未檢測到MK-9;酸奶中MK-7的含量是55.9944 μg/100 g,RSD為4.28%,未檢測到其他組分;雞胗凍干粉中MK-4和MK-7的含量分別為80.8396、2.4164 μg/100 g,RSD分別為1.98%和4.01%,未檢測到VK1和MK-9;納豆凍干粉中VK1和MK-7的含量分別9.1165、1063 μg/100 g,RSD分別為4.87%和4.10%,未檢測到MK-4和MK-9。4種樣品中各組分含量的RSD均小于5%,表明方法精密度良好,結果見表2,納豆凍干粉高效液相色譜圖見圖2。

表2 方法精密度結果(n=6)Table 2 Results of precision(n=6)

圖2 納豆凍干粉高效液相色譜圖Fig.2 HPLC-FLD chromatograms of natto freeze-dried

2.3 加標回收率

準確稱取2 g配方奶粉、1 g酸奶、0.5 g納豆凍干粉(取0.5 g納豆凍干粉加水定容至100 mL,超聲10 min后,搖勻,取2.5 mL),進行三水平六平行加標回收實驗(表3),結果顯示,配方奶粉、酸奶和納豆凍干粉中VK1、MK-4、MK-7、MK-9不同水平加標回收率分別為85.0%～107.8%、85.8%～109.6%、85.1%～102.7%,RSD均小于5%,表明方法準確度高,結果見表3。

表3 加標回收率實驗結果(n=6)Table 3 Result of recovery rate of standard addition(n=6)

續表

表4 8種食品中維生素 K 的含量(μg/100 g,n=3)Table 4 Contents of VK in 8 kinds of foods(μg/100 g,n=3)

2.4 實際樣品的測定

選取8種食品樣品按照實驗建立的方法進行測定(表4),結果表明,不同食品中維生素K含量差異較大,大豆中VK1含量是5.30±0.366 μg/100 g,未檢測到其他組分;納豆和凍干納豆粉中含有VK1和MK-7,其中MK-7含量較高,分別為777±27.7和1497±47.1 μg/100 g,未檢測到MK-4和MK-9;納豆膠囊含有四種成分,其中MK-7含量最高,為7020±113 μg/100 g;青稞苗粉含有VK1和MK-4,VK1含量較高,為294±20.2 μg/100 g;奶酪中只檢測到MK-4,含量為0.984±0.00744 μg/100 g;益生菌發酵液中檢測到VK1、MK-4和MK-7,但含量較低,均小于0.5 μg/100 g;多維?維生素D維生素K片中檢測到VK1、MK-4和MK-7,且含量均較高,其中MK-7含量為50092±490 μg/100 g,本文所測樣品中維生素K含量與Peter等[23]、鄧夢雅等[24]、Schurgers等[25]的研究結果相符,結果見表4。

3 討論與結論

本研究建立了食品中維生素K1和維生素K2同時檢測的高效液相色譜-熒光檢測法(HPLC-FLD),結果表明,VK1、MK-4、MK-7、MK-9在20～1000 μg/L范圍與峰面積有良好線性關系;VK1、MK-4、MK-7、MK-9的檢出限分別為0.02、0.01、0.05、0.1 μg/100 g,定量限分別為0.07、0.04、0.2、0.4 μg/100 g。平行測定6次,配方奶粉、酸奶、納豆凍干粉和雞胗凍干粉中VK1、MK-4、MK-7、MK-9含量的相對標準偏差(RSD)均小于5%。進行三水平六平行加標回收實驗,結果顯示,配方奶粉、酸奶和納豆凍干粉中VK1、MK-4、MK-7、MK-9不同水平加標回收率分別為85.0%～107.8%、85.8%～109.6%、85.1%～102.7%,RSD均小于5%。鄒連蓬[17]建立了VK1、MK-4、MK-7三種形式維生素K在線分析技術,加標回收率為84.4%～124.2%,相對標準偏差<6%,鄧夢雅[24]建立了食品中MK-4和MK-7同時檢測技術,回收率為 80.6%～95.5%,本研究建立的檢測方法可以同時分離VK1、MK-4、MK-7、MK-9四種形式的維生素K,且不同食品中各形式維生素K的回收率在85.0%～109.6%之間,表明方法準確度和精密度更高,適用于食品中維生素K1和維生素K2的高通量檢測。